專利名稱：基于衍生法同時檢測人體尿液中可的寧、苯乙醇酸和苯乙醛酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種基于衍生法的同時檢測人 體尿液中可的寧、苯乙醇酸和苯乙醛酸的方法。
背景技術(shù)：
苯乙烯經(jīng)P450酶系作用，其主要代謝產(chǎn)物苯乙醇酸和苯乙醛酸可以作為苯 乙烯人體內(nèi)劑量的生物標(biāo)志物。而苯乙烯廣泛用于工業(yè)中，對大氣，水和土壤 都有污染，在生活中主要由于汽車尾氣的污染而使人們吸入苯乙烯。隨著高分 子工業(yè)的發(fā)展，接觸苯乙烯的工人不斷增多。苯乙烯的化學(xué)結(jié)構(gòu)與致突變劑和 致癌劑氯乙烯相似，經(jīng)代謝活化也是一種潛在的致突變劑，其體內(nèi)中間代謝產(chǎn) 物7， 8-環(huán)氧苯乙烯則為強(qiáng)直接致突變劑?？傻膶幨侨梭w吸入煙草煙霧中尼古丁 后的主要代謝產(chǎn)物。它的半衰期較長，而且受飲食因素的影響較小，可以作為 吸煙環(huán)境影響的生物標(biāo)志物，是判斷煙草煙霧吸入量比較客觀的實(shí)驗(yàn)室指 標(biāo)。我國學(xué)者一項(xiàng)研究用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法估算中國人群中因被動吸煙導(dǎo)致肺癌和冠 心病的死亡人數(shù)。結(jié)果表明，在2002年，UOOO人因被動吸煙而死于肺癌，31300 人因被動吸煙死于冠心病，估計(jì)因被動吸煙死亡人數(shù)超過10萬。與發(fā)達(dá)國家相 比，中國女性吸煙率并不高，但由于男性吸煙率居高不下，超過一半的婦女每 日生活在二手煙霧環(huán)境中，成為被動吸煙的主要受害人群。報告指出，家庭、 公共場所和工作場所都是接觸"二手煙"的地點(diǎn)。根據(jù)2002年的一項(xiàng)調(diào)查，被 動吸煙人群中，有82%是在家庭中接觸"二手煙"，67%是在公共場所，35%是 在工作場所。
鑒于環(huán)境污染的形勢非常嚴(yán)峻，建立環(huán)境污染對人體危害的預(yù)警體系非常 有必要。學(xué)術(shù)界對污染物質(zhì)檢測的研究非常多，但多集中在環(huán)境外暴露測量。 上個世紀(jì)末，學(xué)者研究通常是對環(huán)境樣本(空氣、土壤和水)中單個或多個污 染物質(zhì)進(jìn)行檢測，是環(huán)境監(jiān)理實(shí)施監(jiān)督管理的耳目和手段，著重檢測環(huán)境樣品
4中污染物質(zhì)的含量以此間接評價其對人體健康的影響。這在環(huán)境衛(wèi)生學(xué)中屬于 環(huán)境外暴露劑量研究。近十年，對人體內(nèi)某些污染物質(zhì)的檢測逐漸增多，涉及 的物質(zhì)越來越廣泛，包括芳香族化合物、農(nóng)藥、獸藥、食品添加劑和環(huán)境激素 等等。這在環(huán)境衛(wèi)生學(xué)中屬于環(huán)境內(nèi)暴露劑量研究。對于環(huán)境外暴露的檢測， 由于每個人接觸到的環(huán)境污染物質(zhì)種類、污染水平和污染程度是不同的，另外 人體對這些污染物質(zhì)的敏感程度也不一樣，環(huán)境污染對人體傷害的潛伏期又較 長，很難從直覺來感知其污染的程度，所以往往出現(xiàn)"身在毒中不知毒"的情 況。而環(huán)境內(nèi)暴露檢測通常是對大量人群體內(nèi)某種或某一類污染物質(zhì)的分布進(jìn) 行測定，能夠避免個體差異的影響，真實(shí)客觀地反映人體污染物質(zhì)的暴露水平。 作為內(nèi)暴露的檢測樣本主要有血樣，組織樣本和尿樣。而尿樣作為內(nèi)暴露的檢
測樣本，對人體無損傷，取樣方便，易獲得?？捎糜谂R床上大規(guī)模的體檢排查。 通過查閱文獻(xiàn)我們發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)學(xué)者對環(huán)境污染物尼古丁，苯乙烯內(nèi)暴
