專利名稱：：甲型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種甲型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：目前甲型肝炎滅活疫苗的效力檢測使用小鼠體內(nèi)相對效力試驗法，檢測基本過程如下(1)將待檢疫苗每批多支混合后作2倍系列稀釋至l:64，試驗同時設(shè)立效力試驗參比品作為對照；(2)取1:4、1:16、1:64共3稀釋度接種小鼠，每個稀釋度接種小鼠10只，每只腹腔注射1.0ml，4周后采血，分離血清待測；(3)血清抗體測定使用甲型肝炎病毒抗體檢測試劑盒測定小鼠血清的抗-HAV抗體；(4)結(jié)果計算根據(jù)每個稀釋度抗體陽性及陰性的小鼠數(shù)，計算陽轉(zhuǎn)率，采用Reed-Muarch法進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算EDs。；(5)計算待檢樣品與參比品的效力比，作出判定。此方法檢測周期長達(dá)30余天，間接縮短了疫苗的有效期，增加了疫苗庫存壓力，這嚴(yán)重影響了疫苗的生產(chǎn)及銷售，且由于在動物體內(nèi)進(jìn)行試驗時，會因動物的種屬、窩別、年齡、體重、性別、健康狀況、飼養(yǎng)環(huán)境及飼料營養(yǎng)等諸多因素，直接影響到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性，不可避免地影響到檢測的重復(fù)性。所以需要對該檢測方法進(jìn)行改進(jìn)，使之滿足快速、靈敏、重復(fù)性好的要求，這將有利于提高檢測結(jié)果的可靠性，進(jìn)一步保證產(chǎn)品質(zhì)量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種甲型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，以取代傳統(tǒng)的小鼠體內(nèi)相對效力試驗，解決受試動物所帶來的影響因素多、重復(fù)性差、檢定周期長達(dá)30余天的不利因素，減少疫苗庫存量，延長疫苗的有效期，降低檢定成本及勞動強(qiáng)度。本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)一種甲型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，其特征在于經(jīng)過下列步驟A、將待檢的甲型肝炎滅活疫苗及參比的甲型肝炎滅活疫苗用常規(guī)PBS稀釋液進(jìn)行不同稀釋度的稀釋；B、將稀釋后的待檢甲型肝炎滅活疫苗及參比甲型肝炎滅活疫苗分別按不同的稀釋度加入酶標(biāo)板對應(yīng)的孔中，每個稀釋度的疫苗分別放2孔，放入量為50150ri/孔，同時在酶標(biāo)板的孔中加入對照用陽性抗原和陰性抗原，每個抗原各加入2孔，并留空白調(diào)零孔，放入濕盒中，于37"C保溫12小時后，洗板35次；C、按50150)4/孔的量，在B步驟的酶標(biāo)板的各孔中，加入稀釋度為1:5003000的長臂生物素標(biāo)記HAV抗體使用液，放入濕盒中，于37'C保溫0.51小時后，洗板35次；D、按50150W/孔的量，在C步驟的酶標(biāo)板的各孔中，加入稀釋度為1:200010000的辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素使用液，放入濕盒中，于37'C保溫0.51小時后，洗板35次；E、在D步驟的酶標(biāo)板各孔中，分別加入TMB顯色液A和B各50W/孔，混勻，放入濕盒中，37°C保溫1015分鐘；F、按50W/孔的量，在E步驟的酶標(biāo)板的各孔中加入終止液后置于酶標(biāo)儀上，在450nm波長下，用空白孔調(diào)零后檢測吸光度A值。根據(jù)檢測所得A值，進(jìn)行下列計算-1)以每個稀釋度的兩孔的A值相加得出待檢樣品的反應(yīng)值L、T2、T3、L和參比品的反應(yīng)值S,、S2、S3、S4，將各反應(yīng)值代入下列公式，計算相對效力R值R=D*antilg(IV/W)其中I=lg2=0.301，D=l，V=1/4(T,+T2+T3+T4-S,-S2-S3-S4)，W=l/20((T3—T2+S3—S2)+3(T4—T,+S4—S')〕2)待檢樣品與參比品的相對效力比值r的計算公式如下r=PT/Ps=R.AT/Ps(其中，PT=R.AT)其中PT為待檢品T測得的效價，Ar為待檢品T的標(biāo)示效價或估計效價，R為測得的效價等反應(yīng)劑量比值，Ps為參比品的效價。3)結(jié)果判斷r》0.85時，體外相對效力試驗合格。所述步驟A所述的不同稀釋度為1:8、1:16、1:32、1:64。