專利名稱：用于熒光定量pcr法檢測腸道白色念珠菌的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體涉及一種用于熒光定量PCR法檢測腸道白色念珠菌的試劑盒。
背景技術(shù)：
在正常人類腸道中存在一個豐富、多樣的真菌群落。人們采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法已經(jīng)對人 類腸道真菌進行了許多研究(Khatib R， Riederer KM, Ramanathan J, et al. Faecal fungal flora in healthy volunteers and inpatients. Mycoses, 2001, 44:151-6.), 該 方法通過對真菌表型進行診斷，觀察固體培養(yǎng)基上的菌落生長和繁殖情況，根據(jù)菌落形狀、 大小、顏色、粘性以及其他結(jié)構(gòu)特征鑒定真菌，結(jié)合不同的生理、生化和耐熱性試驗等進行 形態(tài)學診斷。運用分離培養(yǎng)法可以準確的診斷某些致病性真菌，但是，在某些特殊情況下， 比如分離培養(yǎng)的菌落形態(tài)不典型、特殊培養(yǎng)基無法獲取、培養(yǎng)時間過長、表型結(jié)果非特異等 等，則無法對真菌病原體進行準確診斷，需要依靠非培養(yǎng)診斷技術(shù)進行真菌鑒定。
實時熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物的各個領(lǐng)域(Espy MJ， Uhl JR， et al. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clin Microbiol, 2006， Rev 19(1): 165-256.)。該技術(shù)不僅能夠從本質(zhì)上增加 病原體檢測的靈敏度，結(jié)合種特異性引物和擴增產(chǎn)物融解曲線分析可以特異的檢測和鑒定某 種病原體，檢測過程無需分離培養(yǎng)，操作簡便、快速，極大的縮短了診斷時間；并且可以作 為病原體感染患者治療療效的監(jiān)測手段。但是，由于人類腸道微生態(tài)群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存在大約 10"個不同的微生物有機體，而真菌所占比例較低，不到1%;某些真菌菌種的生長還需要復(fù) 雜的培養(yǎng)條件，分離培養(yǎng)法只能檢測到一小部分條件適合的微生物，檢測靈敏度低且診斷周 期長。而實時熒光定量PCR技術(shù)是基于對病原體核苷酸的檢測，不受培養(yǎng)條件限制且檢測靈 敏度高，有利于更加準確、全面的了解真菌群落在腸道病理生理過程中的作用。利用實時熒 光定量PCR技術(shù)能夠準確、快速的檢測和鑒定真菌病原體，這對于及時治療和有效控制腸道 真菌感染都至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于熒光定量PCR法檢測腸道白色 念珠菌的試劑盒。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
提供一種用于熒光定量PCR法檢測腸道白色念珠菌的試劑盒，該試劑盒包括
反應(yīng)總體積1/10的10XTaqman PCR buffer:
各O. 15 timol/L 1 umol/L的上游引物和下游引物；
各200umol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;
2. 0 mm。l/L 3. 5畫1/L的MgCl2;
0. 05U/ul HOTSTART Taq DNA聚合酶；
0. 02 X SYBR green I熒光染料；
標準陽性模版，其濃度按定量標準曲線制備的要求系列稀釋； 余量為無菌雙蒸水；
所述兩條引物是PCR擴增過程中使用的特異性擴增白色念珠菌ITS區(qū)的引物，其中
上游引物序列為:5, -ATCCCGACTTACCACTACCG- 3' ( SEQ ID NO: 1);
下游引物序列為5, -TTTATCMCTTGTCAGACCAGA- 3， (SEQ ID NO: 2);
所述標準陽性模版為白色念珠菌標準菌株DNA經(jīng)前述引物擴增，擴增產(chǎn)物與pGEMT-T Easy載體連接后獲得的標準質(zhì)粒DNA;編碼所述擴增產(chǎn)物的基因具有SEQ ID NO: 3所示的核 苷酸序列。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
