專利名稱：一種海洋貝類卵細(xì)胞石蠟切片方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種石蠟切片的方法，具體講是一種適用于卵徑較小的海洋貝類卵細(xì) 胞石蠟切片方法。
背景技術(shù)：
石蠟切片技術(shù)是受精細(xì)胞學(xué)的重要研究手段之一，其技術(shù)成熟、方法穩(wěn)定、造價低 廉、觀察方便，且有組織結(jié)構(gòu)保存完好、獲得圖像對比清晰等優(yōu)點，可在光鏡下清晰地 看到受精卵外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，尤其是紡綞體的消長和兩性原核結(jié)合時的核膜 變化，具有不同于壓片、透射電鏡和熒光顯微術(shù)的獨特優(yōu)勢。石蠟切片技術(shù)已被廣泛用
于魚類受精細(xì)胞學(xué)研究中。然而，由于多數(shù)貝類的卵子個體微小，尤其是雙殼貝類，卵 徑一般僅幾十微米，如櫛孔扇貝卵徑70pm左右，文蛤80 9(^m，菲律賓蛤仔71~85nm， 而近江牡蠣、寬殼全海筍的卵徑僅有40 5(^m，如此小的卵子，肉眼不易看清，給脫水、
透蠟、包埋等過程帶來很大不便。
理論上講，石蠟切片的厚度可達(dá)5 8阿，而一個幾十微米的卵子也能被切成數(shù)片。 只要卵量大、切片和染色效果好，就能找到方向合適的卵子的切面，從而觀察到染色體 和紡錘體的變化情況，系統(tǒng)研究不同發(fā)育階段的核行為，為受精及早期胚胎發(fā)育機(jī)理的 深入研究和細(xì)胞工程育種提供基礎(chǔ)資料。但是，傳統(tǒng)的石蠟切片技術(shù)尚未解決卵子小而 帶來的諸多困難，所以目前用石蠟切片技術(shù)來研究雙殼貝類受精過程的報道很少，而能 獲得分裂相清晰、染色效果好的方法介紹還尚未見到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，提供一種針對海洋貝類卵細(xì)胞 相對微小的特點，提供一種分裂相清晰、染色效果好的海洋貝類卵細(xì)胞石蠟切片方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為該海洋貝類卵細(xì)胞的石蠟切片方 法，其特征在于包括下述步驟
①樣品固定將不同發(fā)育階段的卵細(xì)胞連同海水轉(zhuǎn)移至離心管中，然后緩慢加入冷的Bouin氏液將樣品固定20-40min，待樣品自然沉降或低速離心后，除去上清液，加入新的Bouin氏液，如此更換Bouin氏液2-3次，然后轉(zhuǎn)移入70%酒精中，置4t冰箱中保存；
②卵細(xì)胞預(yù)處理向盛有卵細(xì)胞的離心管中加入幾滴1%的伊紅染液，染色1~2分鐘，使卵細(xì)胞表面被染成粉紅色，便于肉眼識別；用細(xì)針在稱量紙上刺些小孔，用稱量紙將染色后的卵細(xì)胞包起來，以使卵子在處理時不會漏出；
③脫水與透明程序?qū)⒂梅Q量紙包好的卵細(xì)胞置于脫水機(jī)或染色缸中，用梯度乙醇脫水；先后采用70%乙醇脫水50分鐘、85%乙醇脫水50分鐘2次、95%乙醇脫水45分鐘2次、100%乙醇脫水45分鐘2次；然后用l: 1 (體積比)的無水乙醇/二甲苯過渡處理25分鐘，再用二甲苯處理20分鐘2次，使之透明；
透蠟和包埋用l: 1 (體積比)的二甲苯/石蠟過渡處理40分鐘，52~56匸熔
點的石蠟透蠟1小時2次；打開紙包，將卵子置于包埋盒中，使卵子均勻地分布于包埋
盒中部，然后加注融蠟進(jìn)行包埋；
⑤切片和烤片用生物切片機(jī)切片，切片厚度5"m,蠟帶用40'C恒溫水浴展片，貼于事先涂有粘片劑的載玻片上，然后在烤片機(jī)上烘干；
◎染色與封片染色采用伊紅-蘇木精復(fù)染方法，其中用蘇木精染色6 8分鐘，伊紅染色1.5 2分鐘；然后用中性樹膠封片。
上述方法中，所述的Bouin氏液配方可以為苦味酸飽和液75mL,甲醛25mL，冰醋酸5 mL。
所述的蘇木精染液配方可以為2g蘇木精溶于250mL無水乙醇中，10g硫酸鋁溶于750mL水中，兩液混合，加熱沸騰3分鐘，稍冷卻加入碘酸鈉0. 5g，檸檬酸l.Og，溶解后即得到蘇木精染液。
所述的伊紅染液配方可以為1 g伊紅溶于99mL 70%乙醇中。
與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的優(yōu)點在于
