專利名稱：稀有鮈鯽卵黃蛋白原單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種稀有鮑鯽卵黃蛋白原單克隆 抗體及其在檢測(cè)環(huán)境生物活性物質(zhì)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
卵黃蛋白原(Vitellogenin, VTG)是卵黃蛋白的前體，是一種高磷糖 蛋白。在正常情況下，卵黃蛋白原僅由性成熟的雌性卵生動(dòng)物的肝臟合成， 雄性動(dòng)物體內(nèi)并不產(chǎn)生卵黃蛋白原；但是雄性動(dòng)物肝臟中也存在雌激素受 體和卵黃蛋白原基因，在雌激素或類雌激素的誘導(dǎo)下可合成卯黃蛋白原。 因此，卵黃蛋白原是一種理想的環(huán)境雌激素的生物標(biāo)志物，被廣泛應(yīng)用于 環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的相關(guān)研究中。
目前國(guó)際上對(duì)生物體內(nèi)卵黃蛋白原的檢測(cè)主要采用免疫學(xué)方法，其中 最常用的是基于酶聯(lián)免疫吸附原理的檢測(cè)方法，該方法根據(jù)抗原-抗體特異 性結(jié)合的才幾制，將酶標(biāo)記在抗原或抗體上，形成酶標(biāo)記的抗原或抗體，而 酶能夠催化底物水解、氧化或還原，生成可檢測(cè)的有色產(chǎn)物。由于所使用 的檢測(cè)方法(如直接法、間接法、間接竟?fàn)幏ǖ?的差異，產(chǎn)物顯現(xiàn)的顏 色與抗原或抗體的濃度呈現(xiàn)正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，據(jù)此可以定量計(jì)算出抗原或 抗體的濃度。
在中國(guó)專利CN1624483A中，公開(kāi)了 一種4企測(cè)環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑 盒，該試劑盒利用雙抗夾心法，使用鯽卵黃蛋白原兔多克隆抗體和鯽卵黃 蛋白原鼠源單克隆抗體來(lái)檢測(cè)環(huán)境中分布廣、易捕獲、普遍性的鯽的卵黃 蛋白原。該試劑盒尚存在靈敏度不高、且操作復(fù)雜、成本高的缺點(diǎn)(靈敏 度為50ng/孔，線性范圍在500-1400ng/ml)。
由于卵黃蛋白原的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)在不同種類的卵生動(dòng)物之間差異 很大，所以一種動(dòng)物的卵黃蛋白原抗體在用于其它動(dòng)物卵黃蛋白原檢測(cè)時(shí) 受到很大限制。因此，為了準(zhǔn)確反映環(huán)境雌激素的存在水平，對(duì)不同種類 的卵生動(dòng)物，需要制備其相應(yīng)的卵黃蛋白原抗體。有關(guān)這方面的文獻(xiàn)包括 (1 ) C. Porte, G. Janer, M. Ortiz-Zarragoitia， L.C. Lorusso， M.P. Cajaraville,M.C. Fossi, L. Canesi. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C, 2006, 143: 303-315. ( 2 ) F. Eertmans， W. Dhooge， S. Stuyvaert, F. Comh. Toxicology in Vitro， 2003， 17: 515-524. ( 3 ) Janne K. Eidem, Hans Kleivdal, Kevin Kroll， Nancy Denslow， Ronny van Aerle， Charles Tyler, Grace Panter, Tom Hutchinson, Anders Goks0yr. Aquatic Toxicology, 2006， 78: 202-206. ( 4 ) Tao Liao, Shiwei Jin， Fang-Xing Yang, Yang Hui, Ying Xu. Science of the Total Environment, 2006, 364: 284—294. ( 5 )曹文宣，王劍偉.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科 學(xué)與管理，2003， 20(增刊):96-99. ( 6)周慶祥，江桂斌.化學(xué)進(jìn)展，2003， 15(1): 67-73。
稀有齣鯽(Go6/oc_y; n;s rarws )是我國(guó)特有的 一種小型鯉科魚(yú)類，其 生理特征與國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)推薦的模型動(dòng)物斑馬魚(yú)、日本青鏘等有許 多相似之處。已有研究表明，稀有鮑鯽對(duì)雌激素類化合物的敏感性高于斑 馬魚(yú)和日本青鏘，因此，稀有齣鯽有望成為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物向國(guó)際推廣。已 有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用純化的稀有齣鯽卵黃蛋白原免疫新西蘭兔制備多克隆抗 體，并應(yīng)用于ELISA檢測(cè)中。但是，采用多克隆抗體進(jìn)行檢驗(yàn)存在特異性 差、效價(jià)低、數(shù)量有限、動(dòng)物間個(gè)體差異大，難以重復(fù)制備等固有缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種稀有齣鯽卵黃蛋白原的單克隆抗 體，以保證稀有齣鯽卵黃蛋白原檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏度，從而更加有效地 定性和/或定量檢測(cè)環(huán)境中的雌激素。
