專利名稱：同時檢測新城疫和禽流感病毒的熒光試紙條及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于免疫應用領域，涉及養(yǎng)殖場、防疫檢疫部門以及醫(yī)療機構等單位診斷
或檢測新城疫病毒的技術。具體的講，本發(fā)明是同時檢測新城疫和禽流感病毒的快速檢測 方法，以及一種同時檢測新城疫和禽流感病毒的熒光試紙條。
背景技術：
禽流感(Avian influenza,AI)是由A型流感病毒引起的危及禽類、小型哺乳動物 和人類的病毒性傳染病，它是以呼吸道癥狀為主，至全身性敗血癥的疾病綜合癥，被國際獸 醫(yī)局(0IE)定為A類傳染病。新城疫(Newcastle Disease)俗稱"亞洲雞瘟"，新城疫病毒 (NewcastleDisease Virus,NDV)是引起雞瘟病的重要病原體。新城疫與禽流感相似，是嚴 重危害禽類的傳染病，其發(fā)病率，感染率和死亡率都很高，也被0IE列為A類疫病。
對這兩種疾病，目前已建立和應用的實驗室診斷技術有病毒分離、血凝抑制試驗 (HI)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和聚合酶鏈式反應(PCR)等。這些方法均費時費力，且技 術含量高，很難在基層推廣應用，建立一種簡單、快速的，診斷方法實屬必要。膠體金免疫層 析是一種簡單、快速的免疫學檢測技術，近年來已在醫(yī)學、動物檢驗、食品衛(wèi)生檢驗等研究 領域中廣泛用。 免疫層析是出現(xiàn)于八十年代初期的一種獨特的免疫分析方法，免疫層析技術由 于廣泛使用膠體金作為指示劑，所以又被稱為膠體金檢測法。目前該方法廣泛應用于 樣品初篩，但缺點是檢測靈敏度較低，難以進行定量檢測，而且檢測結(jié)果不易記錄和保 存。在免疫層析技術中，還有采用其他標記物作為指示劑的報道。Br皿ing等(J.Clin. Microbiol. 1999,81(1-2) :143-154)描述了一種以藍色乳膠顆粒作為標記物的免疫層析 試紙條快速檢測牛瘟病毒的方法。Ahn等(Clinica Chimica Acta, 2003， 332 :51-59)報道 了使用熒光染料熒光素作為指示劑用于免疫層析，可以獲得較高的靈敏度，而且可以實現(xiàn) 定量檢測。
發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強、靈敏度高， 操作簡便，檢測快速、準確并適合現(xiàn)場使用的專門用于同時檢測新城疫和禽流感病毒的熒 光試紙條及其制備方法，填補目前尚未有同時檢測新城疫和禽流感病毒的熒光試紙條的空 白。 —種用于同時檢測新城疫和禽流感病毒的熒光標記試紙條，包括樣品墊、結(jié)合墊、 硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，在PVC背襯上依次連續(xù)粘附有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維 素膜和吸水墊，所述結(jié)合墊與所述硝酸纖維素膜之間有搭接，所述硝酸纖維素膜與所述吸 水墊之間有搭接；所述結(jié)合墊上包被有新城疫單克隆抗體_熒光標記物以及禽流感單克隆 抗體_熒光標記物，所述硝酸纖維素膜上分別包被有新城疫單克隆抗體和禽流感單克隆抗 體構成的兩條檢測線和羊抗鼠IgG構成的質(zhì)控線。
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本發(fā)明的快速檢測免疫熒光試紙條的制備及檢測方法，包括以下步驟
(1)利用新城疫和禽流感單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內(nèi)誘生腹水法大量制 備抗體，使用Protein G柱進行純化，獲得新城疫單克隆抗體和禽流感單克隆抗體；
(2)選擇尺寸為20-50nm熒光納米顆粒作為標記物； (3)將步驟(1)制備的新城疫和禽流感單克隆抗體分別加入步驟(2)制備的熒光 納米顆粒中，得到新城疫單克隆抗體_熒光標記物和禽流感單克隆抗體_熒光標記物；
(4)將步驟(3)制備的新城疫單克隆抗體_熒光標記物和禽流感單克隆抗體_熒 光標記物包被在結(jié)合墊上； (5)將步驟(1)純化后的新城疫和禽流感單克隆抗體包被在硝酸纖維素膜上構成 兩條檢測線；并將羊抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜上構成質(zhì)控線； (6)在PVC背襯上按順序依次粘附所述樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊， 得到所述用于同時檢測新城疫和禽流感病毒的熒光標記試紙條； (7)將待檢測的樣品加載樣品墊上過濾后，若樣品中有NDV，則與結(jié)合墊中的熒光 