專利名稱：多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物芯片領(lǐng)域，具體涉及一種多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液 相芯片及其制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤標(biāo)志物是指由腫瘤組織產(chǎn)生的存在于腫瘤組織本身或分泌至血液及其 他體液中，或因腫瘤細(xì)胞刺激而由宿主細(xì)胞產(chǎn)生且含量明顯異常的一大類物質(zhì)。 腫瘤標(biāo)志物在腫瘤的臨床診斷和治療中占有重要地位，通過對血液或體液中腫 瘤標(biāo)志物存在或含量的檢測，不僅可用于腫瘤的普査、早期診斷、輔助診斷、 良惡性鑒別和臨床分期，同時(shí)對監(jiān)測療效、判斷預(yù)后、預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移 也具有重要價(jià)值。臨床上應(yīng)用最為普遍的腫瘤標(biāo)志物有以下幾種
甲胎蛋白(AFP) 是電泳遷移率相當(dāng)于甲種(cn)球蛋白的一種糖蛋白， 主要在胎兒肝中合成，分子量6.9萬，在胎兒13周AFP占血漿蛋白總量的1/3。 在妊娠30周達(dá)最高峰，以后逐漸下降，正常情況下，這種蛋白主要來自胚胎 的肝細(xì)胞，胎兒出生約兩周后甲胎蛋白從血液中消失，因此正常人血清中甲 胎蛋白的含量尚不到20微克/升。但當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，卻又恢復(fù)了產(chǎn)生 這種蛋白質(zhì)的功能，而且隨著病情的惡化，它在血清中的含量會急劇增加， 甲胎蛋白就成了診斷原發(fā)性肝癌的一個(gè)特異性臨床指標(biāo)。
癌胚抗原(CEA)最初發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌和胎兒腸組織中，故名癌胚抗原。 CEA升高常見于大腸癌、胰腺癌、胃癌、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、甲狀腺髓樣癌等。97X的健康成人血清CEA濃度在2.5ng/ml以下。原發(fā)性結(jié)腸癌患者CEA 增高占45 80%。除原發(fā)性結(jié)腸癌以外，腺胰癌、膽管癌、胃癌、食道癌、 腺癌、肺癌、乳腺癌和泌尿系統(tǒng)的腫瘤陽性率也很高， 一般在50 70%。
CA125 1983年由Bast等從上皮性卵巢癌抗原檢測出可被單克隆抗體 0C125結(jié)合的一種糖蛋白。正常人血清CA125中的(RIA)陽性臨界值為 35kU/L。 95%的健康成年婦女CA125的水平《35U/ml。
CA153 —種分子量約40萬的糖蛋白，是1982年和1984年陸續(xù)使用了 兩個(gè)單克隆抗體(115D8、 DF3)而被發(fā)現(xiàn)的，故被兩種抗體所識別的癌抗原 就稱為CA153,正常人血清上限為30U/ml。有報(bào)道指出，CA15-3水平超過 30U/ml、 40U/ml和50U/ml時(shí)，判斷乳腺癌患者存在、術(shù)后局部區(qū)域復(fù)發(fā)或 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其敏感性均超過90%，特異性分別為95%、 99%和100%，正 確判斷率分別達(dá)到56%、 83%和100%。
CA19-9是SW-1116人結(jié)腸癌抗原在在小鼠中制成的單克隆抗體19-9所識 別的抗原。人血清CA19-9的上限為37000U/L (國外)或30000 U/L (國內(nèi))， 消化系癌腫患者CA19-9明顯增高，如胰腺癌、肝膽系癌、胃癌和結(jié)腸癌分別為 正常均值(9400 U/L)的683、 535、 279和115倍，陽性率分別為72. 1%、 66. 7%、 61.9%和19.0%，以胰腺癌為最高，故CA19-9被認(rèn)為是對胰腺癌較好的標(biāo)志。
CA242是一種粘蛋白型糖抗原，可作為胰腺癌和結(jié)腸癌校好的腫瘤標(biāo)志 物，其靈敏度與CA19-9相仿，但特異性、診斷效率則優(yōu)于CA19-9。 CA242正 常值〈10IU/ml。
前列腺特異性抗原(Prostatespecific antigen, PSA) 是由前列腺 上皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種大分子糖蛋白，具有極高的組織器官特異性。PSA在血 清中主要有兩種存在形式 一種是游離型的PSA (F-PSA),約占血清PSA總濃度的10 30%。另一種是與a i-抗糜蛋白酶(ACT)結(jié)合的PSA(PSA-ACT), 約占血清PSA總濃度的70 90%。對于健康男性，釋放入血中的PSA濃度很 低(<4ng/ml)。但是，在前列腺癌病人血清中，PSA會同現(xiàn)另外的組合形 式，比如PSA與蛋白C抑制劑的組合等。PSA作為前列腺癌的特異性標(biāo)志物， 對前腺癌的診斷特異性達(dá)90 97%，被認(rèn)為是最有價(jià)值的前列癌的腫瘤標(biāo) 志物，被廣泛應(yīng)用于前列腺癌的篩選、診斷及治療后的監(jiān)測。
P-HCG是一種存在于胎盤中的糖蛋白激素，當(dāng)懷孕時(shí)血與尿中水平上 升，正常血中只含微量。由于60%以上的非精原細(xì)胞瘤患者體內(nèi)HCG上升， 所以HCG的測定可監(jiān)視非精原細(xì)胞瘤的治療反應(yīng)及復(fù)發(fā)狀況。對于婦科 惡性腫瘤，除了測定完整的HCG、游離的P亞單位外，還可以測定尿與血 中的促性腺激素的片段，稱之為P-core。聯(lián)合測定尿中P-core與血中 CA125可對臨床卵巢癌診斷提供有意義的信息。
