專利名稱：：一種檢測土拉菌的基因液相芯片及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測土4立菌(Fra"c^/Za加/a""&,F/)的基因液相芯片及其制備方法。本發(fā)明還涉及利用所述的基因液相芯片進(jìn)行斥企測的方法。
背景技術(shù)：
：液相芯片檢測是近幾年發(fā)展起來的新興技術(shù)，具有快速、特異、敏感的特點。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn)生100種不同比例顏色，作為IOO種獨特的色彩編號，每顆微球大小約5.5pm,可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等，并根據(jù)不同研究目的而標(biāo)定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。土4立菌(Fm"c!w〃a似/amm、/^)為需氧J求才干4犬小^干菌(0.2|xmx0.2~0.7nm),細(xì)胞單生，極其多形態(tài)，無芽孢，無動力；革蘭氏染色陰性，染色時不易著色。本菌在普通培養(yǎng)基上不生長，在適當(dāng)?shù)墓腆w培養(yǎng)基(如含1%血紅蛋白的胱氨酸血瓊脂培養(yǎng)基)上培養(yǎng)2-4d可形成光滑、凸起的灰白色菌落。血褪色并可以變成綠色。在石蕊牛奶中弱生長，可產(chǎn)弱酸。最適生長溫度37。C,致死溫度56。C10分鐘。在^f氐溫下能很好的存活。菌培養(yǎng)是診斷土拉弗氏菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)該菌37。C生長緩慢、28。C幾乎不生長的特性可與28。C較快生長的鼠疫桿菌、新兇手弗氏菌區(qū)別開來，但因其容易引起實驗室感染，無法作為常M4喿作。而試管凝集法的敏感性和特異性都很高。分子生物學(xué)方法主要有PCR、實時熒光PCR等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的基因液相芯片及其制備方法，該基因液相芯片可以用于病原體土拉菌的檢測。本發(fā)明還涉及利用所述的基因液相芯片進(jìn)行4企測的方法。4經(jīng)過深入和大量的研究和實驗，本發(fā)明以土拉菌/o;^基因特異性序列為靶序列，建立了土拉菌液相芯片和檢測方法，為該菌的檢測提供一條可行的途徑。本發(fā)明所述的基因液相芯片包括微球、捕獲探針、引物、PCPL^應(yīng)體系、鏈親和素一藻紅蛋白，該基因液相芯片可檢測土拉菌。本發(fā)明還涉及上述可檢測土拉菌的基因液相芯片，該芯片包括熒光編碼的微球、捕獲探針、引物、PCR反應(yīng)體系、鏈親和素一藻紅蛋白，其中本發(fā)明的PCR^應(yīng)體系包括10xPCR纟爰沖液、dNTPs、TaqDNA聚合酶。本發(fā)明的引物包括:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>其中，下游引物是5'生物素標(biāo)記的Ft-R。具體例如是Ft-R:5，-生物素-GCTGTAGTCGCACCATTATCCT本發(fā)明的捕獲探針，所述的捕獲探針具有特異性:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上面所述探針在合成時在5'端進(jìn)行M修飾，并且連接15-20個T或連接C12作為間隔鏈，然后將探針與所選的編碼微球進(jìn)行偶聯(lián)。本發(fā)明的微球，一般選擇熒光編碼的微球，例如來源于Luminex或其他代理公司的任何編號的微球，特異性:探針與熒光編碼微球偶聯(lián)形成檢測微球，由此構(gòu)成檢測芯片。本發(fā)明的鏈親和素-藻紅蛋白(Str印tavidin-R-phycoerythrin，SA-PE)為一種焚光蛋白，能被液相芯片檢測系統(tǒng)中的綠色激光激發(fā)發(fā)光，由此可以進(jìn)行定性或定量檢測。本發(fā)明涉及上述基因液相芯片的制備方法，該方法包括1.選取編碼微球，取適量如約1.25乂106個于離心管內(nèi)，離心棄上清后，加入0.1mol/L的2-(n-嗎啉代)乙磺酸溶液使之重懸；2.用蒸餾水將合成的寡核苷酸探針(即捕獲探針Ft)稀釋，加至微球懸浮液中，振蕩混勻；3.加入10mg/mL的EDC(l-乙基-3-[3-二曱基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽)溶液至微球與探針混和液中，振蕩混勻，室溫孵育例如30分鐘；4.用例如0.02。/。