專利名稱：：一種同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于食品檢測技術(shù)和現(xiàn)代儀器分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種快速同時提取和定量檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法。
背景技術(shù)：
：乙偶姻是眾多微生物的代謝產(chǎn)物，是在醋的釀制過程中由a-乙酰乳酸脫羧酶轉(zhuǎn)化雙乙酰產(chǎn)生，是食醋的重要風(fēng)味物質(zhì)，其含量是控制食醋質(zhì)量的一個重要指標(biāo)。川芎嗪(四甲基吡嗪)，是食品中重要的風(fēng)味物質(zhì)，也是一種常用的食品添加劑，廣泛存在于各種食品中。同時，川芎嗪作為抗心血管疾病藥物已在我國臨床應(yīng)用超過30年，被公認(rèn)為安全無副作用。川芎嗪是一種從草藥川芎中提取的生物堿，具有抗血小板聚集作用，并有擴張血管、增加冠脈血流量、改善微循環(huán)及增加腦血流量等作用。近年來，在發(fā)酵制品，如食醋、白酒中，有檢測到川芎嗪的報道，有的含量接近甚至超過了中草藥川芎中的含量，大多數(shù)研究認(rèn)為是美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物。也有報道證明兩分子的乙偶姻與氨反應(yīng)可以生成川芎嗪。在食品中川芎嗪的形成與乙偶姻密切相關(guān)。乙偶姻的檢測一般采用氣相色譜法。川芎嗪的檢測方法有氣相和液相色譜法，主要集中在醫(yī)藥領(lǐng)域，食品尤其是發(fā)酵制品中報道甚少，且檢測的偏差很大。乙偶姻和川芎嗪兩種物質(zhì)的同時檢測未見文獻報道?？焖贆z測乙偶姻和川芎嗪對藥品的監(jiān)管、發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)檢測、川芎嗪形成機理的研究及富含川芎嗪保健品的研發(fā)等諸多方面具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪濃度的方法，該方法具有操作簡便快速、重復(fù)性好、精密度高和檢測成本低等特點。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪濃度的方法，包括以下步驟1)、預(yù)處理:將待檢食醋與提取溶劑進行混合，然后進行超聲提取，得預(yù)處理后食醋混合液；2)、將上述預(yù)處理后食醋混合液按以下色譜條件進行檢測帶有可變波長的紫外測器的高效快速液相色譜儀，耐酸的高通量快速C18反相柱(100x4.6mm,1.8—，柱溫45°C，進樣量2pL，檢測波長為285300nm(優(yōu)選290nm)，流動相為甲醇含酸水溶液=55:45的體積比，所述含酸水溶液中含1%(體積比)冰醋酸和0.05%(體積比)三氟乙酸、其余為水，pH2.5;等度洗脫；流速0.8ml/min;3)、確定待檢食醋中是否含有乙偶姻和川芎嗪-乙偶姻和川芎嗪的出峰時間分別為1.278~1.299min和1.982~2.039min;根據(jù)色譜圖，分別確定待檢食醋中是否含有乙偶姻和川芎嗪。作為本發(fā)明的同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法的改進所述色譜圖中，根據(jù)乙偶姻的線性回歸方程Ai=26.5006d-0.7685，獲得待檢食醋中乙偶姻的濃度d;根據(jù)川芎嗪的線性回歸方程八2=5.8835<:2-1.1001，獲得待檢食醋中川芎嗪的濃度C2;所述A,和A2分別代表乙偶姻和川芎嗪的峰面積。作為本發(fā)明的同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法的進一步改進步驟l)中提取溶劑與食醋的體積比為58:1，優(yōu)選6:1;提取溶劑為酸性的醇水溶液。作為本發(fā)明的同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法的進一步改進酸性的醇水溶液為水、無機酸和醇的混合物，所述醇占酸性的醇水溶液總體積的7585%，優(yōu)選80%。作為本發(fā)明的同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法的進一步改進無機酸為冰醋酸、鹽酸或磷酸，所述醇為甲醇或乙醇。作為本發(fā)明的同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法的進一步改進無機酸選用冰醋酸時，冰醋酸占酸性的醇水溶液總體積的46%，優(yōu)選5%。作為本發(fā)明的同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法的進一步改進無機酸選用鹽酸或磷酸時，鹽酸或磷酸在酸性的醇水溶液中的濃度為0.150.45mol/L，鹽酸的優(yōu)選濃度為0.2mol/L，磷酸的優(yōu)選濃度為0.4mol/L。作為本發(fā)明的同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法的進一步改進步驟l)中超聲提取時間為3060min，優(yōu)選45min。