專利名稱：一種用于裂解液分析的整體床的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，屬于生物分子分析技術(shù)及色譜分 析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因治療和DNA疫苗在癌癥、單基因遺傳病、艾滋病、心血管疾病、關(guān)節(jié)炎等重大疾病 的診斷和治療方面的應(yīng)用研究正日益引起越來越廣泛的關(guān)注。目前質(zhì)粒逐漸成為基因治療的 最重要的基因傳遞系統(tǒng)，因此應(yīng)用于基因治療的藥用質(zhì)粒的大規(guī)模制備成為其基礎(chǔ)。而藥用 質(zhì)粒的大規(guī)模制備過程的關(guān)鍵之一在于如何監(jiān)測質(zhì)粒純度、監(jiān)測質(zhì)粒制備過程的性能，評價 最終產(chǎn)品質(zhì)量以及產(chǎn)品的規(guī)格等，這對于過程開發(fā)、認證、產(chǎn)品批準(zhǔn)非常重要。
典型的質(zhì)粒大規(guī)模制備過程包括發(fā)酵、細胞收獲、細胞裂解、澄清與濃縮和純化等步驟。 其中裂解步驟可以去除全部細胞碎片，去除部分gDNA、 RNA、蛋白等雜質(zhì)，所得到的裂解 液除了含有各種拓撲形態(tài)的質(zhì)粒異構(gòu)體、變性DNA (變性gDNA、變性質(zhì)粒)之外，仍含有 人量雜質(zhì)，如gDNA、高分子量RNA、低分子量RNA、蛋白、內(nèi)毒素等。該過程對質(zhì)粒收率 和質(zhì)粒產(chǎn)品的質(zhì)量影響很大，是目前研究者關(guān)注的焦點。在質(zhì)粒制備過程流分析中因堿裂解 液中雜質(zhì)含量高，其分析最為困難。
目前應(yīng)用于裂解液分析的色譜法包括反相色譜、疏水相互作用色譜、體積排阻和離子交 換色譜等多種模式。離子交換色譜在裂解液分析中應(yīng)用最為廣泛。應(yīng)用于裂解液分析過程的 陰離子交換型色譜介質(zhì)均為商業(yè)化產(chǎn)品，其中大多數(shù)是為蛋白質(zhì)分離分析而開發(fā)，主要有多 孔微球、灌注色譜填料、非多孔色譜填料和薄殼色譜填料等，為提高傳質(zhì)性能而開發(fā)的各種 新型色譜介質(zhì)是其中的主體。裂解液分析是質(zhì)粒制備過程流分析中重要且難于分析的部分。 因裂解是質(zhì)粒制備過程的第一個步驟，而且該步驟對質(zhì)粒的收率影響很大，該部分是目前質(zhì) 粒制備研究的重點之一。裂解液中通常除目標(biāo)質(zhì)粒外，還含有高分子量RNA、低分子量RNA、 gDNA、蛋白和內(nèi)毒素。將質(zhì)粒和蛋白、RNA、 gDNA等雜質(zhì)有效分離是色譜柱準(zhǔn)確定量質(zhì)粒 的前提。質(zhì)粒與蛋白和低分子量RNA的分離比較容易，但是質(zhì)粒與高分子量RNA的分離比較 困難，特別是未經(jīng)純化的裂解液，因樣品中高分子量RNA含量很高，與質(zhì)粒共洗脫形成寬峰， 一般的色譜柱均無法實現(xiàn)分離。為精確定量裂解液中質(zhì)粒含量，通常采用RNase酶解將高分 子量RNA降解為寡核苷酸。目前尚未見采用色譜柱直接對含有大量RNA樣品的裂解液進行分 析的報道。
3發(fā)明人在"Zhang M L, Sun Y. Poly(glycidyl methacrylate ~divinylbenzene -triallylisocyanurate) continuous-bed protein chromatography. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHYA. 2001,912(1): 31-38"和"張敏蓮，白姝，孫彥.聚(GMA-DVB-TAIC) 型連續(xù)床的制備及其對蛋白質(zhì)的色譜分離性能.離子交換與吸附，2003， 16(3) : 199 206"
中曾針對蛋白質(zhì)分離分析開發(fā)了聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯一二乙烯基苯一三聚異氰尿酸三 烯丙酯)型整體床，該整體床具有良好的親水性能。但由于該整體床針對蛋白分離分析開發(fā)， 整體床中的孔徑為l 2nm，雖然在蛋白分離中可以具有良好的傳質(zhì)性能，但因質(zhì)粒的長度可 達幾百納米，窄的部分可達十幾納米，而裂解液中還含有大量的高分子量雜質(zhì)，如高分子量 RNA和gDNA，因此該類型整體床在裂解液分析中傳質(zhì)性能差，易出現(xiàn)色譜柱堵塞，而無法 應(yīng)用于裂解液的分析。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前裂解液分析中需要對其進行預(yù)處理、傳質(zhì)性能差和色譜柱易污染的問題，本發(fā) 明的目的是提供一種具有適宜修飾密度、不易被污染、具有大量質(zhì)?？梢赃M入的孔道、傳質(zhì) 速度快，背壓低，可直接用于裂解液分析的整體床的合成方法。實現(xiàn)該發(fā)明的關(guān)鍵點在于控 制整體床的孔結(jié)構(gòu)和修飾密度，即選取適宜的聚合條件和修飾條件。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于該方法包括如下步驟