操作簡便、快速；特異性好，靈敏度高；基于對核苷酸的檢測，不受培養(yǎng)條件限制；定 量檢測，能真實反映腸道白色念珠菌定植和發(fā)生感染的情況；可同時進行高通量的樣本檢 測。本發(fā)明提供的試劑盒可對腸道白色念珠菌進行快速定量檢測，可以替代一直沿用的分離 培養(yǎng)的傳統(tǒng)診斷方法，并適于在臨床實驗室廣泛推廣應(yīng)用。


圖1為將本發(fā)明試劑盒標準陽性模版梯度稀釋后，進行熒光定量PCR擴增所得的動力曲 線圖，橫坐標代表循環(huán)數(shù)，縱坐標代表相對熒光強度，圖中平行于橫坐標的直線代表熒光閾 值。圖2為將本發(fā)明試劑盒標準陽性模版梯度稀釋后，進行熒光定量PCR擴增所得的標準曲 線圖，橫坐標代表熒光閾值，縱坐標代表不同稀釋度標準陽性模版的濃度。
圖3為具體實施例中所述熒光定量PCR擴增產(chǎn)物的融解曲線圖，橫坐標代表融解溫度， 縱坐標代表相對熒光強度。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步詳細地闡述本發(fā)明。
本發(fā)明所述的用于熒光定量PCR法檢測腸道白色念珠菌的試劑盒包括引物、Taqman PCR buffer、 dNTPs、 MgCl2、 Taq DNA聚合酶、SYBR green I熒光染料、標準陽性模版和無菌雙蒸 水。其中
(1) 引物是特異性擴增白色念珠菌ITS區(qū)的引物； 上游引物序列為5' -ATCCCGACTTACCACTACCG- 3' (SEQ ID NO: 1) 下游引物序列為5' -TTTATCMCTTGTCAGACCAGA- 3' (SEQ ID NO: 2)
(2) 標準陽性模版
白色念珠菌標準菌株DNA經(jīng)前述引物擴增，擴增產(chǎn)物與pGEMT-T Easy載體連接即為標準 陽性模版；編碼所述擴增產(chǎn)物的基因具有SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列；擴增產(chǎn)物與 pGEMT-T Easy載體連接后可在大腸桿菌DH5 a中增殖。儲存濃度為10"拷貝/ul，使用前進行 系列稀釋。
該試劑盒保存于-2(TC，盡量減少反復(fù)凍融。
本發(fā)明中所述白色念珠菌標準菌株購自生物梅里埃公司生產(chǎn)的白色念珠菌ATCC 10231菌 株，pGEMT-T Easy載體為Promega公司產(chǎn)品，PCR用Buffer、 MgCl2、 dNTPs、 HOTSTART Taq DNA聚合酶、SYBR greenl熒光染料購自大連寶生物技術(shù)公司。
具體實施例1:
本實施例中的試劑盒包括
反應(yīng)總體積1/10的lOXT叫man PCR buffer;
各O. 15 Umol/L的上游引物和下游引物;
各200umol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;
2. 0國ol/L的MgCl2;
0.05U/ul HOTSTART Taq DNA聚合酶；0. 02XSYBR green I熒光染料；
標準陽性模版，其濃度按定量標準曲線制備的要求系列稀釋; 余量為無菌雙蒸水。
具體實施例2: 試劑盒成份如下
反應(yīng)總體積1/10的10XTaqman PCR buffer;
各1.0 umol/L的上游引物和下游引物；
各200umol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;
3. 5國ol/L的MgCl2;
0. 05U/U 1 HOTSTART Taq DNA聚合酶；
0. 02XSYBR green I熒光染料；
標準陽性模版，其濃度按定量標準曲線制備的要求系列稀釋; 余量為無菌雙蒸水。
具體實施例3: 試劑盒成份如下-
反應(yīng)總體積1/10的lOXTaqman PCR buffer;
各0.5 wmol/L的上游引物和下游引物;
各200umol/L的dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP;
3. 0 mmol/L的MgCl2;
0. 05U/ul HOTSTART Taq DNA聚合酶;
0. 02XSYBR green I熒光染料；
標準陽性模版，其濃度按定量標準曲線制備的要求系列稀釋; 余量為無菌雙蒸水。
本發(fā)明試劑盒的工作原理介紹
在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈 后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信 號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。反應(yīng)包括以下幾個步驟(1) PCR變性過程產(chǎn)生單鏈 DNA, SYBR熒光染料呈游離狀態(tài)，熒光信號很低；(2)引物退火過程中，雙鏈DNA部分形成，SYBR熒光染料同時特異性地摻入DNA雙鏈，熒光信號增加；(3)PCR延伸過程中，雙鏈 DNA逐漸形成，SYBR熒光染料不斷摻入DNA雙鏈中，熒光信號不斷增加；(4)最后延伸階段 結(jié)束后，所有DNA形成雙鏈，摻入DNA雙鏈中的熒光染料達到最大值，熒光信號也達到最大 值。
