專利名稱：人組織激肽釋放酶elisa試劑盒的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人組織激肽釋放酶融合蛋白，是一種人組織激肽釋放酶含 量檢測的ELISA試劑盒。
背景技術(shù)：
人組織激肽釋放酶(HK1)是一類絲氨酸蛋白酶，能促進低分子激肽原釋放血管 活性肽從而發(fā)揮一系列生物活性作用，命名為KLK1。在人和動物的高血壓、心 血管疾病和腎臟疾病的模型中，均可見到服含量的降低。我們在轉(zhuǎn)基因的動物 模型中發(fā)現(xiàn)HK1具有降低血壓，改善胰島素抵抗，改善腎功能的作用。HK1的 水平在人的心血管疾病及腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展的過程中可能具有重要的預(yù)測價 值。因此，建立HK1含量測定的高效檢測試劑盒在臨床和科研上均有重要的意義。
鑒于HK1在心血管疾病及腎臟疾病中的預(yù)測及治療價值，國外已有KLK1的 含量測定ELISA試劑盒。其采用的方法為競爭ELISA法，所用的抗體為一種多克 隆抗體。因此，其方法復(fù)雜，計算繁瑣，易于產(chǎn)生非特異顯色而導(dǎo)致結(jié)果誤差較 大并且價格昂貴不符合中國國情，而國內(nèi)又無此類的試劑盒。針對上述存在的這 些問題發(fā)明人將釆用了最新的雙抗體夾心ELISA技術(shù)，并加入了生物素-親和素 系統(tǒng)從而簡化了操作過程，提高了特異性及靈敏度。我們利用HK1的多克隆抗體 包被ELISA板，能盡可能多的捕獲到服l的融合蛋白及HK1，生物素化的單克隆 抗體(生物素-HTK)能特異性地識別ELISA板上的HK1的-一段特異性的表位。因 此，我們生產(chǎn)的人組織激肽釋放酶ELISA試劑盒具有靈敏度高，特異性強，操作 簡便的特點，更重要的是更為經(jīng)濟適用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人組織激肽釋放酶含量測定的ELISA試劑盒。實現(xiàn)本發(fā)明技術(shù)方案如下
一種人組織激肽釋放酶含量測定的EUSA試劑盒，其特征在于
a) 該試劑盒采用的方法為雙抗體夾心法；
b) 加入了生物素-親和素放大系統(tǒng)；
C)標準品為原核表達并純化的人組織激肽釋放酶；
d) 其包被抗體為抗人組織激肽釋放酶的多克隆抗體，檢測抗體為其生物素 化的單抗；
e) 靈敏度為0.3ng/ml-500ng/m。
人組織激肽釋放酶含量測定的ELISA試劑盒的方法，其特征在于包括如下 步驟
a) 1: 6400倍稀釋的包被抗體包被ELISA板，并置于4"C孵育24小時；
b) 1XBSA封閉1小時；
c) 倍比稀釋標準品，并分別加入標準品及1:10倍稀釋的樣品，于37"C反 應(yīng)60分鐘；
d) 加入1:800倍稀釋的檢測抗體并于37。C孵育40分鐘；
e) 加入l: 2000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的親和素25分鐘。
f) TMB顯色并讀數(shù)。
特異性人組織激肽釋放酶融合蛋白多克隆抗體包被反應(yīng)板的制備方法，通過
下列步驟制備而成
1)人組織激肽釋放酶融合蛋白的獲得
a.人組織及肽釋放酶融合蛋白(HK-4T1)的原核表達以pcDNA-服為模板， 用特異性引物PCR擴增KLK1目的基因，目的基因克隆于PEGX-4T1原核表達載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細菌。根據(jù)氨芐青霉素抗性提取克隆，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA, 鑒定，得到與目的片段相一致的片段，判為陽性結(jié)果。將目的基因的重組質(zhì)粒 HK/4T1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳及考 馬斯亮藍染色顯示，大約在55KD處有一條濃染的新增蛋白條帶。經(jīng)Western bloting鑒定，能與人組織激肽釋放酶單克隆抗體發(fā)生強陽性反應(yīng)，HK-4T1融 合蛋白具有較強的免疫原性。
b.HK-4T1融合蛋白的大量表達、純化經(jīng)過大量誘導(dǎo)，表達，包涵體純化 得到大量的HK-4T1融合蛋白。
2) 抗服-4T1融合蛋白多克隆抗體的制備將純化的融合蛋白與弗氏完全佐 劑充分乳化后免疫家兔獲得多克隆抗體，經(jīng)親和層析純化作為包被抗體。
3) 用0.05M PH9.6碳酸鹽包被緩沖液將包被抗體稀釋成適宜濃度后，在每個 酶標板的反應(yīng)孔中加入0.1ml， 4"C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用PBST洗3次， 每次3分鐘，然后拍干；得到人組織激肽釋放酶融合蛋白多克隆抗體包被酶標板。
4) 每孔加入200ull。/。BSA-PBS， 4。C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液 洗3次，每次3分鐘，拍干并密封，即得到人組織激肽釋放酶融合蛋白多克隆抗 體包被反應(yīng)板。