本發(fā)明的步驟l)中，所用超聲波的頻率一般為40KHz，功率可為100W。本發(fā)明的同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪濃度的方法，步驟l)中，在食醋中加入一定比例的提取溶劑(即酸性的醇水溶液)是為了提取食醋中的乙偶姻和川芎嗪；在酸性環(huán)境下，經(jīng)過超聲預(yù)處理，將食醋中的川芎嗪酸化處理，增加其溶解性，使之更利于提取。本發(fā)明采用特定的分離條件，實現(xiàn)了食醋中乙偶姻和川芎嗪精確分離以及同時快速檢測其含量，利用步驟(1)步驟(2)的方法進行測定乙偶姻和川芎嗪含量時，利用外標(biāo)法所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，峰面積與乙偶姻和川芎嗪濃度間的相關(guān)系數(shù)ie均大于0.9999;對同一樣品進行多次測定得到方法的精密度RSD《n/。；利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入法測定方法的回收率在92.1%-100.3%;由此可見本發(fā)明方法具有很高的精確度。本發(fā)明采用溶劑體系輔助超聲提取對食醋樣品進行預(yù)處理，并對川芎嗪進行酸化處理，以實現(xiàn)高效同時提取食醋中的乙偶姻和川芎嗪。處理后的樣品可以用于定量分析。利用耐酸的高通量快速C18反相柱，在指定的HPLC條件下測定快速測定乙偶姻和川芎嗪含量，在35min內(nèi)完成色譜檢測。本發(fā)明方法操作簡便快速，樣品前處理簡單、科學(xué)有效，目前尚未見到同時檢測乙偶姻和川芎嗪的報道；本方法與LC/MS和GC/MS分析方法相比需要的儀器設(shè)備簡單，檢測成本更低，對操作人員要求不高。本發(fā)明方法不僅可以用于食醋的檢測，還適用于乳制品、飲料等其它食品尤其是發(fā)酵制品的日常檢測和監(jiān)控，天然制品、中草約檢測以及藥品監(jiān)管等領(lǐng)域。本發(fā)明的發(fā)明過程具體如下-1、分析方法的建立-采用的高效液相色譜儀及檢測器安捷倫高效快速液相色譜1200系列；紫外可變波長檢測器(美國安捷倫科技公司)。色譜條件SB—C18快速高通量反相柱(100X4.6mm，1.8Pm)，檢測溫度(柱溫)45°C，進樣量2pL，檢測波長為290nm，流動相為甲醇含酸水溶液(含1%醋酸，0.05%三氟乙酸，其余為水，pH2.5;以上百分比為體積百分比；)=55:45，等度洗脫。采用的相關(guān)試劑如下乙偶姻、川芎嗪對照品購于中國生物制品藥品檢定所，甲醇(色譜純，天津四友精細化學(xué)品有限公司)，雙蒸水，三氟乙酸、冰醋酸、鹽酸(均為分析純)。試劑配制與樣品前處理1)準(zhǔn)確稱取乙偶姻、川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)品，用流動相(同上)溶解，分別制成20mg/mL，80pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，冰箱4'C保存。2)將乙偶姻儲備液分別稀釋2，4，5，10，20，30，40倍，得到不同濃度的乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)供試液。川芎嗪儲備液分別稀釋2，4，5，10，20，30，40倍，得到川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)供試液。3)在燒杯中加入800mL高純水，加入10mL冰醋酸，0.5mL三氟乙酸，調(diào)pH到2.5，定容到1000mL;作為流動相水溶液(即含酸水溶液)。4)在50mL具塞三角瓶中加入5mL樣品，同時加入提取溶劑25mL，超聲提取45min(IOOW，40KHz)后；取2mL置于離心管中，8000g,離心5min，取上清液過濾備用；所述提取溶劑為水冰醋酸乙醇=15:5:80(體積比)。HPLC測定所用流動相、標(biāo)樣和樣品均用0.2^微孔膜過濾供液相分析使用，將處理好的標(biāo)準(zhǔn)樣品和食醋樣品用指定色譜條件進行檢測。乙偶姻和川芎嗪標(biāo)樣的高效液相色譜圖如圖3所示，食醋樣品的高效液相色譜圖如圖4所示。2、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進樣檢測，記錄對應(yīng)的峰面積值A(chǔ)rea(A)，以考察其檢測濃度相關(guān)性，具體如表l所示表l、乙偶姻和川芎嗪檢測濃度與峰面積線性關(guān)系考察<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>分別以乙偶姻和川芎嗪濃度對面積A作線性回歸，得到乙偶姻的線性回歸方程為A!=26.5006d-0.7685(R2=0.99996)，如圖1所示；川芎嗪的線性回歸方程為A2=5.8835C2-1.1001(R2=0.99996)，如圖2所示。由線性相關(guān)系數(shù)可以看出，乙偶姻和川芎嗪濃度與峰面積之間均具有良好線性關(guān)系。