本發(fā)明所述試劑盒使用方法舉例
(1) 反應(yīng)體系10XTaqman PCR buffer 4wl， dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP的濃度分別 為200iiinol/L，上游和下游引物的濃度為0.5 Pmol/L, MgCl2的濃度為3.0 mmol/L， 0. 02XSYBR greenl熒光染料，2UH0TSTART T叫DNA聚合酶，模版DNA2ul，無菌雙蒸水補 足體積至40ul。
(2) 反應(yīng)程序95。C變性5min，隨后94。C預(yù)變性30s， 59。C退火30s， 72。C延伸45s， 循環(huán)35次，最后72"C延伸5min。
(3) 定量標準曲線制備將標準陽性模版進行連續(xù)10倍稀釋(如109， 108, 107, 106)，獲得系列拷貝數(shù)梯度的標準質(zhì)粒DNA。按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，每個濃度重復(fù) 三次進行擴增。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)起始模版拷貝數(shù)的對數(shù)值和C(T)值繪制標準曲線Y=aX + b,R2。
(4) 樣品檢測取受試者新鮮尾便200mg，按照常規(guī)方法提取DNA，取2ul DNA作為模 版，按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進行擴增。
(5) 結(jié)果計算根據(jù)標準曲線和所得的C(T)值計算起始模版拷貝數(shù)。
本發(fā)明的應(yīng)用實例介紹
取40例健康志愿者新鮮尾便，采用沙保氏培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和本發(fā)明所述熒光定量PCR檢 測試劑盒同時進行檢測。 1.模版DAN的制備
(1) 試劑采用QIAamp DNA stool mini kit結(jié)合玻璃珠擊打法抽提受試者糞便標本 DNA， QIAamp DNA stool mini kit試劑盒購自北京東勝創(chuàng)新實驗技術(shù)有限公司，玻璃珠購自 上海生物工程公司。
(2) 糞便標本DNA的提取用電子天平稱取受試者新鮮尾便200mg/份，加入ASL緩沖液 和0. 3g玻璃珠，置入Fast Pr印FP120快速核酸提取儀，6. 5 m/sX45 s進行破壁，然后按 照QIAamp DNA stool mini kit說明書進行操作，最后AE洗脫DNA。所有抽提獲得的DNA均 置于-80'C保存?zhèn)溆谩?.熒光定量PCR反應(yīng)
(1) 反應(yīng)體系10XTaqman PCR buffer 4ul， dATP 、 dTTP、 dGTP、 dCTP的濃度分別 為200nmol/L，上游和下游引物的濃度為0.5 umol/L， MgCl2的濃度為3.0咖ol/L， 0.02XSYBR green I熒光染料，2UH0TSTART Taq DNA聚合酶，模版DNA 2ul，無菌雙蒸水補 足體積至40ul。
(2) 反應(yīng)程序95'C變性5min，隨后94。C預(yù)變性30s, 59。C退火30s， 72'C延伸45s， 循環(huán)35次，最后72'C延伸5min。
(3) 定量標準曲線制備將標準陽性模版進行連續(xù)10倍稀釋(如109， 108， 107, 106)，獲得系列拷貝數(shù)梯度的標準質(zhì)粒DNA。按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，每個濃度重復(fù) 三次進行擴增。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)起始模版拷貝數(shù)的對數(shù)值和C(T)值繪制出標準曲線Y=-0. 3142X十10.24, R2=0. 999 (圖l， 2)。
(4) 樣品檢測取40例健康志愿者糞便標本DNA作為模版，按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng) 程序進行熒光定量PCR擴增。在循環(huán)結(jié)束時通過對PCR產(chǎn)物進行融解溫度曲線分析來決定產(chǎn) 物的特異性，即從75'C至95'C，每升溫0.5'C，持續(xù)2秒后采集反應(yīng)管中反應(yīng)液的熒光信 號。每次熒光定量PCR反應(yīng)均設(shè)置倍比稀釋的標準陽性模版構(gòu)建標準曲線，以此獲取樣本中 不同菌種基因拷貝數(shù)。各種真菌數(shù)量以每克糞便基因拷貝數(shù)的對數(shù)值表示，數(shù)據(jù)以均數(shù)(5) ±標準差(s)表示。