標記抗體結(jié)合，通過層析作用先與NC膜上的新城疫單克隆抗體結(jié)合形成的熒光結(jié)合線1， 未結(jié)合完的熒光標記抗體繼續(xù)層析與羊抗鼠IgG結(jié)合形成第二條熒光質(zhì)控線；若樣品中有 AIV與結(jié)合墊中的熒光標記抗體結(jié)合，通過層析作用先與NC膜上的禽流感單克隆抗體結(jié)合 形成的熒光結(jié)合線2，未結(jié)合完的熒光標記抗體繼續(xù)層析與羊抗鼠IgG結(jié)合形成第二條熒 光質(zhì)控線； (8)觀察結(jié)果陽性則出現(xiàn)兩條結(jié)合線(出現(xiàn)結(jié)合線1和質(zhì)控線為樣品中含有 NDV，出現(xiàn)結(jié)合線2和質(zhì)控線為樣品中含有AIV);陰性則僅出現(xiàn)一條質(zhì)控線；試劑條無效則 不出現(xiàn)線條。 本發(fā)明的制備方法，所述步驟(2)中熒光納米顆粒采用反相微乳法制備，制備的 熒光納米顆粒尺寸大小為20-50nm。 本發(fā)明中的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC背襯均購自Millipore公司。 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有下列優(yōu)點 1.本發(fā)明的熒光標記試紙條可以同時檢測兩種病毒，實現(xiàn)了一步多檢的檢測方 法，具有特異性強，靈敏度高，檢測時間短(20分鐘)，操作簡便等優(yōu)點。
2.本發(fā)明的檢測試紙條只需要簡單儀器、設備，可現(xiàn)場操作，檢測成本低。
3.本發(fā)明的檢測試紙條操作簡便，不需由專業(yè)人員操作。 4.本發(fā)明的檢測試紙條儲存方便，對溫度要求不高，在4-8t:下可保存六個月。
圖1是本發(fā)明新城疫病毒的快速檢測免疫熒光試紙條的結(jié)構示意圖。包括樣品墊 (1)、結(jié)合墊(2)、新城疫檢測線(3)、禽流感檢測線(4)和質(zhì)控線(5)。 圖2是本發(fā)明新城疫病毒的快速檢測免疫熒光試紙條結(jié)果判讀示意圖。該試紙條 的檢測結(jié)果需使用凝膠成像系統(tǒng)，專用的熒光測量儀，或其他儀器進行輔助觀察并記錄結(jié) 果。新城疫陽性結(jié)果呈現(xiàn)兩條線，即質(zhì)控線(5)和檢測線(3);禽流感陽性結(jié)果呈現(xiàn)兩條線， 即質(zhì)控線(5)和檢測線(4);而陰性結(jié)果只呈現(xiàn)一條質(zhì)控線(5);如果質(zhì)控線(5)也不出現(xiàn)的話，說明該試紙條失效了。
具體實施例方式
為進一步說明本發(fā)明，結(jié)合以下實施例具體闡述。
快速檢測新城疫病毒的方法，包括如下步驟 (1)本發(fā)明利用抗原抗體反應的特異性和熒光免疫層析簡單快速原理，建立了新城疫和禽流感單克隆抗體，用反相微乳法制備尺寸為50nm的熒光納米顆粒作為標記物。
(2)熒光納米顆粒與抗體的標記取親和純化的新城疫或者禽流感單克隆抗體200ii L(O. 5mg/mL)，用0. 025M碳酸鹽緩沖溶液(pH 9. 5)4。C透析6h ;然后加入lOOy L懸浮于碳酸鹽緩沖溶液中的熒光納米顆粒(8mg/mL) ， 4"C過夜；加入NaBH3CN，終濃度為5mM，反應2h ;再加等體積的封閉液(10mM Tris 7. 8，含2% BSA、4X蔗糖)最后用10mM Tris 7.8洗滌標記好的抗體3遍，然后用100iiL 10mM Tris 7. 8 (含0. 9% NaC1、0. 2% BSA、0. 1 %NaN3)懸浮，4t:保存。 (3)將熒光納米顆粒標記好的新城疫或者禽流感抗體稀釋100倍均勻滴加在玻璃纖維素膜上，每試紙條加入4 ii L， 37t:溫箱中烘烤lh。 (4)硝酸纖維素膜上用三維點膜儀分別噴上濃度為0. 5mg/mL的羊抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線，濃度為0. 4mg/mL的新城疫單克隆抗體和濃度為0. 3mg/mL的禽流感單克隆抗體為兩條檢測線。 (5)按照(4)加工好的硝酸纖維素膜、按照(3)加工好的玻璃纖維素膜和吸水紙的先后順序，將各部分粘貼在支撐板上制造成新城疫病毒的快速檢測熒光標記試紙條。
(6)將待檢測的樣品加載樣品墊上過濾后，若樣品中有NDV，則與結(jié)合墊中的熒光標記抗體結(jié)合，通過層析作用先與NC膜上的新城疫單克隆抗體結(jié)合形成的熒光結(jié)合線3，未結(jié)合完的熒光標記抗體繼續(xù)層析與羊抗鼠IgG結(jié)合形成第二條熒光質(zhì)控線；若樣品中有AIV與結(jié)合墊中的熒光標記抗體結(jié)合，通過層析作用先與NC膜上的禽流感單克隆抗體結(jié)合形成的熒光結(jié)合線4，未結(jié)合完的熒光標記抗體繼續(xù)層析與羊抗鼠IgG結(jié)合形成第二條熒光質(zhì)控線。 (7)觀察結(jié)果陽性則出現(xiàn)兩條結(jié)合線(出現(xiàn)結(jié)合線3和質(zhì)控線為樣品中含有NDV，出現(xiàn)結(jié)合線4和質(zhì)控線為樣品中含有AIV);陰性則僅出現(xiàn)一條質(zhì)控線；試劑條無效則不出現(xiàn)線條。 以上實施方式僅用于幫助本領域技術人員更加全面的理解本發(fā)明，但并不對本發(fā)明做任何限制。凡依照本發(fā)明的內(nèi)容所做出的任何本領域等同的替換均屬于本發(fā)明保護的范圍之內(nèi)。