PBST洗滌，14000g下離心；移棄上清液，將上述孩吏J求重懸于例如lml的0.1。/。SDS(即十二烷基磺酸鈉)中，洗滌，離心；5.移棄上清液，微球重懸于例如100nlpH8.0TE中，振蕩懸起混勻，得到偶聯(lián)好的檢測微球，即本發(fā)明的基因液相芯片。4"C避光保存。另一方面，本發(fā)明還涉及上述土拉菌檢測基因液相芯片的檢測方法，該方法包括樣^^亥酸的提取，PCR擴增，檢測病原體。本發(fā)明對上述三個步驟的操作和條件進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化。本發(fā)明的樣本核酸的提取方法采用采用Nal裂解-玻璃粉吸附法提取樣本的核酸。例如，具體步驟如下1)向每管樣本中加入6mol/LNal，振蕩混勻，煮沸；2)離心，轉(zhuǎn)上清液至另一含20%玻璃#^液的離心管中；3)充分混勻，室溫放置10分鐘，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上；8000r/分鐘離心，小心傾去上清液；4)向玻璃粉-DNA沉淀中加入75o/。乙醇lml，充分混勻，離心，小心傾去上清液；5)重復(fù)步驟(4)，然后置于37。C恒溫箱內(nèi)干燥；6)向上述干燥的玻璃粉-DNA沉淀中加20nlTE，充分混勻，65°C加熱，離心，回收上清液備用。本發(fā)明的PCR擴增方法包括以上述核酸提取步驟中制備的上清液作為PCR反應(yīng)的模板，采用PCR反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件本發(fā)明的PCR體系10xpCR緩沖液3jalTaqDNA聚合酶0羊dNTPs:0.3pi上游引物0.3^1下游引物0.3pl模板DNA:2^1雙蒸水ddH20:補足30pl反應(yīng)條件預(yù)變性94-96。C10分鐘35個循環(huán)94-96。C30國40秒55-58°C30-40秒72。C30-40秒延伸72。C4-7分鐘同時，PCR空白對照品為如下10xPCR緩沖液3^1Taq酶0.3|uldNTPs:0.3|til上游引物0.3|nl下游引物0.3^1雙蒸水ddH20:補足30ial反應(yīng)結(jié)束后以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增情況。本發(fā)明的檢測方法，優(yōu)選是1)取上述兩種偶聯(lián)微球混合，裝于PCR管中，根據(jù)微球計數(shù)結(jié)果計算相應(yīng)加入量，使每種微球的量相同，每次反應(yīng)每種3000-5000個；2)向各管中加5-17pl上面的PCR擴增得到的產(chǎn)物，混勻；3)95。C變性10分鐘；隨后45~60。C反應(yīng)10-30分鐘；4)離心或抽濾去掉未結(jié)合的PCR產(chǎn)物；5)再向各孔加SA-PE，室溫避光孵育，抽濾去掉未結(jié)合的SA-PE;6)再向各孔加入75inlTE懸浮液，振蕩使微球重懸；7)反應(yīng)結(jié)束后上LUMINEX檢測儀器進(jìn)行檢測。例如使用Bio-plex檢測設(shè)備，通過紅、綠兩束激光檢測，紅色激光激發(fā)微球基質(zhì)的染料從而對微球編號進(jìn)行識別，綠色激光對結(jié)合體的熒光蛋白進(jìn)行識別，實現(xiàn)捕獲揮:針捕獲的PCR產(chǎn)物的定量分析。附圖為用探針Ft檢測土拉茵核酸的劑量-反應(yīng)曲線，即模板DNA的量與發(fā)生反應(yīng)的熒光信號值MFI之間的對應(yīng)關(guān)系；橫軸代表PCR反應(yīng)體系中模板DNA的濃度(fg/test)，縱軸代表熒光信號值MFI。具體實施例方式實施例l、基因液相芯片的制備1.選取編碼微球，如027號，取約1.25xl()6個置于離心管，14000g下離心，例如離心3-5分鐘，小心吸出上清液；2.加入50piO.lmol/L的2-(n-嗎啉代)乙磺酸溶液，振蕩混勻。3.用蒸餾水將合成的寡核苷酸探針稀釋到0.1mmol/L;將l(il稀釋的探針Ft加于027號微球懸浮液中，振蕩混勻。4.加入2.5|il新鮮配制的10mg/mL的EDC溶液至孩U求與4笨針混和液中，振蕩，室溫孵育30分鐘。5.用0.02%PBSTlml洗滌1次，離心14000g3-5分鐘。6.移棄上清液，微球重懸于1ml0.1%SDS中，洗滌，離心。7.移棄上清液，微球重懸于lOOplpH8.0TE中，振蕩懸起混勻，即得到偶聯(lián)好的檢測微球。8.用血球計數(shù)器計數(shù)微球的數(shù)量，換算出每種微球的單位濃度。9.把偶聯(lián)好的檢測微球放在4。