所述C步驟的長臂生物素標(biāo)記HAV抗體經(jīng)下列方法制備a、按長臂生物素甲型肝炎病毒抗體二l:520克分子比的比例，將市購的長臂生物素用注射用水溶解后，與甲型肝炎病毒抗體混合，得混合體，于室溫下放置0.51.0小時，或28'C溫度下放置13小時；b、用磷酸緩沖液于28t溫度下透析上述a步驟的混合體并過夜，加等體積甘油混勻，得長臂生物素標(biāo)記HAV抗體，-2(rC以下保存?zhèn)溆?。所述D步驟的辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素為市購產(chǎn)品。所述洗板用PBS洗液在洗板機(jī)上洗板或者手工洗板。所述磷酸鹽緩沖液PBS、PBS洗液、PBS稀釋液、碳酸鹽緩沖液、終止液、TMB顯色液A和B、封閉液均為現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)用液。所述酶標(biāo)板預(yù)先經(jīng)過下列方法處理1)酶標(biāo)板包被將純化的HAV-IgG用碳酸鹽緩沖液PBS稀釋至5-20Pg/ml，按50150W/孔的量加入到聚苯乙烯板中，28。C過夜，洗板35次；2)酶標(biāo)板封閉按150250Pl/孔的量加入封閉液，28。C過夜，對酶標(biāo)板進(jìn)行封閉，洗板35次，晾干，冰箱保存?zhèn)溆?。本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果采用上述方案，徹底取代了傳統(tǒng)的小鼠體內(nèi)相對效力測試方法，解決了使用動物所帶來的影響因素多、重復(fù)性差、檢定周期長達(dá)30余天的不利因素，只需約3.5小時即可完成測試，減少了疫苗庫存量，間接延長了疫苗的有效期，降低了勞動強(qiáng)度，尤其在疫苗緊張時可多生產(chǎn)150-200萬支疫苗，可創(chuàng)產(chǎn)值4500-6000萬元。另外，本發(fā)明采用雙平行線生物檢定原理，提出的甲型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，使HAV病毒含量與相對應(yīng)A值的對數(shù)之間表現(xiàn)出良好的線性回歸，12均在0.97以上；檢測結(jié)果表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性及重復(fù)性，因此，是一種方便、快捷、可靠的測試方法。具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述。實施例1所用甲型肝炎滅活疫苗效力試驗參比品S為申請人嚴(yán)格按國家標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)，并經(jīng)理化及生物學(xué)檢驗達(dá)標(biāo)的合格產(chǎn)品，其效價Ps為640EU/ml;待檢的甲型肝炎滅活疫苗樣品T也是申請人嚴(yán)格按國家標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)的產(chǎn)品，其標(biāo)示效價&為640EU/ml。所用溶液如下1、磷酸鹽緩沖液PBS:磷酸氫二鈉58g，磷酸二氫鉀4g,氯化鈉160g，加注射用水至1000ml。2、PBS稀釋液將磷酸鹽緩沖液PBS用注射用水作20倍稀釋。3、PBS洗液將磷酸鹽緩沖液PBS用注射用水作20倍稀釋后，加入0.05%吐溫20。4、碳酸鹽緩沖液無水碳酸鈉1.6g，碳酸氫鈉2.93g，加注射用水至lOOOml。5、終止液濃硫酸54ml，加注射用水至500ml。6、TMB顯色液A:TMB50mg，二甲基亞砜50ml，加注射用水50ml。7、TMB顯色液B:醋酸鈉6g，雙氧水2.5ml，加注射用水至50ml。8、封閉液在1000ml磷酸鹽緩沖液PBS中，加入20克牛血清白蛋白，溶解混勻。9、裂解液20%二乙醇胺1.25ml，10%TritonX1000.2ml，0.Olmol/LPBS(pH7.40)8.55ml。長臂生物素標(biāo)記HAV抗體的制備1)按長臂生物素甲型肝炎病毒抗體=1:10克分子比的比例，將市購的長臂生物素用注射用水溶解后，與甲型肝炎病毒抗體混合，得混合體，于室溫下放置0.5小時；2)用磷酸緩沖液PBS于5t溫度下透析上述a步驟的混合體并過夜，加等體積甘油混勻，得長臂生物素標(biāo)記HAV抗體，-2(TC以下保存?zhèn)溆?。酶?biāo)板預(yù)先經(jīng)過下列方法制備1)酶標(biāo)檢測板包被將純化HAV-IgG用碳酸鹽緩沖液稀釋至10Pg/ml，按100W/孔的量加入到聚苯乙烯板中，5T:過夜，用PBS洗液在洗板機(jī)上洗板5次；2)酶標(biāo)檢測板封閉按200W/孔的量加入封閉液，5'C過夜，對酶標(biāo)板進(jìn)行封閉，用PBS洗液在洗板機(jī)上洗板5次，晾干，冰箱保存?zhèn)溆?