臨床上為了避免單一腫瘤標(biāo)志物在檢測中的陽性率不高、特異性不強(qiáng)等問 題，常采用多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測，應(yīng)用多變量分析的方法來提高腫瘤診斷 的陽性率和特異性。目前常用的血清腫瘤標(biāo)志物檢測方法有放射免疫分析、酶 聯(lián)免疫分析以及化學(xué)發(fā)光免疫測定等，這些方法都有一個(gè)共同的局限性，即每 次僅能檢測一種腫瘤標(biāo)志物。近年來，熒光微球流式細(xì)胞試(MFCA)亦稱液相芯 片(liquichip)在核酸或蛋白質(zhì)多指標(biāo)聯(lián)合檢測中顯示出巨大優(yōu)勢。液相芯片是 基于美國LumiFleX公司xMAP技術(shù)的新型生物芯片技術(shù)平臺，它是在不同熒光編 碼的微球上進(jìn)行抗原-抗體、酶-底物、配體-受體的結(jié)合反應(yīng)及核酸雜交反應(yīng)， 通過紅、綠兩束激光分別檢測微球編碼和報(bào)告熒光信號來達(dá)到定性和定量的目 的， 一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多達(dá)100種不同的生物學(xué)反應(yīng)，是一種新一代高通量 分子診斷技術(shù)平臺。與其它免疫分析方法相比，液相芯片技術(shù)除了具有快速、靈敏、靈活、檢測范圍廣等顯著特點(diǎn)，其最突出優(yōu)勢還在于可以同時(shí)對同一樣 本中多種不同的目的分子進(jìn)行定性和定量分析。
但是，現(xiàn)有的多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合液相芯片種的各組成份只能單獨(dú)存放，只
有在檢測時(shí)才能混合在一起。如中國專利文獻(xiàn)CN1766615A公開了一種大腸癌蛋 白標(biāo)記物平行檢測液相芯片，CN101216491A公開了一種結(jié)核分枝桿菌快速檢測 液相芯片，在這類聯(lián)合檢測芯片中，各種耦聯(lián)微球及檢測抗體只能單獨(dú)存放， 只有在用時(shí)才可以混合到一塊進(jìn)行聯(lián)合檢測，這種弊端給儲存、運(yùn)輸及操作使 用等環(huán)節(jié)帶來不少麻煩，不利于聯(lián)合檢測液相芯片的商品化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種保質(zhì)期長、操作簡便、快速，樣本用 量少的多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片，并給出了其制備方法。 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片，主要包括下列成分
① 耦聯(lián)捕獲抗體的微球含有分別耦聯(lián)了 AFP捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CEA 捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CA125捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CA153捕獲抗體的微 球、耦聯(lián)了 CA19-9捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CA242捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CA72-4捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 PSA捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 HGH捕獲抗體的 微球、耦聯(lián)了beta-HCG捕獲抗體的微球中的至少兩種，耦聯(lián)不同捕獲抗體的微 球則具有不同的顏色編碼，即每種耦聯(lián)微球都有對應(yīng)的顏色編碼；
② 生物素標(biāo)記的檢測抗體分別以生物素標(biāo)記的AFP、 CEA、 CA125、 CA153、 CA19-9、 CA242、 CA72-4、 PSA、 HGH、 beta-HCG的檢測抗體中的至少兩種，且與 上述捕獲抗體相對應(yīng)；
③ 鏈親和素藻紅蛋白；以及
④ 溶質(zhì)含量為1 10wtt的不含蛋白成分的植物性水溶膠或多聚糖水溶膠。 上述多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片的制備方法，包括以下步驟(1) 水溶膠的提純、配制
選取或制備植物膠，去除所含蛋白成分及雜質(zhì)，滅菌，調(diào)節(jié)至一定濃度，備
用；
(2) 捕獲抗體與微球耦聯(lián)
① 微球活化、修飾取熒光編碼的微球原液渦漩分散10 30s，移取5014 以^8000g離心2 4分鐘，移去上清液；加入80 120Pl水，渦旋10 30s， ^8000g離心2 4分鐘，移去上清液，重復(fù)加水洗滌1 2次；向洗滌過的微球 中加入60 100W 0. lmol/L PH5. 0的PBS，渦旋10 30s后，再加入10 15l^l 50mg/ml sulfo-NHS水溶液，渦旋10 30s，隨后加入10 15^1 50mg/ml EDC 水溶液，渦旋10 30s后，36 38。C下避光孵育20 30分鐘，>8000g、離心2 3分鐘，移去上清液;加入200 30(H4 10O腿ol/L、 pH6. 3 MES，渦旋10 30s， 》8000g離心2 4分鐘，移去上清液，如此重復(fù)洗滌1 2次；
② 活化捕獲抗體預(yù)先去除待耦聯(lián)的捕獲抗體中所含的氨基小分子及其它 雜蛋白，再以0.05mol/L、 p朋.3 MES稀釋至40ug/ml，備用；
③ 耦聯(lián)向已活化的微球中加入450 550W相對應(yīng)的捕獲抗體,渦旋10 30s， 36 38。C下避光孵育l. 5 3小時(shí)；