本發(fā)明提供了 一種分泌稀有鉤鯽卵黃蛋白原單克隆抗體的雜交瘤細(xì) 胞系，該雜交瘤細(xì)胞系RVM-3是由稀有齣鯽卵黃蛋白原免疫Bal B/C小鼠 后，產(chǎn)生分泌稀有鮑鯽卵黃蛋白原單克隆抗體的B細(xì)胞(脾細(xì)胞)，該B 細(xì)胞再與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合后形成的，于2009年1月19日保藏于中 國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，地址北京市 朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2869。 具體來(lái)說(shuō)，其制備方法包括以下步驟 (1 )制備稀有齣鯽卵黃蛋白原； (2)采用稀有齣鯽卵黃蛋白原免疫BalB/C小鼠； (3 )取Bal B/C小鼠的B細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。 其中，所述步驟(1 )具體包括以下步驟從長(zhǎng)時(shí)間暴露于含雌性激素水體中的稀有鮑鯽的血清中提取卵黃蛋白原。
本發(fā)明還提供了上述雜交瘤細(xì)胞系分泌的稀有齣鯽卵黃蛋白原單克 隆抗體，以及上述單克隆抗體在環(huán)境中雌性激素檢測(cè)中的用途。
此外，本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)環(huán)境中雌性激素的試劑盒，其中 包括上述稀有齣鯽卵黃蛋白原單克隆抗體，例如鼠源稀有齣鯽卵黃蛋白原 單克隆抗體。該試劑盒還可以包括標(biāo)記物標(biāo)記的二抗，例如標(biāo)記物標(biāo)記的羊抗 鼠二抗。其中，標(biāo)記物可以為酶、生物素、熒光素或膠體金，優(yōu)選為酶， 更優(yōu)選為辣根過(guò)氧化物酶。該試劑盒還包括鮑鯽卵黃蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控 血清、顯色劑和氧化劑。其中，所述顯色劑為鄰苯二胺和/或所述氧化劑為 過(guò)氧化氫。
上述試劑盒的制備方法具體包括以下步驟 (1)制備稀有鮑鯽卵黃蛋白原單克隆抗體； (2 )制備標(biāo)i己物標(biāo)^己的二抗；
(3 )將稀有齣鯽卵黃蛋白原單克隆抗體和標(biāo)記物標(biāo)記的二抗共同包 裝，制得試劑盒。
上述稀有鮑鯽卵黃蛋白原單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗 均可按照常規(guī)方法制備。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述用于檢測(cè) 環(huán)境中雌性激素的試劑盒包括可拆或不可拆的96孔酶標(biāo)板，稀有齣鯽卵 黃蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品、鼠源稀有鉤鯽卵黃蛋白原單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶 標(biāo)記的羊抗鼠二抗、鄰苯二胺和過(guò)氧化氫。
本發(fā)明所提供的含有稀有鮑鯽卵黃蛋白原單克隆抗體的試劑盒，可應(yīng) 用于定性/定量檢測(cè)稀有鮑鯽血清中的卵黃蛋白原，進(jìn)而檢測(cè)/評(píng)價(jià)環(huán)境雌 性激素效應(yīng)。在使用時(shí)，將已純化的卵黃蛋白原非特異的吸附在酶標(biāo)板上， 封閉多余的結(jié)合位點(diǎn)后，加入待測(cè)樣品與抗體預(yù)混溶液，溫育一段時(shí)間， 除去未結(jié)合的待測(cè)樣品與抗體；然后加入酶標(biāo)記二抗溫育一段時(shí)間，并除 去過(guò)量的酶標(biāo)二抗，最后加入顯色底物開(kāi)始酶促反應(yīng)，反應(yīng)終止后在特定 波長(zhǎng)下測(cè)定溶液的吸光度。溶液的吸光度值與待測(cè)樣品中卵黃蛋白原的含 量呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白對(duì)比操作，并擬合工作曲線，根據(jù)擬合方程 計(jì)算出待測(cè)血清樣品中卵黃蛋白原的相應(yīng)濃度。
綜上所述，本發(fā)明利用稀有齣鯽對(duì)雌激素類化合物的敏感性，基于間 接竟?fàn)幟嘎?lián)免疫吸附原理，提供了能夠穩(wěn)定的分泌稀有齣鯽卵黃蛋白原單 克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其所分泌的稀有鮑鯽卯黃蛋白原單克隆抗體能夠特異性識(shí)別稀有齣鯽卵黃蛋白原，通過(guò)用該單克隆抗體定性/定量檢測(cè) 稀有齣鯽血清中的卵黃蛋白原，來(lái)檢測(cè)/評(píng)價(jià)環(huán)境雌性激素效應(yīng)。據(jù)此所