C避光保存，一般每種探針偶聯(lián)的微球單獨保存，使用時，根據(jù)檢測項目選擇要混合的微球種類。實施例2、樣本核酸的提取采用Nal裂解-玻璃粉吸附法提取樣本的核酸。具體如下1)向每管樣本中加入6mol/LNal100|il，振蕩混勻，煮沸30分鐘。2)將上述煮沸處理的樣本于10000r/分鐘離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)8至另一含20%玻璃粉液的離心管中。3)充分混勻，置室溫10分鐘，8000r/分鐘離心2分鐘，小心傾去上清液。4)向玻璃粉DNA沉淀中加入75。/。乙醇1ml，充分混勻，洗滌玻璃粉，8000r/分鐘離心2分鐘，小心傾去上清液。5)重復(fù)清洗一次后，放置于37。C恒溫箱使徹底干燥。6)向上述晾干的玻璃粉-DNA沉淀中加20plTE，充分混勻，65°C加熱15分鐘。8000r/分鐘離心2分鐘，回收上清液備用。實施例3、PCR擴增以回收的上清液作為PCR反應(yīng)的模板，PCR反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件:PCR體系10xPCR緩沖液Taq酶dNTPs:上游引物下游引物模板DNA:雙蒸水ddH20:反應(yīng)條件預(yù)變性94°C35個循環(huán)94°C58°C72。C延伸72°C3pl0.3^il0.3|xlO羊補足30pl10分鐘30秒30秒40秒7分鐘同時設(shè)置PCR空白對照，如下10xPCR緩沖液3jilTaq酶0.3|iildNTPs:上游引物下游引物雙蒸水ddH20:0羊0.3|iil補足30|11反應(yīng)結(jié)束后以1%的瓊脂糖凝"交電泳;險查擴增情況。實施例4、檢測1.取偶聯(lián)微球027號各5000個混合，分裝于PCR管中(根據(jù)微球計數(shù)結(jié)果計算相應(yīng)加入量)2.向各管中加5~17^1上面的PCR產(chǎn)物4吏其終體積為50|li1。3.95。C變性IO分鐘。4.45~60。C反應(yīng)10-30分鐘。5.轉(zhuǎn)移至濾板抽濾去掉未結(jié)合的PCR產(chǎn)物。6.再向各孔加75fi14ng4dSA-PE,室溫避光孵育IO分鐘，抽濾去掉未結(jié)合的SA-PE。7.再向各孔加入75pl懸浮液，振蕩使孩"求重懸。8.反應(yīng)結(jié)束后上枳4企測。9.Bio-plex檢測系統(tǒng)，通過紅、綠兩束激光檢測，紅色激光激發(fā)微球基質(zhì)的染料從而對微球編號進(jìn)行識別，綠色^:球?qū)Ρ砻娼Y(jié)合的焚光染料進(jìn)行識別，實現(xiàn)捕獲探針捕獲的PCR產(chǎn)物的定量分析。在檢測時，同時以PCR陰性對照進(jìn)行檢測做為檢測本底。對于每個檢測體系和檢測本底，儀器輸出的數(shù)據(jù)是相應(yīng)反應(yīng)體系內(nèi)一種編號微球群的焚光強度中位值(MedianFluorescenceIntensity,MFI)，亦即讀取的這種編號的微球群(100個或以上)的每個微球信號強度的統(tǒng)計平均值。結(jié)果判斷當(dāng)待檢測樣本孔的MFI值為本次檢測背景信號強度三倍以上時即判為陽性。實施例5、定量檢測提取土拉菌的基因組DNA，利用核酸蛋白分析儀測定其濃度，進(jìn)行系列稀釋，PCR擴增后，同上面檢測步驟進(jìn)行檢測，Bio-PlexVersion4.010分析，擬合出劑量-反應(yīng)曲線和曲線方程。樣本^r測值代入方程實現(xiàn)定量檢測。結(jié)果針對土拉菌的檢測，本發(fā)明設(shè)計了位于染色體/o/W基因的探針進(jìn)行檢測。提取土拉菌基因組DNA測定濃度后進(jìn)行10倍系列稀釋，3fg-3xl07fg,按上述確定的方法進(jìn)行PCR擴增和檢測，擬合曲線，得出曲線方程探針Ft的曲線方程FI=-2.56466+(2725.31+2.56466)/((l+(Cone/260493)-2廁))o.33"45從標(biāo)準(zhǔn)曲線推算檢出限，本體系的檢出限為0.95pg/test。從上述結(jié)果可以得出，本發(fā)明的懸浮芯片和;^測方法具有以下優(yōu)越性1.靈敏較之于普通的多重PCR反應(yīng)，本發(fā)明的靈敏度提高從以下兩個方面體現(xiàn)1)檢測儀器存在信號的放大系統(tǒng)；2)PCR產(chǎn)物帶上的生物素與熒光染料藻紅蛋白連接的親和素結(jié)合的放大作用。2.特異釆用核酸4笨針:忮術(shù)對標(biāo)記上生物素的PCR產(chǎn)物進(jìn)行特異性的識別，而非傳統(tǒng)的電泳方法通過PCR產(chǎn)物片^a大小進(jìn)行識別。