露代謝物的研究所采用的方法有很多，包括GC、 HPLC、 GC-MS、薄層色譜法、酶 聯(lián)免疫吸附法等等；方法中使用的儀器型號也種類不一，以GC-MS為例，使用 日本島津GC-14A和美國安捷倫6890N-5973MSD等的兼而有之；并無專門的機(jī)構(gòu) 對環(huán)境污染物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的人體內(nèi)暴露進(jìn)行檢測。大部分研究致力于對單 項(xiàng)污染物質(zhì)進(jìn)行檢測，同種物質(zhì)采用的方法也不盡相同，而且關(guān)注重點(diǎn)在于提 高污染物質(zhì)的回收率，忽視了檢測種類的全面性和綜合性，檢測成本較高，難 以系統(tǒng)化全面評價人體的污染物接觸程度，不利于產(chǎn)業(yè)化推廣到普通人群。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種方法簡便、快捷、結(jié)果可靠、自動 化程度高、便于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的基于衍生法同時檢測人體尿液中可的寧、苯乙醇 酸和苯乙醛酸的方法。
本發(fā)明方法是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的其特征在于包括以下步驟-
第一步，將收集的尿液離心后保存；
第二步，取第一步得到的尿液，加入內(nèi)標(biāo)苯甲酮，二苯胺，鹽酸并加入氯 仿，蝸旋，離心進(jìn)行萃取，吸出有機(jī)相記為A，剩余液待用；第三步，取第二步中的剩余液，加入氫氧化鈉溶液和氯仿，蝸旋，離心進(jìn) 行第二次萃取，吸出有機(jī)相記為B;
第四步，混合第二步中萃取出的有機(jī)相A和第三步中萃取出的有機(jī)相B于 玻璃管中，然后吹干；
第五步，在第四步的玻璃管中加入乙腈復(fù)溶，并且加入衍生化試劑進(jìn)行衍 生化反應(yīng)；
第六步取第五步中的反應(yīng)液用于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定。 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)-
1. 本發(fā)明采用尿樣作為檢測樣本，對人體無損傷，方便且易獲得。
2. 在面對同樣的環(huán)境污染條件下，個人受損傷程度并不一致。本發(fā)明致力 于對人環(huán)境污染物質(zhì)內(nèi)暴露(尿樣)水平的測定，能真實(shí)反映暴露水平和個人 損傷程度。不僅反映了多種途徑暴露的總水平，而且能避免由環(huán)境外暴露劑量 估計(jì)暴露水平時吸收率的個體差異性的影響。
3. 用氣質(zhì)聯(lián)用檢測樣本，檢測靈敏度高，能定性定量，為檢測低濃度代謝 物提供條件，并且其自動化檢測更容易進(jìn)行大批量的測定。方法方便，快捷， 準(zhǔn)確。
4. 本發(fā)明以盡可能少的步驟同時檢測可的寧、苯乙醇酸和苯乙醛酸，檢測 成本低，能系統(tǒng)化全面評價人體的污染物接觸程度，有利于產(chǎn)業(yè)化推廣到普通 人群。
5. 本發(fā)明通過同時檢測可的寧、苯乙醇酸和苯乙酸酸內(nèi)暴露對人的健康危 害，建立這兩種污染物內(nèi)暴露對健康危害程度評價的參考標(biāo)準(zhǔn)。通過這個檢測 方法的建立，人們能對自身健康進(jìn)行評價，知道這些環(huán)境污染物對自己的危害 程度，為診斷或預(yù)測其患有某種疾病的可能性和發(fā)展趨勢提供科學(xué)依據(jù)。
6. 在同時檢測可的寧、苯乙醇酸和苯乙醛酸內(nèi)暴露健康危害的同時，還進(jìn) 行跟蹤和干預(yù)。對有安全隱患的個體進(jìn)行飲食、作息、生活習(xí)慣等等各種因素 的調(diào)整，把威脅隱患降到最低。