這種人組織激肽釋放酶含量檢測的ELISA試劑盒，其特征在于所述試劑盒 由上述特異性抗人組織及肽釋放酶多克隆抗體包被板、標本稀釋液、洗滌液、 標準品、生物素化二抗、酶標親和素、顯色液、終止液構(gòu)成。具體分為(l)洗
滌液含0.1% Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBST); (2)標本稀釋液含BBSA 的磷酸鹽緩沖液(PBS); (3)標準品上述人組織激肽釋放酶融合蛋白 HK-4T1; (4)生物素化二抗生物素標記的人組織及肽釋放酶單克隆抗體；(5)
酶標親和素辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(Str印tavidin/服P); (6)顯色液TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液；(7)終止液2M H 2 SO 4溶液。
本發(fā)明試劑盒具有靈敏度高，特異性強，重復(fù)性好的特點。利用上述表達的
融合蛋白最為標準品，其標準曲線的相關(guān)系數(shù)高達0.99。采用大批量人血漿作為 待測樣本，其中組內(nèi)差異及組間差異均低于10%。


圖1為人組織激肽釋放酶融合蛋白HK-4T1的SDS-PAGE。 圖2為抗HK-4T1重組蛋白多克隆抗體的SDS-PAGE。 圖3為人組織激肽釋放酶融合蛋白的Western bloting。 圖4為抗HK-4T1重組蛋白多克隆抗體的Western bloting。 圖5為該ELISA試劑盒的標準曲線。
具體實施例方式
以下實例用來說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。 實施例1
人組織激肽釋放酶ELISA試劑盒的制備 l.試劑
(1) 包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液) Na2C0 3 1.59克
NaHCO 3 2.93克 加蒸餾水至1000ml;
(2) 洗滌緩沖液(PH7.4PBS): 0.15M KH2P04 0.2克 Na2HP0 4-12H20 2.9克 NaCl 8.0克KC1 0.2克
Tween-20 0.1% 0.5ml加蒸餾水至1000ml;
(3)標本稀釋液
牛血清白蛋白(BSA)O.l克加洗滌緩沖液至100ml;
(勺標準品
人組織激肽釋放酶融合蛋白，為本實驗時自產(chǎn)；
(5) 生物素化二抗
生物素標記的抗人組織激肽釋放酶單克隆抗體，為本實驗室自產(chǎn)；(6酶標親和素
HRP標記鏈霉親和素，為武漢博士德生物有限公司生產(chǎn)；
(7) 終止液(2M H2S04):
蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98X)21.7ml。
(8) 底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸)0.2M Na 2 HPO 4 (28.4克/ L) 25.7ml0.1M檸檬酸(19.2克/ L) 24.3ml加蒸餾水50ml。
(6) TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液TMB(10mg / 5ml無水乙醇)0.5ml底物緩沖液(PH5.5) 10ml0.75%H2O2 32pl
2.主要儀器
(1) 酶標儀ELX800 Universal Microplate reader
(2) EUSA反應(yīng)板Corning incorporated costar R 96 Well EIA/RIA plate3.方法
酶標親和素抗最適濃度的選擇
(1) 用100ng/ml生物素化二抗進行包被，洗滌。
(2) 將酶標親和素用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中，保溫、洗滌。
(3) 加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取吸光度(A)，取A值在1.0的酶標親和素稀釋度，作為酶標親和素的最適滴度為1: 2000。
生物素化二抗最佳濃度的選擇
(1) 用100ng/ml人組織及肽釋放酶融合蛋白進行包被，洗滌。
(2) 將生物素化二抗用稀釋液作一系列稀釋后分別加入己包被的孔中，保溫、洗滌。
(3) 加入最適滴度稀釋的酶標親和素，保溫，洗滌。
(4) 加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取吸光度(A)，取A值在1.0的生物素化二抗稀釋度，作為生物素化二抗的最適滴度為1: 500。
棋盤滴定法選擇包被抗體最適滴度
(1) 用包被液將包被抗體作一系列稀釋后進行包被，洗滌。
(2) 將人組織及肽釋放酶融合蛋白配比稀釋作為標準品，人血漿樣本倍比稀釋作為陽性對照，樣本稀釋液作為陰性對照，加樣，保溫，洗滌。