；具體測試1、將甲型肝炎滅活疫苗待檢樣品T及甲型肝炎滅活疫苗效力試驗參比品S，加入等體積裂解液，室溫下裂解30分鐘；2、將甲型肝炎滅活疫苗待檢樣品T和甲型肝炎滅活疫苗參比品S分別用PBS稀釋液進(jìn)行下列稀釋，稀釋度為1:8、1:16、1:32、1:64;3、用微量移液器量將稀釋后的甲型肝炎滅活疫苗待檢樣品T及甲型肝炎滅活疫苗參比品S從高稀釋度開始依次加入酶標(biāo)板中，每個稀釋度加2個孔，100W/孔，同時加入抗原陽性、陰性對照各2個孔，設(shè)空白調(diào)零孔1孑L放入濕盒中，37t:保溫2小時，用PBS洗液洗板5次；4、在上述酶標(biāo)板的各個孔中加入稀釋度為1:800的生物素標(biāo)記HAV抗體使用液，100W/孔，放入濕盒中，37'C保溫0.5小時，用PBS洗液洗板5次；5、在上述酶標(biāo)板的各個孔中加入稀釋度為1:4000的辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素使用液，100W/孔，放入濕盒中，37"C保溫0.5小時，用PBS洗液洗板5次；6、在上述酶標(biāo)板的各個孔中加入TMB顯色液A、B液各50W/孔，混勻，放入濕盒中，37'C保溫10分鐘；7、在上述酶標(biāo)板的各個孔中加入終止液，50yl/孔，置于酶標(biāo)儀上，在450nm波長下，用空白孔調(diào)零后測吸光度A值，得表l數(shù)據(jù)表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>陽性對照平均A值(1.845)—陰性對照平均A值(0.055)》0.4本次試驗成立;8、以每個稀釋度2復(fù)孔的A值相加作為反應(yīng)值，將各反應(yīng)值代入公式，計算效價<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>9、相對效力值(R)計算公式R=D*antilg(IV/W)其中I=lg2=0.301，D=l，V=1/4(T,+T2+T3+T4—S「S2—S3—S4)W=l/20〔(T3—T2+S3—S2)+3(^—1+S4—SJ)按公式計算得V=0.590W=0.9247R=lg_'0.192=1.55510、樣品與參比品的相對效力比值(r)計算r=PT/Ps(其中PT=R.AT)=R.AT/Ps=1.555X640(EU/ml)/640(EU/ml)=1.555結(jié)果判定r=l.555^0.85，體外相對效力試驗合格。1.檢測樣品含量與反應(yīng)值的線性關(guān)系評價用本發(fā)明的方法對甲型肝炎病毒抗原進(jìn)行檢測，以樣品稀釋度(1:81:1024)的對數(shù)值為橫座標(biāo)、相對應(yīng)A值及A值的對數(shù)為縱座標(biāo)進(jìn)行直線回歸分析，所有樣品均表現(xiàn)出良好的線性回歸，特別是樣品稀釋度的對數(shù)值為橫座標(biāo)與A值的對數(shù)之間具有高度的相關(guān)性，其4點(diǎn)法R2(絕對指數(shù))均在0.97以上，平均值為0.990，可以用于建立生物檢定方法。R2如表l所示。2.雙平行線檢測方法的可靠性檢驗根據(jù)線性回歸分析結(jié)果，取線性最好的4點(diǎn)進(jìn)行分析，建立雙平行線檢定方法。按統(tǒng)計分析的基本要求，雙平行線(4，4)檢定方法應(yīng)為直線回歸非常顯著(p<0.01=，偏離平行、二次曲線及反向二次曲線三個參數(shù)檢驗均應(yīng)為不顯著(p〉0.05)。本所建立的4.4復(fù)孔檢測法Hl，8)0.01=11.26，8)0.05=5.32即當(dāng)26時，p<0.01，非常顯著；尸<5.32時，p>0.05，不顯著。滿足以上條件時驗證通過。對本所建立的效力試驗參比品(批號200501和20060301、20060303、20060303批)滅活疫苗進(jìn)行三批樣品三人次檢測，對本發(fā)明體外相對效力試驗方法進(jìn)行驗證(表2)，對同批次效力試驗r值分析(表3)，并與常規(guī)相對效力試驗結(jié)果進(jìn)行比較，驗證結(jié)果顯示本發(fā)明體外相對效力試驗方法可以通過可靠性驗證。表1.HAAg含量與A值線性回歸分析比較樣品批號A值均數(shù)8點(diǎn)直線R2A值均數(shù)對數(shù)4點(diǎn)直線R2200603010.9550.977第一次200603020.9580.995檢測結(jié)果200603030.9580.9900501標(biāo)10.9600.995200603010.9430.979第二次200603020.9280.979檢測結(jié)果200603030.9470.9920501標(biāo)20.9510.984200603010.9580.997第三次200603020.9570.998檢測結(jié)果200603030.9540.9980501標(biāo)30.9480.995最大值0.9600.998最小值0.9280.977結(jié)果分析平均值0.9510.990S0.0090.008cv1%0.8%注4點(diǎn)為1:8-1:64;8點(diǎn)為1:8-1:1024。