7. 本發(fā)明能夠結(jié)合尿樣提供者的遺傳史、家族史、患病史以及飲食、作息、
6生活習(xí)慣等等各種因素，以及當(dāng)?shù)氐呐R床資料，從更為長遠(yuǎn)的時間角度，診斷 或預(yù)測其患有某種疾病的可能性和發(fā)展趨勢，并且能對其進(jìn)行跟蹤與干預(yù)，達(dá) 到提高人們生活質(zhì)量的效果。


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圖1是本發(fā)明實(shí)施例1所得用氯仿萃取衍生1號人體尿液所得氣相質(zhì)譜選 擇離子流圖。
圖2是本發(fā)明實(shí)施例1所得用氯仿萃取衍生2號人體尿液所得氣相質(zhì)譜選 擇離子流圖。
圖3是本發(fā)明實(shí)施例1所得用氯仿萃取衍生3號人體尿液所得氣相質(zhì)譜選 擇離子流圖。
圖4是本發(fā)明實(shí)施例2調(diào)整生活習(xí)慣后所得用氯仿萃取衍生人體尿液所得 氣相質(zhì)譜選擇離子流圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明方法的各個步驟如下
第一步，將收集的尿液離心后保存，保存溫度為-20 。C;
第二步，取第一步得到的尿液，加入內(nèi)標(biāo)苯甲酮，二苯胺，鹽酸并加入氯
仿，蝸旋，離心進(jìn)行萃取，吸出有機(jī)相記為A;
所述取尿液體積為lml，所述苯甲酮加入量為5ul，濃度為2mg/ml， 二苯胺 加入量為50ul，濃度為2mg/ml，鹽酸加入量為100ul，濃度為1. 2M，氯仿用量 為lml，所述蝸旋轉(zhuǎn)速為1500rpm，時間為5min，所述離心轉(zhuǎn)速為2500rpm，時 間為4min;
第三步，取第二步中的剩余液，加入氫氧化鈉溶液和氯仿，蝸旋，離心進(jìn) 行第二次萃取，吸出有機(jī)相記為B;
所述氯仿用量為lml，所述氫氧化鈉溶液加入量為130ul，濃度為1M;所述 蝸旋轉(zhuǎn)速為1500rpm,時間為5min，所述離心轉(zhuǎn)速為2500rpm，時間為4min;
第四步，混合第二步中萃取出的有機(jī)相A和第三步中萃取出的有機(jī)相B于 玻璃管中，然后吹干；第五步，在第四步的玻璃管中加入乙腈復(fù)溶，并且加入衍生化試劑進(jìn)行衍 生化反應(yīng)；
所述乙腈用量為50ul;所述衍生化試劑為硅垸化試劑，加入量為50ul，衍 生化溫度為5(TC，衍生化時間為30min;
第六步取第五步中的反應(yīng)液采用氣相色譜質(zhì)譜分析儀進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜
聯(lián)用測定；
所取反應(yīng)液的進(jìn)樣體積為1 5Ul，優(yōu)選lul;
所述用于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定的色譜條件為色譜柱選擇中等極性或非
極性色譜柱中的一種，優(yōu)選DB-5ms柱；所述氣相色譜質(zhì)譜分析儀的進(jìn)樣口溫度 在250 °C 280 °C ，最佳溫度為270 °C;
所述用于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定的質(zhì)譜條件為電離方式為E1源電離，電 離電壓為40 70eV ，最佳電壓為70eV;離子源溫度在220 250°C 。最佳溫度 為230。C。
實(shí)施例1 —