④ 封閉位點(diǎn)向孵育后的溶液中加入l 2ml PBS-BN，渦旋10 30s，》8000g 離心2 4分鐘，棄上清液；再加入0.5 lml PBS-BN，渦旋10 30s，》8000g 離心2 4分鐘，棄上清液；
⑤ 調(diào)節(jié)濃度上步所得耦聯(lián)微球重懸于PBS-BN或水溶膠中，渦旋10 30s， 計(jì)數(shù)微球濃度；
(3) 生物素標(biāo)記抗體的制備
① 檢測抗體預(yù)處理對含疊氮鈉、Tris、甘氨酸等含氨基或其它小分子雜質(zhì) 的檢測抗體，用0.01M、 pH7. 4 PBS充分透析；對含有牛血清白蛋白及其它大分 子雜質(zhì)的檢測抗體進(jìn)行純化分離；
② 抗體濃度標(biāo)定標(biāo)定測定檢測抗體的濃度后，以0. OIM、 pH7. 4 PBS將抗 體濃度調(diào)節(jié)至2mg/ml;③生物素標(biāo)記抗體取預(yù)處理過的檢測抗體加入25^1的2mg/ml NHS-Biotin DMS0溶液，混勻，2 8。C下避光反應(yīng)1. 5 3小時(shí)；
透析以0.01M、 pH7.0 PBS對生物素標(biāo)記的抗體進(jìn)行透析，去除游離的 生物素，并標(biāo)定生物素標(biāo)記的抗體的濃度；
(4)制劑
將所需要的各種耦聯(lián)微球混合，并以植物性水溶膠或多聚糖水溶膠調(diào)節(jié)微球 濃度，分散混勻，使每種耦聯(lián)微球的濃度為2XK)3 4X103個(gè)/ml，溶膠質(zhì)含量 為1 10wt。；，置2 8'C下避光保存；或?qū)⑺璧母鞣N耦聯(lián)微球按一定比例混 合，并加入種類及數(shù)量均對應(yīng)的生物素標(biāo)記抗體，以及對應(yīng)數(shù)量的鏈親和素藻 紅蛋白，再加植物性水溶膠或多聚糖水溶膠調(diào)節(jié)微球濃度，分散混勻后，使每 種耦聯(lián)微球的濃度為lX103 2Xl()3個(gè)/ml，溶膠質(zhì)含量為l 10wt%。，于2 8 'C下避光保存。
所述植物性水溶膠為不含蛋白成分的魔芋膠、香豆膠、白及膠、毛膠薯蕷多 糖膠、阿拉伯膠、果膠、田菁膠、黃蓍膠、剌梧桐膠、羅望子膠、卡拉膠、瓜 爾豆膠、刺槐豆膠、亞麻籽膠、精制海藻膠中的至少一種。植物性水溶膠是指 以植物滲出液、種子、果皮和莖等組織器官為原料制取獲得的不含蛋白分子的 膠體，其作為本發(fā)明液相聯(lián)合檢測芯片中重要組成部分，具有乳化穩(wěn)定、懸浮 分散等功能。
所述多聚糖水溶膠是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖 等單糖及其相應(yīng)的糖醛酸中的一種或幾種按一定比例組成的多糖水溶液(參見 王宗訓(xùn)《中國資源植物利用手冊》.北京中國科學(xué)技術(shù)出版社.1989)。
所述白及膠的制備方法如下
精選白及原料，以1: 10 30的體積比加40 6(TC的熱水浸提白及數(shù)次， 每次浸提4 8小時(shí)，直至白及體積皺縮時(shí)為止，合并各次提取液，真空或減壓 濃縮至溶質(zhì)含量為l 10wt%，過濾、滅菌后備用。
所述精制海藻膠的制備方法如下取CP級以上的海藻膠，加水浸泡6 10小時(shí)，使其充分溶解后，以EK型 濾板過濾除雜，調(diào)節(jié)濃度至溶質(zhì)含量為l 10vrt%，滅菌后備用，且在制備過程 中，避免二價(jià)離子的引入。
本發(fā)明具有積極有益的效果
1. 本發(fā)明采用液相芯片技術(shù)，取其高通量、高精確、特異性強(qiáng)等優(yōu)越性， 可以一次微量取血即精確測定多種腫瘤標(biāo)志物，同時(shí)在完全相同的實(shí)驗(yàn)條件下 綜合分析多種相關(guān)標(biāo)志物的變化，這對腫瘤的早期診斷極為重要，且更適用于 易感人群的大規(guī)模普査。
2. 性能穩(wěn)定、分散性好，保質(zhì)期長應(yīng)用本發(fā)明液相芯片檢測，批內(nèi)和批 間的CV值均小于6%，相對于ELISA法(批內(nèi)CV小于10%，批間CV要求小于15%), 本發(fā)明的結(jié)果更穩(wěn)定、可靠；將懸浮有包被檢測抗體的微球的液相分散體系(植 物性水溶膠或多聚糖水溶液)以3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分別準(zhǔn)確移取相同體 積上、中、下層液體，置于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)微球體，發(fā)現(xiàn)分散于各層溶液中 的微球數(shù)量無明顯差異，這表明本發(fā)明的微球分散保存體系分散性能良好；取 在2 8'C的條件下保存1 2年的懸浮有包被抗體的微球液相分散體系，準(zhǔn)確、 定量地移取不同層次的液體，并以新制備的芯片體系為對照，顯微鏡下觀察計(jì) 數(shù)，未發(fā)現(xiàn)微球數(shù)量有明顯的變化，這表明本發(fā)明分散體系性能穩(wěn)定、保質(zhì)期 長。
3. 操作簡便，快速，樣本用量少該聯(lián)合檢測液體芯片的使用操作過程十 分簡便、快速，只需一步加入少量的血清樣本(20W)，置37r下孵育30分鐘 左右，即可上機(jī)讀數(shù)，整個(gè)過程無需洗滌。
4. 靈敏度高、線性范圍寬本聯(lián)合檢測液相芯片檢測極限可低至10pg;以 癌胚抗原的檢測為例，該芯片能檢測的上限為800ng，是ELISA法的10倍。5.聯(lián)合檢測，費(fèi)用低廉本液相芯片最多一次可對十個(gè)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢 測，而費(fèi)用僅為常規(guī)方法費(fèi)用總和的1/4。


圖1為標(biāo)準(zhǔn)抗原CA153濃度與MFI間的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l一種多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片，主要包括