(3) 加入最適滴度稀釋的生物素化二抗，保溫，洗滌。
(4) 加入最適滴度稀釋的酶標親和素，保溫，洗滌。
(5) 加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取吸光度(A)。
(6) 選擇陽性對照的A值為0. 8-1. 0間，陰性對照的A值小于0. 1的包被抗體的稀釋度作為最適包被濃度，其稀釋滴度為1:3200;血漿樣本最佳稀釋度為1:10;標準曲線的檢測范圍為7-1000ng/ml。試劑盒的構(gòu)成
所述試劑盒有抗人組織及肽釋放酶融合蛋白包被酶標反應(yīng)板、標本稀釋液、生物素化二抗、酶標親和素、顯色液、終止液構(gòu)成，具體組分為.-
(1) 洗滌液含0.1。/。Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBST);
(2) 標本稀釋液含1%BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS);
(3) 標準品上述人組織激肽釋放酶融合蛋白HK-4T1;
(4) 生物素化二抗生物素標記的人組織及肽釋放酶單克隆抗體；
(5) 酶標親和素辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(Str印tavidin/HRP);
(6) 顯色液TMB-H202系統(tǒng)；
(7) 終止液2M H2S0 4溶液。
利用上述試劑盒采用ELISA法檢測血漿中人組織及肽釋放酶的含量
(1) 待測血漿，加入1: 10稀釋的待測血槳到包被好的酶標反應(yīng)板，100u1/孔，37"C孵育1小時，洗板3次；
(2) 加生物素化二抗，加入l: 500稀釋的生物素化二抗，100ul/孔，37。C孵育40分鐘，洗板3次；
(3) 加酶標親和素，加入1:2000稀釋的酶標親和素，馳l/孔,37'C孵育25
分鐘，洗板3次；
(4) 顯色，洗板后加入TMB-H202系統(tǒng)底物100ul，室溫反應(yīng)10分鐘；
(5) 每孔加入2MH2S0450ul，終止反應(yīng)；
(6) 結(jié)果判斷，空白調(diào)零，讀取450nm波長處吸光度，即OD450值；
(7) 計算結(jié)果，根據(jù)標準曲線計算出血漿中人組織及肽釋放酶的含量。實施例2
與國外試劑盒的比較
國外試劑盒的靈敏度范圍為0. 4ng/ml-25ng/ml;本試劑盒的靈敏度為0.3ng/ml-500ng/ml，其檢測范圍高于國外試劑盒。國外試劑盒采用的方法是間接競爭ELISA法，其計算繁瑣，而本試劑盒采用的方法是雙抗體夾心法，計算更為直觀簡便。
實施例3
利用此試劑盒檢測了 124例正常人的血漿中HK1的含量，每組做三個復(fù)孔，間隔6個月后再重復(fù)一次。其組內(nèi)差異為1.7%，組間差異為8%。正常人的HK1的血漿含量為252 ±93ng/ml。
權(quán)利要求
1.一種人組織激肽釋放酶含量測定的ELISA試劑盒，其特征在于a)該試劑盒采用的方法為雙抗體夾心法；b)加入了生物素-親和素放大系統(tǒng)；c)標準品為原核表達并純化的人組織激肽釋放酶；d)其包被抗體為抗人組織激肽釋放酶的多克隆抗體，檢測抗體為其生物素化的單抗；e)靈敏度為0.3ng/ml-500ng/ml。
2. —種制備權(quán)利要求1所述的人組織激肽釋放酶含量測定的ELISA試劑盒 的方法，其特征在于包括如下步驟a) 1: 6400倍稀釋的包被抗體包被ELISA板，并置于4"C孵育24小時；b) 1XBSA封閉1小時；c) 倍比稀釋標準品，并分別加入標準品及1:10倍稀釋的樣品，于37"C反 應(yīng)60分鐘；d) 加入1:800倍稀釋的檢測抗體并于37"C孵育40分鐘；e) 加入l: 2000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的親和素25分鐘。f) TMB顯色并讀數(shù)。
全文摘要
人組織激肽釋放酶ELISA試劑盒的制備，實現(xiàn)本發(fā)明技術(shù)方案如下一種人組織激肽釋放酶含量測定的ELISA試劑盒，其特征在于a)該試劑盒采用的方法為雙抗體夾心法；b)加入了生物素-親和素放大系統(tǒng)；c)標準品為原核表達并純化的人組織激肽釋放酶；d)其包被抗體為抗人組織激肽釋放酶的多克隆抗體，檢測抗體為其生物素化的單抗；e)靈敏度為0.3ng/ml-500ng/ml。本發(fā)明試劑盒具有靈敏度高，特異性強，重復(fù)性好的特點。利用上述表達的融合蛋白最為標準品，其標準曲線的相關(guān)系數(shù)高達0.99。采用大批量人血漿作為待測樣本，其中組內(nèi)差異及組間差異均低于10％。
文檔編號G01N33/577GK101672851SQ200910063379
公開日2010年3月17日 申請日期2009年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者琴 張, 汪道文 申請人:華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院