取-20 "C保存的3份尿樣，分別標(biāo)記為1、 2、 3號，自然解凍后離心，分 別同時進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)操作步驟取上清尿樣lml，加5ul 2mg/ml的苯甲酮，50ul 2mg/ml的二苯胺，再加100ul 1. 2M的HCL ，用lml氯仿萃取，1500rpm渦旋 5min， 再2500rpm離心4min，然后取有機(jī)相A;在剩余液中再加130ul 1M的 氫氧化鈉，用lml氯仿進(jìn)行第二次萃取，1500rpm渦旋5min，再2500rpm離心 4min，取有機(jī)相B?；旌蟽捎袡C(jī)相A和B與同一玻璃管中，吹干；然后加50ul 乙腈復(fù)溶，再加50ul衍生化試劑MSTFA， 5CTC，衍生化30min。取lul反應(yīng)液 用于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定；GC/MS條件為采用DB-5ms柱，EI離子源，電壓 為70eV，離子源溫度為23(TC，進(jìn)樣口溫度為270 °C;采用SIM方式采集實(shí)驗(yàn)
結(jié)果；結(jié)果如附圖l、 2、 3所示；其中圖1為1號尿樣SIM色譜圖，從中分 析出了可的寧；圖2為2號尿樣SIM色譜圖，從中分析出了苯乙醇酸和苯乙醛 酸；圖3為3號尿樣SIM色譜圖，從中同時分析出了可的寧、苯乙醇酸和苯乙醛酸。
8實(shí)施例2
對3號人的飲食、生活習(xí)慣進(jìn)行調(diào)整后，重新取3號人尿樣，進(jìn)行以下實(shí) 驗(yàn)操作步驟取上清尿樣lml，力n 5ul 2mg/ml的苯甲酮，50ul 2mg/ml的二苯 胺，再加100ul 1. 2M的HCL ，用lml氯仿萃取，1500rpm渦旋5min，再2500rpm 離心4min，然后取有機(jī)相A;在剩余液中再加130ul 1M的氫氧化鈉，用lml氯 仿迸行第二次萃取，1500rpm渦旋5min，再2500rpm離心4min，取有機(jī)相B。 混合兩有機(jī)相A和B與同一玻璃管中，吹干；然后加50ul乙腈復(fù)溶，再加50ul 衍生化試劑MSTFA， 50°C，衍生化30min;取lul反應(yīng)液用于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用 測定。GC/MS條件為采用DB-5ms柱，EI離子源，電壓為70eV,離子源溫度為 230°C，進(jìn)樣口溫度為270 °C;采用SIM方式釆集實(shí)驗(yàn)結(jié)果；結(jié)果如附圖4所示 從中我們可以看出原本有可的寧、苯乙醇酸和苯乙醛酸監(jiān)測到，現(xiàn)在都沒有被 檢測到，說明改善了飲食、生活習(xí)慣后，降低了受這兩種污染物污染的可能性， 同時降低了受這兩種污染物威脅的隱患。
本發(fā)明所述的基于衍生法同時檢測人體尿液中可的寧、苯乙醇酸和苯乙醛 酸的方法可用于人體尿液中可的寧的檢測，也可以用于人體尿液中苯乙醇酸和 苯乙醛酸的檢測，還可以用于同時檢測人體尿液中可的寧、苯乙醇酸和苯乙酵 酸。通過對人體樣本的檢測，反映個體的尼古丁和苯乙烯的內(nèi)暴露情況，可以 預(yù)防尼古丁和苯乙烯這兩種環(huán)境污染物對人造成的危害和疾病，從而說明個體 的環(huán)境污染物接觸情況，提示個體改善生活習(xí)慣方式，減少污染物的接觸，提 高健康水平。同時本方法還可以作為環(huán)境監(jiān)測的指標(biāo)，來對人們的居住環(huán)境進(jìn) 行評價。
權(quán)利要求
1、基于衍生法同時檢測人體尿液中可的寧、苯乙醇酸和苯乙醛酸的方法，其特征在于包括以下步驟第一步，將收集的尿液離心后保存；第二步，取第一步得到的尿液，加入內(nèi)標(biāo)苯甲酮，二苯胺，鹽酸并加入氯仿，蝸旋，離心進(jìn)行萃取，吸出有機(jī)相記為A，剩余液待用；第三步，取第二步中的剩余液，加入氫氧化鈉溶液和氯仿，蝸旋，離心進(jìn)行第二次萃取，吸出有機(jī)相記為B；第四步，混合第二步中萃取出的有機(jī)相A和第三步中萃取出的有機(jī)相B于玻璃管中，然后吹干；第五步，在第四步的玻璃管中加入乙腈復(fù)溶，并且加入衍生化試劑進(jìn)行衍生化反應(yīng)；第六步取第五步中的反應(yīng)液用于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定。