3、重復(fù)性和精密度考察對一定濃度標(biāo)準(zhǔn)品按上述方法連續(xù)進行8次重復(fù)測定，對乙偶姻、川芎嗪檢測濃度和峰面積精密度進行考察，數(shù)據(jù)如下表2所示表2方法精密度考察<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>對不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按本方法連續(xù)三天進行重復(fù)測定，對乙偶姻、川芎嗪檢測濃度和峰面積精密度進行考察，數(shù)據(jù)如下表3所示表3方法重復(fù)性考察<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從上表2和表3中可以看出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于2M，精密度高，可以精確測定食醋中乙偶姻和川芎嗪。4、準(zhǔn)確性考察向食醋樣品中添加不同濃度的乙偶姻和川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測定被加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品的回收量，計算回收率，結(jié)果見表4。表4方法加標(biāo)回收率考察<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結(jié)果顯示，方法的回收率在92.1%-100.3%之間，可以用于乙偶姻和川芎嗪的準(zhǔn)確測定。5、最低檢測限、定量限和檢測線性范圍考察將對照品溶液逐步稀釋成不同濃度進行測試來找出檢測限。觀察其峰高比基線噪音高多少倍。S/N:3時的濃度是檢測限，也就是峰高約在基線噪音高的3倍，注入液相色譜儀的對照品濃度。S/N-10是定量限，也就是峰高約在基線噪音高的IO倍時，注入液相色譜儀的對照品量。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>另外，食醋樣品加標(biāo)后圖5中川芎嗪位置的峰未出現(xiàn)分離；將醋中的川芎嗪分離提取純化進行GC-MS分析，結(jié)果如圖6所示。這些結(jié)果進一步驗證了本發(fā)明方法的正確性。綜上所述，本發(fā)明與現(xiàn)行方法相比乙偶姻和川芎嗪檢測限更低分別為5.625pg/mL，0.033pg/mL，而且具有較低的RSD。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖1為乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖2為川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線圖3為乙偶姻和川芎嗪對照品的高效液相色譜圖4為食醋樣品的高效液相色譜圖5為加標(biāo)后食醋樣品的高效液相色譜圖6從食醋中純化得到川芎嗪樣品的GC-MS譜圖中a為總離子流色譜圖，峰l為川芎嗪；b為質(zhì)量色譜c為與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫匹配、識別后鑒定結(jié)果。具體實施例方式實施例l、一種同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，依次包括以下步驟1)、預(yù)處理采用溶劑體系輔助超聲提取對待檢食醋進行預(yù)處理，提取溶劑與食醋的體積比為6:1，提取溶劑為水冰醋酸乙醇=15:5:80(體積比)，提取時間45Itlin;得預(yù)處理后食醋混合液。2)、將上述預(yù)處理后食醋混合液按以下色譜條件進行檢測-按指定方法在安捷倫1200液相色譜儀進行檢測，采用耐酸的C18高通量反相柱(100x4.6mm,1.8pm)，檢測溫度(柱溫)45。C，進樣量2^L,檢測波長為290nm,流動相為甲醇含酸水溶液(含1%醋酸，0.05%三氟乙酸，其余為水，pH2.5)=55:45(體積比)，等度洗脫，流速0.8ml/min。3)、確定待檢食醋中乙偶姻和川芎嗪的含量乙偶姻和川芎嗪的出峰時間分別為1.278~1.299min和1.982~2.039min;根據(jù)色譜圖，再根據(jù)乙偶姻的線性回歸方程A!:26.5006d-0.7685，獲得待檢食醋中乙偶姻的濃度C1;根據(jù)川芎嗪的線性回歸方程八2=5.8835(:2-1.10001，獲得待檢食醋中川芎嗪的濃度C2。分別以浙醋、鎮(zhèn)江香醋和陳醋、上海陳醋和米醋、山西老醋等作為樣品120，所得結(jié)果如表6所示表6食醋中乙偶姻和川芎嗪的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從表中可以看出，不同菌種、不同品牌和不同生產(chǎn)工藝的食醋樣品中乙偶姻和川芎嗪的含量存在較大的差異。實施例2、一種同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，依次包括以下步驟1)、預(yù)處理采用溶劑體系輔助超聲提取對待檢食醋進行預(yù)處理，提取溶劑與食醋的體積比為5:1，提取溶劑為水冰醋酸乙醇=20:5:75(體積比)，提取時間30min;得預(yù)處理后食醋混合液。步驟2)和步驟3)同實施例l。