權利要求
一種同時檢測新城疫新城疫和禽流感病毒的熒光標記試紙條的制備及檢測方法，其特征在于其步驟為1)利用新城疫和禽流感單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內(nèi)誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein G柱進行純化，獲得新城疫單克隆抗體和禽流感單克隆抗體；2)制備尺寸為50nm熒光納米顆粒作為標記物；3)將步驟1)制備的新城疫和禽流感單克隆抗體分別加入步驟2)制備的熒光納米顆粒中，得到新城疫單克隆抗體-熒光標記物和禽流感單克隆抗體-熒光標記物；4)將步驟3)制備的新城疫單克隆抗體-熒光標記物和禽流感單克隆抗體-熒光標記物包被在結(jié)合墊上；5)將步驟1)純化后的新城疫和禽流感單克隆抗體包被在硝酸纖維素膜上構成兩條檢測線；并將羊抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜上構成質(zhì)控線；6)在PVC背襯上按順序依次粘附所述樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，得到所述用于同時檢測新城疫新城疫和禽流感病毒的熒光試紙條；7)將待檢測的樣品加載樣品墊上過濾后，若樣品中有NDV，則與結(jié)合墊中的熒光標記抗體結(jié)合，通過層析作用先與NC膜上的新城疫單克隆抗體結(jié)合形成的熒光結(jié)合線3，未結(jié)合完的熒光標記抗體繼續(xù)層析與羊抗鼠IgG結(jié)合形成第二條熒光質(zhì)控線；若樣品中有AIV與結(jié)合墊中的熒光標記抗體結(jié)合，通過層析作用先與NC膜上的禽流感單克隆抗體結(jié)合形成的熒光結(jié)合線4，未結(jié)合完的熒光標記抗體繼續(xù)層析與羊抗鼠IgG結(jié)合形成第二條熒光質(zhì)控線；8)觀察結(jié)果陽性則出現(xiàn)兩條結(jié)合線(出現(xiàn)結(jié)合線3和質(zhì)控線為樣品中含有NDV，出現(xiàn)結(jié)合線4和質(zhì)控線為樣品中含有AIV)；陰性則僅出現(xiàn)一條質(zhì)控線；試劑條無效則不出現(xiàn)線條。
2. 如權利要求2所述的用尺寸為50nm熒光納米顆粒作為標記物，其特征在于熒光納 米顆粒是指尺寸為50nm左右的，適合生物標記的熒光納米顆粒。
3. 如權利要求1所述的使用新城疫病毒的快速檢測免疫熒光試紙條，其特征在于所 述形成的檢測帶和控制帶檢測是指使用凝膠成像系統(tǒng)，專用的熒光測量儀，或其他儀器進 行輔助觀察并記錄結(jié)果。
4. 權利要求1中所述的試紙條在同時檢測新城疫和禽流感病毒中的應用。
5. 權利要求1中所述的試紙條在一步檢出多個組分中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種同時檢測新城疫和禽流感病毒的熒光標記試紙條，屬于動物疫病診斷檢測方法技術領域。這種熒光標記試紙條，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，在PVC背襯上依次連續(xù)粘附有樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述結(jié)合墊與所述硝酸纖維素膜之間有搭接，所述硝酸纖維素膜與所述吸水墊之間有搭接；所述結(jié)合墊上包被有新城疫單克隆抗體-熒光標記物以及禽流感單克隆抗體-熒光標記物，所述硝酸纖維素膜上分別包被有新城疫單克隆抗體和禽流感單克隆抗體構成的兩條檢測線和羊抗鼠IgG構成的質(zhì)控線。本發(fā)明的試紙條可以同時檢測兩種病毒，實現(xiàn)了一步多檢的檢測方法，具有特異性強，靈敏度高，檢測時間短(20分鐘)，操作簡便等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/558GK101701958SQ200910079089
公開日2010年5月5日 申請日期2009年3月5日 優(yōu)先權日2009年3月5日
發(fā)明者張帆, 李錦豐, 鄒明強 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院