1) 將含有環(huán)氧端基的甲基丙烯酸酯類或含有環(huán)氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯(lián)劑、致 孔劑和引發(fā)劑混合，得到反應(yīng)混合物，其中
a. 所述交聯(lián)劑與單體的物質(zhì)的量的比為0.05 0.2;
b. 所述致孔劑用量占反應(yīng)混合物體積含量的40 80%;
c. 所述引發(fā)劑與單體的物質(zhì)的量的比為0.005 0.03;
2) 將上述反應(yīng)混合物超聲混和均勻，加入到色譜柱管中，原位聚合形成整體床，聚合 溫度控制在50 6(TC之間，反應(yīng)時間為12 72小時；
3) 聚合反應(yīng)結(jié)束后，利用有機溶劑沖洗整體床；
4) 利用溶于有機溶劑的胺類修飾劑對整體床進行改性，其中胺類修飾劑的體積含量為 25 75%，修飾溫度控制在50 6(TC之間，反應(yīng)時間為3 9小時；
5) 修飾反應(yīng)結(jié)束后，利用有機溶劑沖洗整體床。
上述技術(shù)方案中，所述交聯(lián)劑采用含有兩個雙鍵的化合物和三個雙鍵的化合物的混合 物，兩類交聯(lián)劑的物質(zhì)的量的比為0.25 4;所述的致孔劑采用飽和烷烴和芳烴中的至少一種； 所述的引發(fā)劑采用偶氮類物質(zhì)；所述的有機溶劑為醇類和環(huán)醚類中的任一種。
所述含有兩個雙鍵的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷和雙甲基丙烯酸乙二醇 酯中的任一種；所述含有三個雙鍵的化合物采用三聚異腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯和三甲基丙烯酸丙三醇酯中的任一種。所述偶氮類物質(zhì)采用偶氮二異丁腈和偶氮二異庚腈中的任一 種。所述飽和烴采用正庚烷、正辛垸和正壬垸中的任一種；所述芳烴采用甲苯、乙苯和二甲 苯中的任一種。所述醇類采用乙醇或甲醇；所述環(huán)醚類采用四氫呋喃或二噁烷。所述胺類修 飾劑采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一種。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)中裂解液分析方法相比，具有以下優(yōu)點及突出性效果該種類型的整 體床具有適宜的修飾密度、不易被污染、具有大量質(zhì)?？梢赃M入的孔道、傳質(zhì)速度快、背壓 低、可以對于未經(jīng)預(yù)處理的含有大量雜質(zhì)的裂解液進行多個批次的分析而分析柱性能無明顯 改變，在裂解液分析中具有良好的耐污染能力，分析過程方便快捷，成本低。
具體實施例方式
本發(fā)明提供一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于該方法包括如下歩驟:
1) 將含有環(huán)氧端基的甲基丙烯酸酯類或含有環(huán)氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯(lián)劑、致 孔劑和引發(fā)劑混合，得到反應(yīng)混合物，其中
a. 所述交聯(lián)劑與單體的物質(zhì)的量的比為0.05 0.2;
b. 所述致孔劑用量占反應(yīng)混合物體積含量的40 80%;
c. 所述引發(fā)劑與單體的物質(zhì)的量的比為0.005 0.03;
2) 將上述反應(yīng)混合物超聲混和均勻，加入到色譜柱管中，原位聚合形成整體床，聚合 溫度控制在50 6(TC之間，反應(yīng)時間為12 72小時；
3) 聚合反應(yīng)結(jié)束后，利用有機溶劑沖洗整體床；
4) 利用溶于有機溶劑的胺類修飾劑對整體床進行改性，其中胺類修飾劑的體積含量為 25 75%，修飾溫度控制在50 6(TC之間，反應(yīng)時間為3 9小時；
5) 修飾反應(yīng)結(jié)束后，利用有機溶劑沖洗整體床。 所述交聯(lián)劑采用含有兩個雙鍵的化合物和三個雙鍵的化合物的混合物，兩類交聯(lián)劑的物