制備的試劑盒，其靈敏度為2.6ng/mL，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性工作范圍為 3.9-2000ng/mL,操作簡(jiǎn)便、快速且樣品需要量少(視卵黃蛋白原含量而定， 零點(diǎn)幾微升至幾微升不等)，可降低水環(huán)境雌激素污染檢測(cè)的分析成本， 是一種新型的水環(huán)境雌激素污染檢測(cè)工具，為水環(huán)境雌激素類物質(zhì)的生物 效應(yīng)和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)研究提供了一種簡(jiǎn)便、高效、靈敏的新方法，具有廣 泛的應(yīng)用前景。
本發(fā)明提供的分泌稀有鮑鯽卵黃蛋白原單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系 RVM-3于2009年1月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心(CGMCC),其保藏編號(hào)為CGMCCNo.2869。


圖1A為稀有齣鯽血清與卵黃蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品SDS-PAGE結(jié)果圖； 圖1B為稀有齣鯽血清與卵黃蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品Western blotting結(jié)果圖； 1:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，箭頭所示為稀有齣鯽卵黃蛋白原對(duì)應(yīng)的分子量； 2，2，空白組雄性稀有齣鯽血清(稀釋20倍)；3,3，空白組雌性稀有齣 鯽血清(稀釋20倍)；4， 4，雌二醇誘導(dǎo)的雄性稀有齣鯽血清(稀釋20 倍)；5,5，稀有齣鯽卵黃蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品。
圖2為間接竟?fàn)嶦LISA方法檢測(cè)稀有齣鯽卵黃蛋白原的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所提供的稀有鮑鯽卵黃蛋白原單克隆抗體 及其應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1稀有鮑鯽卵黃蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品的誘導(dǎo)和純化 將10mg 17p-雌二醇(np-estradiol, E2 )溶于10mL曱醇中，配制濃 度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液。按照1L水lg魚(yú)的標(biāo)準(zhǔn)，將稀有齣鯽置于玻璃缸 中，加入適當(dāng)體積17(3-雌二醇儲(chǔ)備液，使17(3-雌二醇的最終濃度為100 ng/L,曱醇濃度不高于0.01 %。對(duì)稀有餉鯽的暴露采用半靜態(tài)的方式，每 曰換水。暴露21天后從稀有齣鯽尾部靜脈采集血液，于4。C離心獲得血清。 使用離子交換膜色譜(SartobindTMMA15 Q)純化血清中的卵黃蛋白原。 血清用磷酸鹽緩沖溶液(PBS, 20mM磷酸鹽緩沖液，含有0.16MNaCl,pH6.5)稀釋，并用0.22(im濾膜過(guò)濾。濾液通過(guò)預(yù)先用上述PBS平衡的陰離 子交換膜，沖洗掉未吸附的蛋白后，通過(guò)改變流動(dòng)相中NaCl的濃度，釆 用階梯式洗脫模式將陰離子交換膜上吸附的不同蛋白組分洗脫，于280nm 檢測(cè)。收集各個(gè)洗脫組分，通過(guò)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE，具體實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法》，李健武等合 編，北京大學(xué)出版社，2004)，確定各組分中是否含有卵黃蛋白原。對(duì)含 有卵黃蛋白原的洗脫液使用透析袋或超濾管脫鹽后凍干，制得卵黃蛋白原 凍干粉。
實(shí)施例2稀有齣鯽卵黃蛋白原單克隆抗體的制備
取適量卵黃蛋白原凍干粉，用去離子水溶解后，加入等體積弗氏完全 佐劑。乳化后，采用皮下多點(diǎn)注射的方式(0.2mL/點(diǎn))，初次免疫Ba舊/C 小鼠(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)。三周后，采用卵黃蛋白原加弗氏不完全佐 劑乳化抗原(劑量同上)，再次免疫小鼠。再間隔三周，不加佐劑，于生 理鹽水中腹腔注射抗原，七天后釆血測(cè)定效價(jià)，檢測(cè)免疫效果。兩周后加 強(qiáng)免疫，三天后，取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)融合(具 體方法見(jiàn)《細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，金伯泉主編，第四軍醫(yī)大學(xué)出 版社，2003 )。