結(jié)果顯示，本發(fā)明試劑盒檢測白色念珠菌所得標準曲線的相關(guān)系數(shù)為0.99,最低線性檢 測限為102拷貝/111 (圖1, 2)。擴增產(chǎn)物的融解溫度為84，8'C，而且融解曲線顯示擴增反應(yīng) 特異性較好(圖3)。本發(fā)明試劑盒的檢測陽性率(75.0%)顯著高于分離培養(yǎng)法(12.0%) (代O.OOl) ， 40例健康志愿者腸道白色念珠菌的熒光定量PCR檢測結(jié)果為5.739士0.304 (1o&?？截?g)。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法比較，具有特異性好，靈 敏度高，檢測快速等特點。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然，本發(fā)明不限于 以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出 或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。序列表
SEQ ID NO:1
atcccgacttaccactaccg20
SEQ ID NO:2
tttatcaacttgtcagacea22
SEQ ID NO:3
atcccgacttaCC￡LCt￡LCCgtctttcaagcaaacccaagtcgtattgctc60
ccagcggtttgaggg卿肌cgacgctcaaacaggcatgccctccggaatacc卿gggc120
gc犯tgtgcgttcaaagattcgatgattcacgaatatctgcaattcatattgcgtatcgc180
atttcgctgcgttcttcatcgELtgCgELg犯ccaagagatccgttgttgaaagttttgact240
attagtaataatctggtctgacaagttgataaa 27權(quán)利要求
1、一種用于熒光定量PCR法檢測腸道白色念珠菌的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括反應(yīng)總體積1/10的10×Taqman PCR buffer；各0.15μmol/L～1μmol/L的上游引物和下游引物；各200μmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP；2.0mmol/L～3.5mmol/L的MgCl2；0.05U/μl HOTSTART Taq DNA聚合酶；0.02×SYBR green I熒光染料；標準陽性模版，其濃度按定量標準曲線制備的要求系列稀釋；余量為無菌雙蒸水；所述兩條引物是PCR擴增過程中使用的特異性擴增白色念珠菌ITS區(qū)的引物，其中上游引物序列為5’-ATCCCGACTTACCACTACCG-3’；下游引物序列為5’-TTTATCAACTTGTCAGACCAGA-3’；所述標準陽性模版為白色念珠菌標準菌株DNA經(jīng)前述引物擴增，擴增產(chǎn)物與pGEMT-T Easy載體連接后獲得的標準質(zhì)粒DNA；編碼所述擴增產(chǎn)物的基因具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種試劑盒，旨在提供一種用于熒光定量PCR法檢測腸道白色念珠菌的試劑盒。該試劑盒包括標準陽性模版和兩條PCR擴增過程中使用的特異性擴增白色念珠菌ITS區(qū)的引物，其中編碼擴增產(chǎn)物的基因具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。本發(fā)明操作簡便、快速；特異性好，靈敏度高；基于對核苷酸的檢測，不受培養(yǎng)條件限制；定量檢測，能真實反映腸道白色念珠菌定植和發(fā)生感染的情況；可同時進行高通量的樣本檢測。本發(fā)明提供的試劑盒可對腸道白色念珠菌進行快速定量檢測，可以替代一直沿用的分離培養(yǎng)的傳統(tǒng)診斷方法，并適于在臨床實驗室廣泛推廣應(yīng)用。
文檔編號G01N21/64GK101555522SQ20091009855
公開日2009年10月14日 申請日期2009年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日
發(fā)明者李蘭娟, 郭仁勇, 瑜 陳, 陳珍晶, 魯海峰 申請人:浙江大學