① 耦聯(lián)捕獲抗體的微球包括耦聯(lián)了 AFP捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CEA捕獲 抗體的微球、耦聯(lián)了 CA125捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CA153捕獲抗體的微球、 耦聯(lián)了 CA19-9捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CA242捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CA72-4 捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 PSA捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 HGH捕獲抗體的微球、 耦聯(lián)了 beta-HCG捕獲抗體的微球，耦聯(lián)不同抗體的微球分別對應(yīng)著不同的顏色 編碼；
② 生物素標(biāo)記的檢測抗體分以生物素別標(biāo)記的AFP、 CEA、 CA125、 CA153、 CA19-9、 CA242、 CA72-4、 PSA、 HGH、 beta-HCG的檢測抗體；
③ 鏈親和素藻紅蛋白；以及
④ 溶質(zhì)含量為3 6wtt的白及膠溶液。 所述腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片的制備方法
1) 主要儀器及用具
①Luminex100設(shè)備；②Luminex100羧化微球；③多重篩選MABVN 1. 2-ram 慮孔板；④水平旋轉(zhuǎn)的微離心機(jī)；⑤水浴性超聲設(shè)備；⑥透析頂針；⑦渦旋器； ⑧黑色微滴度板；⑨血液振蕩器；⑩Coulter細(xì)胞計(jì)數(shù)儀；Q)數(shù)字移液器； 滴度微管等。
2) 主要試劑及試液
①sulfo-NHS， 4-C下干燥儲藏，50mg/ml sulfo-NHS水溶液(新配制)；② EDC (鹽酸碳化二亞胺)，-20。C下干燥儲藏，50mg/ml EDC水溶液(新配制)；③ 0. lmol/L、 pH5. 0 PBS:取81. 5ml 0. 2mol/L NaH2P04、 18. 5ml 0. 2mol/L Na2HP04、100ml去離子水混勻；④0. OIM、 pH7. 4 PBS:取9. 75ml 0. 2mol/L NaH2P04、 40. 5ml 0.2mol/L Na2HP04，混勻，以水定容至1000ml;⑤0. 05mol/L、 pH6. 3 MES:稱 取0. 976g MES，加80ml水溶解，用6N NaOH調(diào)pH至5. 0，定容至100ml; 0. OIM、 pH7. 0 PBS:取9. 75ml 0. 2mol/L NaH2P04、 40.5ml 0. 2mol/L Na2HP04，混勻，再 加入9gNaCl，以水定容至1000ml;⑦lmg/ml生物素DMSO溶液精確稱取4mg NHS-Biotin，用DMSO溶解至3mg/ml，用前現(xiàn)配；⑧PBS-BN:取O. l牛血清白蛋 白(BSA)、 20ulTween-20、 50mg疊氮化鈉，溶于100ml 0. OIM、 pH7. 4 PBS;⑨ 鏈霉親和素R-燥紅蛋白(SA-PE);⑩聚苯乙烯熒光微球由美國Luminex公司提 供；AFP抗體/抗原、CEA抗體/抗原、CA125抗體/抗原由Medix公司提供，CA153 抗體/抗原、CA19-9抗體由biodesign公司提供，CA19-9抗原、CA242抗體/抗 原、CA72-4抗體/抗原、PSA抗體、HGH抗體/抗原、beta-HCG抗體/抗原由 Fitzgerald公司提供。所有的試劑使用前均平衡至室溫。 主要制備步驟如下
(1) 水溶膠的提純、配制
白及膠精選白及，以l: 20的體積比加40 6(TC的熱水浸提白及數(shù)次， 每次浸提6小時(shí)，直至白及體積皺縮時(shí)為止，合并各次提取液，減壓濃縮至溶 質(zhì)含量為5 10wty。，過濾、滅菌后備用；
(2) 捕獲抗體與微球耦聯(lián)
① 微球活化、修飾取熒光編碼的微球原液(1. 25X 107個(gè)/ml)漩渦混旋儀 混懸20s，移取5014 (相當(dāng)于6.25X10'5個(gè)熒光編碼的微球)于1. 5ml聚丙烯離 心管中，10000g離心2分鐘，移去上清液，加入lOOW去離子水，渦旋20s， 10000g離心2分鐘，移去上清液，如此洗滌兩次；向洗滌后的微球中加入8(H4 0. lmol/L pH5. 0的PBS，渦旋20s后，再加入10W 50mg/ml sulfo-NHS水溶液， 渦旋20s，隨后加入10W 50mg/ml EDC水溶液，渦旋20s后，37'C下避光孵育 20分鐘，10000g、離心2分鐘，移去上清液；加入2501^1 100咖ol/L、 pH6. 3 MES， 渦旋20s， 10000g離心2分鐘，移去上清液，如此重復(fù)洗滌一次；
② 活化捕獲抗體將各種捕獲抗體(AFP抗體、CEA抗體、CA125抗體、CA153抗體、CA19-9抗體、CA242抗體、CA72-4抗體、PSA抗體、HGH抗體、beta-HCG) 預(yù)先去除含氨基小分子和雜蛋白，再以0.05mol/L、 pH6.3MES稀釋至40Pg/ml，
③ 耦聯(lián) 向已活化的微球中加入50(Hil對應(yīng)的捕獲抗體，渦旋20s， 37°C 下避光孵育2小時(shí)；
④ 封閉位點(diǎn)向上步反應(yīng)后的溶液中加入lml PBS-BN，渦旋20s， 10000g 離心2分鐘，移去上清液；再加入0.5ml PBS-BN，渦旋20s， 10000g離心2分 鐘，移去上清液；
⑤ 調(diào)節(jié)濃度重懸于500W的白及膠溶液中，渦旋20s， Coulter細(xì)胞計(jì)數(shù) 儀計(jì)數(shù)；