本發(fā)明體外相對效力試驗進(jìn)行了3批3人次檢測均通過驗證，其R值在27次檢測結(jié)果中，同批次r值CVM分別為20060301:12.32%、20060302:7.69%、20060303:5.48%表明檢測結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性較好。所有批次的R值最大為1.43，最小為0.849，平均1.026，標(biāo)準(zhǔn)差為0.169。表2.雙平行線可靠性驗證次批號分回歸偏離平二次曲反二次曲驗證結(jié)3.應(yīng)用效果評價用現(xiàn)有的方法檢測2006年、2007、2008年3年產(chǎn)品，同時與本發(fā)明體內(nèi)相對效力試驗結(jié)果進(jìn)行應(yīng)用比較(表4)。從表4可以看出，三年樣品體外相對效力試驗r值的標(biāo)準(zhǔn)差及CV值均低于體內(nèi)相對效力試驗，表明本發(fā)明體外相對效力試驗更穩(wěn)定，重復(fù)性更好。200603012006030220060303PFPF2029.16尸<0.011763.17尸<0.01476.107尸<0.010.551/>0.055.231P>0.050,117P〉0.054.087K>0.054.138/^O.050.427P〉0.050.017/^0.050.011冷0.050.179/^>0.05通過驗證通過驗證通過驗證200603012006030220060303PFPF2086.79尸<0.011646.07尸<0.011930.91<0.010.287050.827/^0.053.537/^>0.050.111/^>0.050.671Z^X).050.016/^>0.050.065/^>0.050.562/^X).0550.00305通過驗證通過驗證通過驗證200603012006030220060303PFPF1485.07<0.01992.095p<0.01487.286;<0.010.874/^>0.050.001/^0.053.515/^>0.054.096P〉0.050.91P〉0.050.337/^0.050.233/^0.050.114/^X).050.16105通過驗證通過驗證通過驗證第一次檢測結(jié)果第一一次檢測結(jié)果第三次檢測結(jié)果表3同批次效力試驗r值分析<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表4體外相對效力試驗與體內(nèi)相對效力試驗r值統(tǒng)計分析<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>綜合22批疫苗體外相對效力待檢品與參比品的相對效力比值(r值)范圍0.801-1.659，平均1.083,建議體外相對效力試驗的判定標(biāo)準(zhǔn)為平均r值±IS值(O.851.30)，即甲型肝炎滅活疫苗體外相對效力r值應(yīng)不低于0.85(r》0.85)。以r》0.85作為判定標(biāo)準(zhǔn)，將15批疫苗用本發(fā)明的體外相對效力試驗與體內(nèi)相對效力試驗同步進(jìn)行檢驗，結(jié)果與體內(nèi)效力試驗一致，15批疫苗2種方法檢驗全部為合格品(表5)。表52008年疫苗體外相對效力與體內(nèi)相對效力試驗結(jié)果對比批號體內(nèi)相對效力r體外相對效力r200801011.070.87200802011.110.91200802030.870.96200804010.940.86200804020.850.85200805010.850.86200805030.820.86200807011.100.92200807031.201.11200807051.100.88200807071.200.85200807091.400.96200810010.900.93最大值1.401.11最小值0.820.85平均值1.030.90S0.1760.072cv17.06%8.02%1S+1.2080.9731S-0.8550.8282S+1.3841.0532S-0.6790.75權(quán)利要求1、一種甲型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，其特征在于經(jīng)過下列步驟A、將待檢的甲型肝炎滅活疫苗及參比的甲型肝炎滅活疫苗用常規(guī)PBS稀釋液進(jìn)行不同稀釋度的稀釋；B、將稀釋后的待檢甲型肝炎滅活疫苗及參比甲型肝炎滅活疫苗分別按不同的稀釋度加入酶標(biāo)板對應(yīng)的孔中，每個稀釋度的疫苗分別放2孔，放入量為50～150μl/孔，同時在酶標(biāo)板的孔中加入