質(zhì)的量的比為0.25 4;所述的致孔劑采用飽和烷烴和芳烴中的至少一種；所述的引發(fā)劑采用 偶氮類物質(zhì)；所述的有機溶劑為醇類和環(huán)醚類中的任一種。
所述含有兩個雙鍵的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷和雙甲基丙烯酸乙二醇 酯中的任一種；所述含有三個雙鍵的化合物采用三聚異腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯和三甲 基丙烯酸丙三醇酯中的任一種。所述偶氮類物質(zhì)采用偶氮二異丁腈和偶氮二異庚腈中的任一 種。所述飽和烴采用正庚垸、正辛烷和正壬烷中的任一種；所述芳烴采用甲苯、乙苯和二甲 苯中的任一種。所述醇類采用乙醇或甲醇；所述環(huán)醚類采用四氫呋喃或二噁垸。所述胺類修 飾劑采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一種。
利用合成的整體床進行裂解液分析的過程如下采用水和緩沖液A (10mMTris-HCl， lmMEDTA，pH8.0)沖洗整體床。所采用的溶液為緩沖液A，緩沖液B(緩沖液A+2MNaCl)。 鹽梯度為0-5min 30-50%緩沖液B; 5-5.01min 50-30%緩沖液B; 5.01-15min 30%緩沖液B。將裂解液加入到整體床中，在0.2 0.6 mol/L鹽濃度下將RNA和蛋白等雜質(zhì)從整體床中洗脫 下來，然后在0.7 1.0mol/L鹽濃度下將質(zhì)粒組分洗脫下來，從而實現(xiàn)對裂解液的分析。下面通過幾個具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例l:稱取單體甲基丙烯酸縮水&油酯、交聯(lián)劑二乙烯基苯和三聚異腈尿酸三烯丙酯(1:0.04:0.01 mol/mol/mol);致孔劑甲苯和正庚烷(致孔劑/反應(yīng)混合物80 vol%，甲苯/正庚烷3: 2vol/vol);引發(fā)劑偶氮二異丁腈(引發(fā)劑/單體0.005:1 mol/mo1)，混合均勻，裝入一端密封 的50x4.6mm不銹鋼管中，將另一端密封，于50。C反應(yīng)72小時。將整體床連接到泵上，乙醇 沖洗。然后利用二乙胺為修飾劑，溶劑采用乙醇，二乙胺的體積含量為25%，修飾反應(yīng)控制 在5(TC，反應(yīng)時間為9小時。反應(yīng)結(jié)束后，采用乙醇沖洗整體床。本發(fā)明所合成的整體床中 75%以上的孔其孔徑在十微米以上，整體床的修飾密度約為1.1mmol/g整體床。 實施例2:稱取單體甲基丙烯酸環(huán)氧乙酯、交聯(lián)劑雙甲基丙烯酸乙二醇酯和三乙烯基苯(l: 0.03:0.06 mol/mol/mol);致孔劑乙苯和正辛烷(致孔齊U/反應(yīng)混合物75 vol%，乙苯/正辛烷1: 1 vol/vol); 引發(fā)劑偶氮二異丁腈(引發(fā)劑/單體0.01:1 mol/mo1)，混合均勻，裝入一端密封的50x4.6mm 不銹鋼管中，將另一端密封，于55'C反應(yīng)36小時。將整體床連接到泵上，四氫呋喃沖洗。 然后利用二甲胺為修飾劑，溶劑采用四氫呋喃，二甲胺的體積含量為75%，修飾反應(yīng)控制在 6(TC，反應(yīng)時間為3小時。反應(yīng)結(jié)束后，采用四氫呋喃沖洗整體床。本發(fā)明所合成的整體床 中75%以上的孔其孔徑在十微米以上，整體床的修飾密度約為0.5mmol/g整體床。實施例3:稱取單體丙烯酸縮水甘油酯、交聯(lián)劑二乙烯基苯和三聚異腈尿酸三烯丙酯(1: 0.06:0.03 mol/mol/mo1);致孔劑二甲苯(致孔劑/反應(yīng)混合物60 vol% );引發(fā)劑偶氮二異庚腈(弓I發(fā)劑/ 單體0.02:1 mol/mo1)，混合均勻，裝入一端密封的50x4.6mm不銹鋼管中，將另一端密封， 于6(TC反應(yīng)12小時。將整體床連接到泵上，甲醇沖洗。然后利用乙胺為修飾劑，溶劑采用 甲醇，乙胺的體積含量為30%，修飾反應(yīng)控制在55'C，反應(yīng)時間為6小時。反應(yīng)結(jié)束后，采 用甲醇沖洗整體床。本發(fā)明所合成的整體床中75%以上的孔其孔徑在十微米以上，整體床的 修飾密度約為0.9mmol/g整體床。實施例4:稱取單體丙烯酸環(huán)氧乙酯、交聯(lián)劑二乙烯基苯基甲垸和三甲基丙烯酸丙三醇酯(1:0.04:0.16 mol/mol/mol);致孔劑正壬垸(致孔劑/反應(yīng)混合物40 vol%);引發(fā)劑偶氮二異庚腈 (引發(fā)劑/單體0.03:1 mol/mo1)，混合均勻，裝入一端密封的50x4.6mm不銹鋼管中，將另一 端密封，于6(TC反應(yīng)12小時。將整體床連接到泵上，二噁烷沖洗。然后利用乙二胺為修飾 劑，溶劑采用二噁烷，乙二胺的體積含量為50%，修飾反應(yīng)控制在55'C，反應(yīng)時間為4小時。反應(yīng)結(jié)束后，采用二噁烷沖洗整體床。本發(fā)明所合成的整體床中75%以上的孔其孔徑在十微 米以上，整體床的修飾密度約為0.7mmol/g整體床。