2. 如權(quán)利要求l所述的基于衍生法同時檢測人體尿液中可的寧、苯乙醇酸 和苯乙醛酸的方法，其特征是所述尿液離心后保存的溫度為-20 °C 。
3. 如權(quán)利要求l所述的基于衍生法同時檢測人體尿液中可的寧、苯乙醇酸 和苯乙醛酸的方法，其特征是所述第二步中取尿液的體積為lml，所述苯甲酮加 入量為5ul，濃度為2mg/ml， 二苯胺加入量為50ul，濃度為2mg/ml，鹽酸加入 量為100ul，濃度為1.2M，氯仿用量為lml。
4. 如權(quán)利要求l所述的基于衍生法同時檢測人體尿液中可的寧、苯乙醇酸 和苯乙醛酸的方法，其特征是第二步中所述蝸旋的轉(zhuǎn)速為1500rpm，時間為5min， 所述離心轉(zhuǎn)速為2500rpm，時間為4min。
5. 如權(quán)利要求l所述的基于衍生法同時檢測人體尿液中可的寧、苯乙醇酸 和苯乙醛酸的方法，其特征是第三步中所述氯仿的用量為lml，所述氫氧化鈉溶液加入量為130ul，濃度為1 M;所述蝸旋轉(zhuǎn)速為1500rpm，時間為5min，所述離 心轉(zhuǎn)速為2500rpm，時間為4min。
6. 如權(quán)利要求l所述的基于衍生法同時檢測人體尿液中可的寧、苯乙醇酸 和苯乙醛酸的方法，其特征是第五步中所述乙腈的用量為50ul;所述衍生化試 劑為硅烷化試劑，加入量為50ul，衍生化溫度為50°C,衍生化時間為30min。
7. 如權(quán)利要求1所述的基于衍生法同時檢測人體尿液中可的寧、苯乙醇酸 和苯乙醛酸的方法，其特征是第六步中所取反應(yīng)液的進(jìn)樣體積為1 5ul。
8. 如權(quán)利要求l所述的基于衍生法同時檢測人體尿液中可的寧、苯乙醇酸 和苯乙醛酸的方法，其特征是所述反應(yīng)液采用氣相色譜質(zhì)譜分析儀進(jìn)行氣相色 譜質(zhì)譜聯(lián)用測定的色譜條件為色譜柱選擇中等極性或非極性色譜柱中的一種， 氣相色譜質(zhì)譜分析儀進(jìn)樣口溫度在250 °C 280 °C 。
9. 如權(quán)利要求l所述的基于衍生法同時檢測人體尿液中可的寧、苯乙醇酸 和苯乙醛酸的方法，其特征是所述用于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定的質(zhì)譜的條件為 電離方式為E1源電離，電離電壓為40 70eV ，離子源溫度在220 250°C 。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及基于衍生法同時檢測人體尿液中可的寧、苯乙醇酸和苯乙醛酸的方法，其特征包括以下步驟第一步，將收集的尿液離心后保存；第二步，取第一步得到的尿液，加入內(nèi)標(biāo)苯甲酮，二苯胺，鹽酸并加入氯仿，蝸旋，離心進(jìn)行萃取，吸出有機(jī)相記為A，剩余液待用；第三步，取第二步中的剩余液，加入氫氧化鈉溶液和氯仿，蝸旋，離心進(jìn)行第二次萃取，吸出有機(jī)相記為B；第四步，混合第二步中萃取出的有機(jī)相A和第三步中萃取出的有機(jī)相B于玻璃管中，然后吹干；第五步，在第四步的玻璃管中加入乙腈復(fù)溶，并且加入衍生化試劑進(jìn)行衍生化反應(yīng)；第六步取第五步中的反應(yīng)液用于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定；本方法具有簡便、快捷、結(jié)果可靠、自動化程度高、便于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的特點(diǎn)。
文檔編號G01N30/00GK101477090SQ20091009553
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日
發(fā)明者吳鴛鴦, 陳樞青 申請人:陳樞青;施衛(wèi)星;柳志明