對照用陽性抗原和陰性抗原，每個抗原各加入2孔，并留空白調(diào)零孔，放入濕盒中，于37℃保溫1～2小時后，洗板3～5次；C、按50～150μl/孔的量，在B步驟的酶標(biāo)板的各孔中，加入稀釋度為1∶500～3000的長臂生物素標(biāo)記HAV抗體使用液，放入濕盒中，于37℃保溫0.5～1小時后，洗板3～5次；D、按50～150μl/孔的量，在C步驟的酶標(biāo)板的各孔中，加入稀釋度為1∶2000～10000的辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素使用液，放入濕盒中，于37℃保溫0.5～1小時后，洗板3～5次；E、在D步驟的酶標(biāo)板各孔中，分別加入TMB顯色液A和B各50μl/孔，混勻，放入濕盒中，37℃保溫10～15分鐘；F、按50μl/孔的量，在E步驟的酶標(biāo)板的各孔中加入終止液后置于酶標(biāo)儀上，在450nm波長下，用空白孔調(diào)零后檢測吸光度A值。2、如權(quán)利要求l所述的甲型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，其特征在于所述步驟A所述的不同稀釋度為1:8、1:16、1:32、1:64。3、甲型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，其特征在于所述C歩驟的長臂生物素標(biāo)記HAV抗體經(jīng)下列方法制備a、按長臂生物素甲型肝炎病毒抗體二l:520克分子比的比例，將市購的長臂生物素用注射用水溶解后，與甲型肝炎病毒抗體混合，得混合體，于室溫下放置0.51.0小時，或28匸溫度下放置13小時；b、用磷酸緩沖液于28'C溫度下透析上述a步驟的混合體并過夜，加等體積甘油混勻，得長臂生物素標(biāo)記HAV抗體，-2(TC以下保存?zhèn)溆谩?、甲型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，其特征在于所述D步驟的辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素為市購產(chǎn)品。5、甲型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，其特征在于所述洗板用PBS洗液在洗板機(jī)上洗板或者手工洗板。6、甲型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，其特征在于所述磷酸鹽緩沖液PBS、PBS洗液、PBS稀釋液、碳酸鹽緩沖液、終止液、TMB顯色液A和B、封閉液均為現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)用液。7、甲型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，其特征在于所述酶標(biāo)板預(yù)先經(jīng)過下列方法處理1)酶標(biāo)板包被將純化的HAV-IgG用碳酸鹽緩沖液PBS稀釋至5-20Pg/ml，按50150W/孔的量加入到聚苯乙烯板中，28。C過夜，洗板35次；2)酶標(biāo)板封閉按150250W/孔的量加入封閉液，28'C過夜，對酶標(biāo)板進(jìn)行封閉，洗板35次，晾干，冰箱保存?zhèn)溆?。全文摘要本發(fā)明提供一種甲型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法。徹底取代了傳統(tǒng)的小鼠體內(nèi)相對效力測試方法，解決了使用動物所帶來的影響因素多、重復(fù)性差、檢定周期長達(dá)30余天的不利因素，只需約3.5小時即可完成測試，減少了疫苗庫存量，間接延長了疫苗的有效期，降低了勞動強(qiáng)度，尤其在疫苗緊張時可多生產(chǎn)150-200萬支疫苗，可創(chuàng)產(chǎn)值4500-6000萬元。另外，本發(fā)明采用雙平行線生物檢定原理，提出的甲型肝炎滅活疫苗體外相對效力測試方法，使HAV病毒含量與相對應(yīng)A值的對數(shù)之間表現(xiàn)出良好的線性回歸，R²均在0.97以上；檢測結(jié)果表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性及重復(fù)性，因此，是一種方便、快捷、可靠的測試方法。文檔編號G01N33/531GK101556285SQ200910094509公開日2009年10月14日申請日期2009年5月22日優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日發(fā)明者霞宋,華李,蓉楊,超洪,白惠珠,謝忠平,陳洪波,鎧黃,龍潤?quán)l(xiāng)申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所