(3) 生物素標(biāo)記抗體的制備
① 檢測抗體預(yù)處理對含疊氮鈉、Tris、甘氨酸等含氨基或其它小分子雜質(zhì) 的檢測抗體，用0.01M、 pH7.4 PBS充分透析；對含有牛血清白蛋白等大分子雜 質(zhì)的檢測抗體，用分離柱進(jìn)行純化；
② 抗體濃度標(biāo)定以分光光度計(jì)測定檢測抗體的0D280 (10D280相當(dāng)于 0.7mg/ml單克隆抗體)，以0.01M、 pH7. 4 PBS將抗體濃度調(diào)節(jié)至2mg/ml;
③ 生物素標(biāo)記抗體取上述預(yù)處理過的檢測抗體2501^1 ，加入25W的2mg/ml NHS-Biotin DMS0溶液，混勻，4。C下避光反應(yīng)2小時(shí)；
④ 透析以0.01M、 pH7.0 PBS對生物素標(biāo)記的抗體進(jìn)行透析，去除游離的 生物素，用分光光度計(jì)對生物素標(biāo)記的抗體定量；
(4) 制劑
將所需的各種耦聯(lián)微球按一定比例混合，并加適宜濃度的水溶膠調(diào)節(jié)微球濃 度，并分散混勻，使每種耦聯(lián)微球的濃度在2X103 4X103個(gè)/ml范圍內(nèi)，白及 溶膠質(zhì)含量在3 6wtl之間，于4"C下避光保存。在使用時(shí)，加入種類及數(shù)量 均對應(yīng)的生物素標(biāo)記抗體以及對應(yīng)數(shù)量的鏈親和素藻紅蛋白即可。
取保存2年的上述微球懸液，檢測其各層溶液中微球濃度，并以新制備的同 樣的微球懸液為對照，未發(fā)現(xiàn)該微球懸液各層間的微球濃度與對照有明的差異。實(shí)施例2—種多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片，主要包括
① 耦聯(lián)抗體的微球同實(shí)施例l;
② 生物素標(biāo)記的檢測抗體同實(shí)施例l;
③ 鏈親和素藻紅蛋白；
以上各成分均勻分散或溶解于溶質(zhì)含量為5 8wtl的白及膠水溶液中。
制備方法與實(shí)施例l基本相同，不同之處在于在制劑步驟中，將所需的各 種耦聯(lián)微球按一定比例混合，并加入種類及數(shù)量均對應(yīng)的生物素標(biāo)記抗體，以 及對應(yīng)數(shù)量的鏈親和素藻紅蛋白，再以適宜濃度的白及水溶膠調(diào)節(jié)微球濃度， 分散混勻后，使每種耦聯(lián)微球的濃度為lX103 2X103個(gè)/ml，白及溶質(zhì)含量為 5 8wt%。，于4"C下避光保存。
以上述液相芯片檢測CA15-3濃度為mg/ml的8個(gè)平行標(biāo)準(zhǔn)品，測定結(jié)果如 依次為19548.5、 18183.5、 17417、 18602、 18813、 17570、 18153.5,均值為 18316.09， SD為682. 3， CV=3. 7%。
實(shí)施例3 —種多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片，與實(shí)施例1基本相同，不
同之處在于耦聯(lián)抗體的微球、生物素標(biāo)記的檢測抗體及鏈親和素藻紅蛋白溶 解/分散于溶質(zhì)含量為2 4wt^的精制海藻膠水溶液中。所用海藻膠的制備方法 是取CP級以上的海藻膠，加水浸泡6 10小時(shí)，使其充分溶解后，以EK型 濾板過濾除雜，調(diào)節(jié)濃度至溶質(zhì)含量為5機(jī)%左右，滅菌后備用，且在制備過程 中，避免二價(jià)離子的引入。其制備方法與實(shí)施例l基本相同。
實(shí)施例4 一種多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片，主要包括懸浮分散于 溶質(zhì)含量1 3%的卡拉膠水溶液中的耦聯(lián)了 AFP捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CEA捕 獲抗體的微球、耦聯(lián)了CA125捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了CA153捕獲抗體的微球、 耦聯(lián)了 CA19-9捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CA242捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CA72-4 捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 PSA捕獲抗體的微球，和對應(yīng)的生物素標(biāo)記的檢測抗 體，以及鏈親和素藻紅蛋白，以上各成分均勻分散或溶解于溶質(zhì)含量為3 4wt%。的白及膠水溶液中。
制備方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于在制劑步驟中，將上述各 種耦聯(lián)微球按比例混合，并加入種類及數(shù)量均對應(yīng)的生物素標(biāo)記抗體，以及對 應(yīng)數(shù)量的鏈親和素藻紅蛋白，再以適宜濃度的白及水溶膠調(diào)節(jié)微球濃度，分散
混勻后，使每種耦聯(lián)微球的濃度為lX103 2X103個(gè)/ml，白及溶質(zhì)含量為3 4wt%。，于4。C下避光保存。
實(shí)施例5與實(shí)施例2基本相同，不同之處在于耦聯(lián)抗體的微球、生物素 標(biāo)記的檢測抗體及鏈親和素藻紅蛋白溶解/分散于溶質(zhì)含量為3 5wt^的魔芋 膠水溶液中。其制備方法與實(shí)施例2基本相同。
實(shí)施例6 —種多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片，主要包括