融合后，將細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)，加入HAT培養(yǎng)基，置于C02培養(yǎng) 箱中37。C培養(yǎng)。培養(yǎng)兩周后取上清初篩陽(yáng)性孔。選取融合率達(dá)100%、陽(yáng) 性率達(dá)25%、 OD值在1.0以上的孔進(jìn)行亞克隆，用直接ELISA方法(具 體實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法》，李健武等合編，北京大學(xué)出 版社，2004)篩選陽(yáng)性克隆。擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，凍存部分細(xì)胞。部分注 入小鼠腹腔，制備含有抗體的腹水。含有抗體的腹水可直接用于ELISA檢 測(cè)，也采用辛酸-飽和硫酸銨法將腹水中的單克隆抗體純化(具體方法見(jiàn)《細(xì) 胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，金伯泉主編，第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2003 )。
采用SDS-PAGE和免疫蛋白印跡(Western blotting,具體實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn) 《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，J. Sambrook, E.F. Fritsch， T. Maniatis主 編，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，1989)檢測(cè)稀有齣鯽卵黃蛋白原單克隆抗體的特 異性，結(jié)果如圖1A和圖1B所示。圖中所示結(jié)果表明，所制得的單克隆抗 體特異性地與齣鯽卯黃蛋白原相結(jié)合，而不與血清中的其他蛋白相結(jié)合。實(shí)施例3稀有齣鯽卵黃蛋白原檢測(cè)試劑盒的制備 本發(fā)明提供的稀有鮑鯽卵黃蛋白原定量檢測(cè)試劑盒，包括以下成分
1) 空白酶標(biāo)板(l塊)，可以是可拆或不可拆的96孔酶標(biāo)板；
2) 標(biāo)準(zhǔn)品1支(10 jig稀有齣鯽卵黃蛋白原凍干粉)；
3) 卵黃蛋白原單克隆抗體(10pL),使用前稀釋32000倍；
4 )辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體(10 pL )，使用前稀釋10000
倍；
5)包被緩沖液(A)、樣品稀釋液(B)、底物緩沖液(C)、底物(D, 即顯色劑)、氧化劑(E)各1支；
6 )終止液(2mol/L H2S04) 10 mL;
其中，包被緩沖液(A)為0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6;樣品稀釋 液(B)為0.2 MPBS緩沖液，pH7.4,含0.05% Tween-20;酶標(biāo)板清洗 液與樣品稀釋液相同；封閉液為含1%牛血清白蛋白的包被緩沖液；底物 緩沖液(C )為磷酸鹽-檸檬酸緩沖液，pH 5.0;底物(D )為鄰苯二胺(OPD ); 氧化劑(E)為過(guò)氧化氫。
實(shí)施例4稀有鮑鯽卵黃蛋白原檢測(cè)試劑盒的使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所提供的稀有齣鯽卵黃蛋白原檢測(cè)試劑盒，其具體操作步驟如
下
(1 )在96孔酶標(biāo)板每孔中加入150 |aL用包被緩沖液稀釋了的稀有 鮑鯽卵黃蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品，室溫放置2小時(shí)后，轉(zhuǎn)移至4-C水箱中，包被過(guò) 夜(14-16小時(shí))。
(2 ) 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品濃度系列的準(zhǔn)備用樣品稀釋液稀釋樣品和標(biāo)準(zhǔn) 品，同時(shí)將卵黃蛋白原單克隆抗體用樣品稀釋液稀釋至合適濃度 (1:10000 1:30000);將稀釋后的樣品、標(biāo)準(zhǔn)品分別與稀釋后的上述抗體等 體積混合，37。C溫育2小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至4'C冰箱中過(guò)夜。以單克隆抗體 的稀釋液為陽(yáng)性對(duì)照，樣品稀釋液為試劑空白。
(3) 棄去酶標(biāo)板中液體，用清洗液洗板4次后，每孔加入300nL封 閉液，37。C封閉2小時(shí)。
(4) 棄去封閉液，每孔加入300 (iL清洗液，輕微震蕩1分鐘后棄 去清洗液，重復(fù)4次。
(5) 將配制好的樣品、標(biāo)準(zhǔn)品濃度系列、陽(yáng)性對(duì)照和試劑空白加入酶標(biāo)板內(nèi)，每孔150pL，并設(shè)置3個(gè)平行孔，37。C溫育2小時(shí)。 (6)棄去孔內(nèi)液體，按照步驟(4)洗涂酶標(biāo)板。
(7 )用樣品稀釋液稀釋酶標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體至合適濃度，每孔加 入150 37。C溫育2小時(shí)。
(8) 棄去酶標(biāo)板中酶標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體，按照步驟(4)洗滌酶標(biāo)板。
(9) 每孔加入100 iaL顯色底物(氧化劑終濃度為0.02 % )， 37 。C 暗處反應(yīng)10-30分鐘，待標(biāo)準(zhǔn)品加樣孔呈現(xiàn)明顯的黃色后，加入50iuL終 止液，終止反應(yīng)。