權(quán)利要求
1.一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于該方法包括如下步驟1)將含有環(huán)氧端基的甲基丙烯酸酯類或含有環(huán)氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑混合，得到反應(yīng)混合物，其中a.所述交聯(lián)劑與單體的物質(zhì)的量的比為0.05～0.2；b.所述致孔劑用量占反應(yīng)混合物體積含量的40～80％；c.所述引發(fā)劑與單體的物質(zhì)的量的比為0.005～0.03；2)將上述反應(yīng)混合物超聲混和均勻，加入到色譜柱管中，原位聚合形成整體床，聚合溫度控制在50～60℃之間，反應(yīng)時間為12～72小時；3)聚合反應(yīng)結(jié)束后，利用有機溶劑沖洗整體床；4)利用溶于有機溶劑的胺類修飾劑對整體床進行改性，其中胺類修飾劑的體積含量為25～75％，修飾溫度控制在50～60℃之間，反應(yīng)時間為3～9小時；5)修飾反應(yīng)結(jié)束后，利用有機溶劑沖洗整體床。
2. 按照權(quán)利要求1所述的一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于所 述交聯(lián)劑采用含有兩個雙鍵的化合物和三個雙鍵的化合物的混合物，兩類交聯(lián)劑的物質(zhì)的量的比為0.25 4;所述的致孔劑采用飽和烷烴和芳烴中的至少一種；所述的引發(fā)劑采用偶氮類物質(zhì)；所述的有機溶劑為醇類和環(huán)醚類中的任一種。
3. 按照權(quán)利要求2所述的一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于所 述含有兩個雙鍵的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲垸和雙甲基丙烯酸乙二醇酯中的 任一種；所述含有三個雙鍵的化合物采用三聚異腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯和三甲基丙烯 酸丙三醇酯中的任一種。
4. 按照權(quán)利要求2所述的一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于所 述偶氮類物質(zhì)采用偶氮二異丁腈和偶氮二異庚腈中的任一種。
5. 按照權(quán)利要求2所述的一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于所 述飽和烴采用正庚烷、正辛垸和正壬垸中的任一種；所述芳烴采用甲苯、乙苯和二甲苯中的 任一種。
6. 按照權(quán)利要求2所述的一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于所述醇類采用乙醇或甲醇；所述環(huán)醚類采用四氫呋喃或二噁烷。
7. 按照權(quán)利要求2所述的一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，其特征在于所述胺類修飾劑采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一種。
全文摘要
一種用于裂解液分析的整體床的合成方法，屬于生物分子分析和色譜分析技術(shù)領(lǐng)域。該方法將含有環(huán)氧端基的甲基丙烯酸酯類或含有環(huán)氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑混合，得到反應(yīng)混合物；然后將上述反應(yīng)混合物超聲混和均勻，加入到色譜柱管中，原位聚合形成整體床；聚合反應(yīng)結(jié)束后，利用有機溶劑沖洗整體床；利用溶于有機溶劑的胺類修飾劑對整體床進行改性；修飾反應(yīng)結(jié)束后，利用有機溶劑沖洗整體床。實現(xiàn)該發(fā)明的關(guān)鍵點在于控制整體床的孔結(jié)構(gòu)和修飾密度。采用本方法所合成的整體床在裂解液分析中可以對于未經(jīng)預(yù)處理的含有大量雜質(zhì)的裂解液進行分析，分析過程方便快捷，成本低。
文檔編號G01N30/00GK101625346SQ20091009037
公開日2010年1月13日 申請日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日
發(fā)明者張敏蓮, 青 徐, 花秀夫 申請人:清華大學(xué)