① 耦聯(lián)抗體的微球包括耦聯(lián)了 CEA捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CA19-9捕獲 抗體的微球、耦聯(lián)了CA125捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 HGH捕獲抗體的微球、耦 聯(lián)了 beta-HCG捕獲抗體的微球；
② 生物素標(biāo)記的檢測抗體與①相對應(yīng)的生物素標(biāo)記的檢測抗體；
③ 鏈親和素藻紅蛋白；
上述成分溶解/分散于溶質(zhì)含量為4 8wt。；的果膠與白及膠的混合水溶液中。
其制備方法與實(shí)施例2基本相同。
實(shí)施例7 —種多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片，主要包括懸浮分散于 溶質(zhì)含量1 3%的卡拉膠水溶液中的耦聯(lián)了 AFP捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CEA捕 獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CA125捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了CA153捕獲抗體的微球、 耦聯(lián)了 CA19-9捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CA242捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CA72-4 捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 PSA捕獲抗體的微球，和對應(yīng)的生物素標(biāo)記的檢測抗 體，以及鏈親和素藻紅蛋白。其制備方法基本同實(shí)施例l。實(shí)施例8 —種多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片，主要包括溶解/分散于 溶質(zhì)含量為6 9wt^的多聚糖水溶膠(由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、 鼠李糖、木糖等單糖及其相應(yīng)的糖醛酸中的一種或幾種按一定比例組成的多糖
水溶液)中的耦聯(lián)了CEA捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了CA125捕獲抗體的微球、耦聯(lián) 了CA19-9捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了CA242捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了PSA捕獲抗體 的微球，和對應(yīng)的生物素標(biāo)記的檢測抗體，以及鏈親和素藻紅蛋白。其制備方 法與實(shí)施例l基本相同。
實(shí)施例9 一種多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片，與實(shí)施例1基本相同，不 同之處在于耦聯(lián)抗體的微球、生物素標(biāo)記的檢測抗體及鏈親和素藻紅蛋白溶 解/分散于溶質(zhì)含量為3 7wtX。的瓜爾豆膠水溶液中。其制備方法與實(shí)施例1基 本相同。
實(shí)施例IO —種多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片，主要包括
① 耦聯(lián)抗體的微球包括耦聯(lián)了 AFP捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CEA捕獲抗體 的微球、耦聯(lián)了 CA125捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CA153捕獲抗體的微球、耦聯(lián) 了 CA19-9捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CA242捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了 CA72-4捕 獲抗體的微球、耦聯(lián)了PSA捕獲抗體的微球；
② 生物素標(biāo)記的檢測抗體與①相對應(yīng)的生物素標(biāo)記的檢測抗體；
③ 鏈親和素藻紅蛋白；
上述成分溶解/分散于溶質(zhì)含量為2 5wt^的香豆膠、田菁膠、黃蓍膠的混 合水溶液中。
在本發(fā)明中，腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片中的捕獲抗體及其對應(yīng)的檢測 抗體的種類可根據(jù)實(shí)際需(如篩査目標(biāo)的不同、癌癥種類的確診、療效監(jiān)測、 判斷預(yù)后、預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移)要進(jìn)行取舍調(diào)整，可以更有針對性，進(jìn)而 達(dá)到節(jié)約資源、降低成本之目的。以下是幾種常見腫瘤的常用聯(lián)合檢測"譜"，可以根據(jù)不同只需要，制備不同的腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片-
結(jié)腸癌CEA、 CA19-9聯(lián)檢是首選，其特異性達(dá)到80%以上； 胰腺癌CA19-9對胰腺癌的診斷已較好，如再加上CA125則可把診斷率 提高到90%以上；
肺癌單用CEA對肺癌的診斷已有較高的特異性，單如加上NSE、 CEA 則特異性更高；
卵巢癌CA125加CA19-9是較好的聯(lián)合；
胃癌以19-9加CEA仍是目前較好的聯(lián)合。 實(shí)施例ll線性關(guān)系檢測
(1) 取微球渦旋振蕩30s，把微球充分打散、混勻，稀釋成100000個(gè)/ml;