(10 )用酶標(biāo)儀于4卯nm處檢測(cè)吸光度。
(11 )以吸光度的Logit值(見(jiàn)公式①)為縱坐標(biāo)，稀有齣鯽卵黃
蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值(LgCvTO)為橫坐標(biāo)作圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬
合方程計(jì)算樣品吸光度相應(yīng)的卵黃蛋白原濃度。
「 & ) Logit少=ln -5——
H5J ①
其中，A為稀有鮑鯽卵黃蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品濃度系列各濃度對(duì)應(yīng)的吸光度，
5o為陽(yáng)性對(duì)照吸光度。
本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的靈敏度為2.6 ng/mL，其檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所
示，線性工作范圍為3.9-2000 ng/mL,測(cè)定時(shí)所需的樣品量極少(0.5-10
[iL)。間接竟?fàn)嶦LISA方法;f全測(cè)稀有齣鯽卵黃蛋白原的標(biāo)準(zhǔn)曲線為
;;=-2.36471 + 5.191,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9921 。所配制的稀有齣鯽卵黃蛋白
原標(biāo)準(zhǔn)品濃度系列為3.9、 7.8、 15.6、 31.2、 62.5、 125、 250、 500、 1000
和2000ng/mL，所使用的單克隆抗體為未經(jīng)純化的小鼠腹水。
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權(quán)利要求
1. 一種分泌稀有鮈鯽卵黃蛋白原單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其保藏編號(hào)為CGMCC No.2869。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞系的制備方法，其包括以下步驟(1) 制備稀有齣鯽卵黃蛋白原；(2) 采用稀有齣鯽卵黃蛋白原免疫BalB/C小鼠；(3 )取Bal B/C小鼠的B細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)包括以下步驟從長(zhǎng)時(shí)間暴露于含雌性激素水體中的稀有齣鯽的血清中提取卵黃蛋白原。
4. 權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞系分泌的稀有齣鯽卵黃蛋白原單克隆抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的單克隆抗體在環(huán)境中雌性激素檢測(cè)中的用途。
6. —種用于檢測(cè)環(huán)境中雌性激素的試劑盒，其中包括根據(jù)權(quán)利要求4所述的稀有鮑鯽卵黃蛋白原單克隆抗體，例如鼠源稀有齣鯽卵黃蛋白原單克隆抗體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)記物標(biāo)記的二 4元，例如標(biāo)"i己物標(biāo)i己的羊抗鼠二 4元。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)記物為酶、生物素、熒光素或膠體金，優(yōu)選為酶，更優(yōu)選為辣根過(guò)氧化物酶。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括齣鯽卵黃蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品；質(zhì)控血清；顯色劑和氧化劑。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述顯色劑為鄰苯二胺和/或所述氧化劑為過(guò)氧化氫。
全文摘要
本發(fā)明提供一種稀有鮈鯽卵黃蛋白原單克隆抗體及其應(yīng)用，該稀有鮈鯽卵黃蛋白原單克隆抗體是由保藏編號(hào)為CGMCC No.2869的雜交瘤細(xì)胞系所分泌的。本發(fā)明所提供的雜交瘤細(xì)胞系能夠穩(wěn)定的分泌稀有鮈鯽卵黃蛋白原單克隆抗體，所提供的包括該單克隆抗體的試劑盒可以簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏的定性/定量檢測(cè)稀有鮈鯽血清中的卵黃蛋白原，是一種簡(jiǎn)便、高效的檢測(cè)/評(píng)價(jià)環(huán)境雌性激素效應(yīng)的分析工具，具有廣泛的利用前景。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101519650SQ20091008081
公開(kāi)日2009年9月2日 申請(qǐng)日期2009年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月23日
發(fā)明者呂雪飛, 周群芳, 時(shí)國(guó)慶, 江桂斌, 駱文茹 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心