3.準(zhǔn)確高效整合核酸體外擴增、核酸分子雜交、編碼微球、生物素標(biāo)記、焚光檢測和流式細(xì)胞技術(shù)于一體，同時實現(xiàn)核酸樣品的檢測、鑒定，使結(jié)果準(zhǔn)確，工作高效。4、芯片制作方便只用設(shè)計好待檢目標(biāo)菌的引物，優(yōu)化PCR條件，標(biāo)記對應(yīng)的探針于編碼微球，即可組裝成檢測體系。5、本發(fā)明涉及的方法同樣適用于其他病原體或目標(biāo)物的核酸檢測。6、可實現(xiàn)多重檢測，待檢目標(biāo)靈活可調(diào)可根據(jù)不同檢測目標(biāo)，選擇對應(yīng)的引物和微球，組成不同目標(biāo)組合的檢測體系。權(quán)利要求1.一種檢測土拉菌(Francisellatularensis，F(xiàn).t)的基因液相芯片，該芯片包括熒光編碼的微球、捕獲探針、引物、PCR反應(yīng)體系、鏈親和素-藻紅蛋白。2.權(quán)利要求l所述的基因液相芯片，其中所述引物包括Ft-FGGGCAAATCTAGCAGGTCAAGFt-RGCTGTAGTCGCACCATTATCCT下游引物5，端經(jīng)生物素標(biāo)記Ft-R:5，-生物素-GCTGTAGTCGCACCATTATCCT，3.權(quán)利要求i所述的基因液相芯片，其中所述捕獲^:針選自探針名稱探針序列(5，-3，)FtTGCTGGTTTAACATGGTTCTTTGG上面所述探針在合成時在5'端進(jìn)行氨基^^飾，并且連接15-20個T或連接C12作為間隔鏈，然后將探針與所選的編碼」微球進(jìn)行偶聯(lián)。4.一種制備權(quán)利要求1任一項所述的基因液相芯片的方法，該方法包括1)選取編碼微球，取適量于離心管內(nèi)，離心棄上清后，加入2-(n-嗎啉代)乙磺酸溶液使之重懸；2)用蒸餾水將合成的寡核苷酸探針，即捕獲探針Ft稀釋，加至微球懸浮液中，振蕩混勻；3)加入EDC溶液至微球與探針混和液中，振蕩混勻，室溫孵育；4)用0.02%PBST洗滌，14000g下離心；移棄上清液，將上述孩t球重懸于0.1。/。SDS中，洗滌，離心；5)移棄上清液，微球重懸于pH8.0TE中，振蕩懸起混勻，得到偶聯(lián)好的檢測微球，得到所述的基因液相芯片。5.權(quán)利要求1-4任一項所述的土拉菌檢測基因液相芯片的檢測方法，該方法包括樣本核酸的提取，PCR擴增，檢測病原體核酸。6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述樣本核酸的提:f又包括以下步驟1)向每管樣本中加入Nal,振蕩混勻，煮沸；2)離心，轉(zhuǎn)上清液至另一含20%玻璃粉液的離心管中；3)充分混勻，室溫放置，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上；離心，小心傾去上清液；4)向玻璃粉-DNA沉淀中加入75。/。乙醇，充分混勻，離心，小心傾去上清液；5)重復(fù)步驟4),然后置于37。C恒溫箱內(nèi)干燥；6)向上述干燥的玻璃4分-DNA沉淀中加20nlTE，充分混勻，65。C加熱，離心，回收上清液備用。7.權(quán)利要求4-6任一項所述的方法，其中所述^r測步驟包括1)取上述偶聯(lián)微球，裝于PCR管中，根據(jù)微球計數(shù)結(jié)果計算相應(yīng)加入量；2)向各管中加5~17|11上面的PCR擴增得到的產(chǎn)物，混勻；3)95。C變性10分鐘；隨后45~60。C反應(yīng)10~30分鐘；4)離心或抽濾去掉未結(jié)合的PCR產(chǎn)物；5)再向各孔加SA-PE，室溫避光孵育，抽濾去掉未結(jié)合的SA-PE;6)再向各孔加入75filTE懸浮液，振蕩使微球重懸；上檢測儀器進(jìn)行檢觀'J。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測土拉菌的基因液相芯片及其制備方法。本發(fā)明還涉及利用所述的基因液相芯片進(jìn)行檢測的方法。本發(fā)明以fopA特異基因為靶序列，建立了土拉菌液相芯片和檢測方法，為土拉菌的檢測提供一條可行的途徑。文檔編號G01N21/64GK101560562SQ20091008026公開日2009年10月21日申請日期2009年3月17日優(yōu)先權(quán)日2009年3月17日發(fā)明者劉衡川,孫肖紅,宋亞軍,文海燕,宇楊,靜王,胡孔新申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院