選用實施例1中的樣品1樣品5，檢測結(jié)果如下表7所示表7食醋中乙偶姻和川芎嗪的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例3、一種同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，依次包括以下步驟1)、預(yù)處理采用溶劑體系輔助超聲提取對待檢食醋進行預(yù)處理，提取溶劑與食醋的體積比為7:1，提取溶劑為水乙醇=1:4(體積比)含0.2mol/L的鹽酸的溶液體系，提取時間30min;得預(yù)處理后食醋混合液。步驟2)和步驟3)同實施例l。選用實施例1中的樣品1樣品5，檢測結(jié)果如下表8所示:表8食醋中乙偶姻和川芎嗪的含量樣品編號乙偶姻含量(g/Kg)川芎嗪含量(mg/Kg)15.33768.25523.852130.13533.4965.18640.4233.36755.11962.334實施例4、一種同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，依次包括以下步驟1)、預(yù)處理采用溶劑體系輔助超聲提取對待檢食醋進行預(yù)處理，提取溶劑與食醋的體積比為8:1，提取溶劑為水甲醇=1:4(體積比)含0.4mol/L的磷酸的溶液體系，提取時間40min;得預(yù)處理后食醋混合液。步驟2)同實施例l。步驟3)中檢測波長為297nm，其余同實施例l。選用實施例1中的樣品1樣品5，檢測結(jié)果如下表9所示表9食醋中乙偶姻和川芎嗪的含量樣品編號乙偶姻含量(g/Kg)川芎嗪含量(mg/Kg)15.43667.25423.754129.23333.3855.28840.4253.55555.02564.535最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。權(quán)利要求1、一種同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，其特征在于包括以下步驟1)、預(yù)處理將待檢食醋與提取溶劑進行混合，然后進行超聲提取，得預(yù)處理后食醋混合液；2)、將上述預(yù)處理后食醋混合液按以下色譜條件進行檢測帶有可變波長的紫外測器的高效快速液相色譜儀，耐酸的高通量快速C18反相柱，柱溫45℃，進樣量2μL，檢測波長為285～300nm，流動相為甲醇∶含酸水溶液＝55∶45的體積比，所述含酸水溶液中含1％冰醋酸和0.05％三氟乙酸、其余為水，pH2.5；等度洗脫；流速0.8ml/min；3)、確定待檢食醋中是否含有乙偶姻和川芎嗪乙偶姻和川芎嗪的出峰時間分別為1.278～1.299min和1.982～2.039min；根據(jù)色譜圖，分別確定待檢食醋中是否含有乙偶姻和川芎嗪。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，其特征是所述色譜圖中，根據(jù)乙偶姻的線性回歸方程A！=26.5006(^-0.7685，獲得待檢食醋中乙偶姻的濃度Q;根據(jù)川芎嗪的線性回歸方程A2-5.8835C2-1.1001,獲得待檢食醋中川芎嗪的濃度<:2;所述A,和八2分別代表乙偶姻和711芎嗪的峰面積。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，其特征是所述步驟l)中提取溶劑與食醋的體積比為58:1;所述提取溶劑為酸性的醇水溶液。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，其特征是酸性的醇水溶液為水、無機酸和醇的混合物，所述醇占酸性的醇水溶液總體積的7585%。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，其特征是所述無機酸為冰醋酸、鹽酸或磷酸，所述醇為甲醇或乙醇。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，其特征是所述無機酸為冰醋酸，冰醋酸占酸性的醇水溶液總體積的46%。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，其特征是所述無機酸為鹽酸或磷酸，鹽酸或磷酸在酸性的醇水溶液中的濃度為0.150.45mol/L。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，其特征是所述步驟l)中超聲提取時間為3060min。全文摘要本發(fā)明公開了一種同時檢測食醋中乙偶姻和川芎嗪的方法，包括以下步驟1)預(yù)處理將待檢食醋與提取溶劑進行混合，然后進行超聲提?。?)將上述預(yù)處理后食醋混合液按以下色譜條件進行檢測柱溫45℃，進樣量2μL，檢測波長為285～300nm，流動相為甲醇∶含酸水溶液＝55∶45的體積比，等度洗脫；流速0.8ml/min；3)乙偶姻和川芎嗪的出峰時間分別為1.278～1.299min和1.982～2.039min；根據(jù)色譜圖，分別確定待檢食醋中是否含有乙偶姻和川芎嗪。該方法具有操作簡便快速、重復(fù)性好、精密度高和檢測成本低等特點。文檔編號G01N30/02GK101581707SQ200910100108公開日2009年11月18日申請日期2009年6月29日優(yōu)先權(quán)日2009年6月29日發(fā)明者何國慶,盧曉鳳,吳晶晶,沈生榮,暉阮,陳啟和,陳繼承申請人:浙江大學(xué)