(2) 將相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋成20Hg/ml、 2Pg/ml、 200ng/ml、 20ng/ml、 2ng/ml、 200pg/ml、 20pg/ml、 2pg/ml;
(3) 向微孔板的目標(biāo)孔里分別加入50W (相當(dāng)于5000個(gè)微球)，然后分別 加入上述濃度的抗原50ri，渦旋20s，室溫下孵育40分鐘；
(4) 以60|4 PBS洗滌，并離心分離出PBS;
(5) 每孔加入20Ml的PBS-BN,渦旋20s;
(6) 每孔加入40W 4ug/ml的生物素標(biāo)記的二抗，渦旋20s，振蕩器上孵育 45分鐘；
(7) Luminex IOO儀器上讀板，每孔計(jì)算100個(gè)微球的熒光總量，獲得平均 熒光強(qiáng)度(MFI)，根據(jù)MFI與標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度間的關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以CA153 為例，其線性關(guān)系如圖1所示，從100pg/ml至100ng/ml之間為線性區(qū)間，其 它抗原的標(biāo)準(zhǔn)曲線與之類似，但線性范圍不太一樣。
有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品的定值大致設(shè)置如下 AFP (ng/ml)
標(biāo)準(zhǔn)系0、 5、 40、 300、 600;質(zhì)控品10、 100;臨床參考閾值20
CEA (ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)系0、 10、 60、 250、 600;質(zhì)控品10、 100;臨床參考閾值5
CA125 (IU/ml)
標(biāo)準(zhǔn)系0、 20、 200、 500、 1000;質(zhì)控品40、 200;臨床參考閾值35 CA153 (IU/ml)
標(biāo)準(zhǔn)系0、 10、 50、 300、 500;質(zhì)控品10、 500;臨床參考閾值22 CA19-9 (IU/ml)
標(biāo)準(zhǔn)系0、 2、 10、 100、 200;質(zhì)控品10、 50;臨床參考閾值37
CA72-4 (IU/ml)
標(biāo)準(zhǔn)系0、 10、 40、 250、 600;質(zhì)控品5、 200;臨床參考閾值12
PSA/f-PSA (ng/ml)
標(biāo)準(zhǔn)系0、 1、 2、 40、 200;質(zhì)控品1、 10;臨床參考閾值PSA, 4; f-PSA，
1; f-PSA/PSA<0. 11 NSE (ng/ml)
標(biāo)準(zhǔn)系0、 4、 20、 100、 400;質(zhì)控品1、 20;臨床參考閾值12. 5 25
HGH (IU/ml)
標(biāo)準(zhǔn)系0、 1、 4、 40、 200;質(zhì)控品1、 10;臨床參考閾值4。
權(quán)利要求
1.一種多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片，其特征在于，主要包括下列成分①耦聯(lián)捕獲抗體的微球含有分別耦聯(lián)了AFP捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了CEA捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了CA125捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了CA153捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了CA19-9捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了CA242捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了CA72-4捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了PSA捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了HGH捕獲抗體的微球、耦聯(lián)了beta-HCG捕獲抗體的微球中的至少兩種，耦聯(lián)不同捕獲抗體的微球則具有不同的顏色編碼；②生物素標(biāo)記的檢測抗體生物素分別標(biāo)記的AFP、CEA、CA125、CA153、CA19-9、CA242、CA72-4、PSA、HGH、beta-HCG檢測抗體中的至少兩種，且與①中捕獲抗體相對應(yīng)；③鏈親和素藻紅蛋白；以及④溶質(zhì)含量為1～10wt‰的不含蛋白成分的植物性水溶膠或多聚糖水溶膠。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片，其特征在于， 所述植物性水溶膠為不含蛋白成分的魔芋膠、香豆膠、白及膠、毛膠薯蕷多糖 膠、阿拉伯膠、果膠、田菁膠、黃蓍膠、刺梧桐膠、羅望子膠、卡拉膠、瓜爾 豆膠、刺槐豆膠、亞麻籽膠、精制海藻膠中的至少一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片，其特征在于， 所述多聚糖水溶膠是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖等 單糖及其相應(yīng)的糖醛酸中的一種或幾種按比例組成的多糖水溶液。
4. 權(quán)利要求1所述的多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片的制備方法，包括以 下步驟(1) 水溶膠的提純、配制選取或制備植物膠，去除所含蛋白成分及雜質(zhì)，滅菌，調(diào)節(jié)至一定濃度，備用；(2) 捕獲抗體與微球耦聯(lián)① 微球活化、修飾取熒光編碼的微球原液渦漩分散10 30s，移取 以》8000g離心2 4分鐘，移去上清液；加入80 12(^1水，渦旋10 30s， 》8000g離心2 4分鐘，移去上清液，重復(fù)加水洗滌1 2次；向洗滌過的微球 中加入60 勤M"1 0. lmol/L pH5. 0的PBS，渦旋10 30s后，再加入10 15W 50mg/ml sulfo-NHS水溶液，渦旋10 30s，隨后加入10 15^1 50mg/ml EDC 水溶液，渦旋10 30s后，于36 38。C下避光孵育20 30分鐘，>8000g、離 心2 3分鐘，移去上清液；加入200 300W 100mmol/L、 p服.3MES，渦旋10 30s， ^8000g離心2 4分鐘，移去上清液，如此重復(fù)洗滌1 2次；② 活化捕獲抗體預(yù)先去除待耦聯(lián)的捕獲抗體中所含的氨基小分子及其它 雜蛋白，再以O(shè). 05mol/L、 p朋.3 MES稀釋至40ug/ml，備用；③ 耦聯(lián) 向已活化的微球中加入450 550W相對應(yīng)的捕獲抗體，渦旋10 30s， 36 38。C下避光孵育1.5 3小時(shí)；④ 封閉位點(diǎn)向孵育后的溶液中加入l 2ml PBS-BN，渦旋10 30s， >8000g 離心2 4分鐘，棄上清液；再加入O. 5 lml PBS-BN，渦旋10 30s，》8000g 離心2 4分鐘，棄上清液；⑤ 調(diào)節(jié)濃度上步所得耦聯(lián)微球重懸于PBS-BN或水溶膠中，渦旋10 30s, 計(jì)數(shù)微球濃度；(3)生物素標(biāo)記抗體的制備① 檢測抗體預(yù)處理對含疊氮鈉、Tris、甘氨酸等含氨基或其它小分子雜質(zhì) 的檢測抗體，用0.01M、 pH7.4 PBS充分透析；對含有牛血清白蛋白及其它大分 子雜質(zhì)的檢測抗體進(jìn)行純化分離；② 抗體濃度標(biāo)定標(biāo)定測定檢測抗體的濃度后，以0. OIM、 pH7. 4 PBS將抗 體濃度調(diào)節(jié)至2mg/ml;(D生物素標(biāo)記抗體取預(yù)處理過的檢測抗體250W，加入2514的2mg/ml NHS-Biotin DMSO溶液，混勻，2 8""C下避光反應(yīng)1. 5 3小時(shí)； 透析以0.01M、 pH7.0 PBS對生物素標(biāo)記的抗體進(jìn)行透析，去除游離的 生物素，并標(biāo)定生物素標(biāo)記的抗體的濃度；(4)制劑將所需要的各種耦聯(lián)微球按一定比例混合，并以植物性水溶膠或多聚糖水溶 膠調(diào)節(jié)微球濃度，分散混勻，使每種耦聯(lián)微球的濃度為2X103 4X103個(gè)/ml， 溶膠質(zhì)含量為l 10wt%。，置2 8。C下避光保存；或?qū)⑺璧母鞣N耦聯(lián)微球按 一定比例混合，并加入種類及數(shù)量均對應(yīng)的生物素標(biāo)記抗體，以及對應(yīng)數(shù)量的 鏈親和素藻紅蛋白，再加植物性水溶膠或多聚糖水溶膠調(diào)節(jié)微球濃度，分散混 勻后，使每種耦聯(lián)微球的濃度為lX103 2X103個(gè)/ml，溶膠質(zhì)含量為1 10wt %。，于2 8'C下避光保存。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片的制備方法，其 特征在于，所述所述植物性水溶膠為不含蛋白成分的魔芋膠、香豆膠、白及膠、 毛膠薯蕷多糖膠、阿拉伯膠、果膠、田菁膠、黃蓍膠、刺梧桐膠、羅望子膠、 卡拉膠、瓜爾豆膠、刺槐豆膠、亞麻籽膠、精制海藻膠中的至少一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片的制備方法，其 特征在于，所述白及膠的制備方法如下精選白及原料，以l: 10 30的體積比加40 60。C的熱水浸提白及數(shù)次， 每次浸提4 8小時(shí)，直至白及體積皺縮時(shí)為止，合并各次提取液，真空或減壓 濃縮至溶質(zhì)含量為l 10wt%,過濾、滅菌后備用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片的制備方法，其 特征在于，所述精制海藻膠的制備方法如下取CP級以上的海藻膠，加水浸泡6 10小時(shí)，使其充分溶解后，以EK型濾 板過濾除雜，調(diào)節(jié)濃度至溶質(zhì)含量為l 10wt%，滅菌后備用，且在制備過程中， 避免二價(jià)離子的引入。
全文摘要
本發(fā)明涉及多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測液相芯片及其制備方法。該液相芯片包括耦聯(lián)抗體(AFP、CEA、CA125、CA153、CA19-9、CA242、CA72-4、PSA、HGH、β-HCG中的至少兩種)的微球、對應(yīng)得生物素標(biāo)記檢測抗體、鏈親和素藻紅蛋白，以及溶質(zhì)含量為1～10wt‰的不含蛋白成分的植物性水溶膠或多聚糖水溶膠。液相芯片的制備包括水溶膠的精制提純、捕獲抗體與微球耦聯(lián)、生物素標(biāo)記抗體的制備及耦聯(lián)微球分散于植物性水溶膠或多聚糖水溶膠等步驟。該液相芯片性能穩(wěn)定、微球分散性好，保質(zhì)期長，使用操作簡便，快速，樣本用量少，且檢測靈敏度高、線性范圍寬，檢測費(fèi)用低廉，最多一次可檢測十個(gè)腫瘤標(biāo)志物，而費(fèi)用僅為常規(guī)方法費(fèi)用總和的1/4。
文檔編號G01N33/569GK101526535SQ20091006464
公開日2009年9月9日 申請日期2009年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月14日
發(fā)明者王學(xué)銘, 王韞燁 申請人:河南省豫康生物工程技術(shù)有限公司