1、 通過簡單的預(yù)染色和紙包處理，克服了海洋貝類卵子微小帶來的操作不便；
2、 操作簡單，毋需增加專門的儀器，便于推廣應(yīng)用；
3、 脫水、透明、透蠟程序間均有過渡步驟，程序內(nèi)多為兩步處理，使試劑逐漸完全地進(jìn)入組織，完好地保存組織的原有結(jié)構(gòu)；
4、 采用改進(jìn)的伊紅-蘇木精染色，獲得的卵子切片清晰、對比度大，便于觀察。


圖1為本發(fā)明實施例1中文蛤卵子及二細(xì)胞期胚胎切片，其中，A.文蛤成熟未受精卵，示染色體(CHS)、紡錘體(SD);B. 第二次成熟分裂中期，示第一極體(PB1);
C. 兩性原核形成期，示第二極體(PB2)、雌原核(FPN)、雄原核(MPN);
D. 二細(xì)胞期，示卵裂溝(CF);
圖2為本發(fā)明實施例2是寬殼全海筍受精卵及二細(xì)胞期胚胎切片，其中，
A. 第二次成熟分裂中期，示第一極體(PB1)、紡錘體(SD)、精核(SN);
B. 兩性原核形成期，示第二極體(PB2)、雌原核(FPN)、雄原核(MPN);
C. 第一次卵裂后期，示染色體(CHS);
D. 二細(xì)胞期，示染色體(CHS)、卵裂溝(CF)。
具體實施例方式
以下附圖結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
首先配制Bouin氏固定液、蘇木精染液和伊紅染液。
Bouin氏固定液取苦味酸飽和液75 mL、甲醛25 mL和冰醋酸5 mL，混合均勻得 到Bouin氏固定液；
蘇木精染液將2g蘇木精溶于250 mL無水乙醇中，10g硫酸鋁溶于750 raL水中， 兩液混合，加熱沸騰3分鐘，稍冷卻加入碘酸鈉O. 5g和檸檬酸1.0g，溶解后即得到蘇 木精染液；
伊紅染液將l g伊紅溶于99mL 70%的乙醇中即得到伊紅染液。 實施例1
1、 樣品固定取山東群體文蛤，在浙江溫州的省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所清江科研基 地進(jìn)行催產(chǎn)和胚胎發(fā)育研究。取不同發(fā)育階段的文蛤卵細(xì)胞于5mL的離心管中，受精 0-60 min每隔5 min取樣一次，60 - 120 min，每隔10 min取樣一次，緩慢加入冷的 Bouin氏固定液2-3mL,固定30分鐘，待樣品沉降后，更換二次固定液；用Bouin氏液 固定5小時后，移入70%酒精中，置4'C冰箱保存。
2、 卵細(xì)胞預(yù)處理向盛有卵細(xì)胞的離心管中加入2滴1%的伊紅染液，染色1-2分 鐘，使卵細(xì)胞表面被染成粉紅色；取正方形的稱量紙，用細(xì)針在紙上刺些小孔，然后將 紙折好，把染色后的卵細(xì)胞包起來，保證卵子不會漏出。
3、 脫水與透明程序?qū)玫穆鸭?xì)胞置于染色缸中，用梯度乙醇脫水，采用70% 乙醇脫水50分鐘、85%乙醇脫水50分鐘2次、95%乙醇脫水45分鐘2次、100%乙醇脫 水45分鐘2次；透明前，用無水乙醇二甲苯(體積比l: 1 )過渡處理25分鐘，然 后用二甲苯20分鐘2次透明。4、 透蠟程序和包埋用二甲苯石蠟(體積比1: 1 )過渡處理40分鐘，56°C熔點的石蠟透蠟1小時2次；將紙包打開，用尖頭鑷子將卵子置于包埋盒中，并使卵子均勻地分布于包埋盒中部，然后加注融蠟進(jìn)行包埋。
5、 切片和烤片采用金華益迪YD-1508A型切片機(jī)連續(xù)切片，切片厚度5wm，蠟帶用4(TC恒溫水浴展片，貼于事先涂有粘片劑的載玻片上，烤片機(jī)烘干即可染色；
6、 染色與封片染色采用伊紅-蘇木精復(fù)染方法，其中蘇木精染色8分鐘，伊紅染
色1.5分鐘；然后用中性樹膠封片。
7、 觀察拍照與受精細(xì)胞學(xué)研究在Nikon E-600顯微鏡的油鏡下(XI 000)觀察，CCD拍照。觀察結(jié)果表明，文蛤成熟未受精卵呈卵圓形，卵徑90ixm左右，核相處于第一次成熟分裂中期，受精后5-10 min，精子進(jìn)入卵內(nèi)并明顯膨脹，激活卵子啟動兩次成熟分裂；在受精后20min、 30min，先后排出第一、第二極體；受精后40 - 45 min，受精卵分裂成2個大小不等的卵裂球;受精后55 - 60 min，分裂為4細(xì)胞;受精后80 - 90min，分裂為8細(xì)胞。發(fā)育過程中出現(xiàn)了多精入卵和多極分離現(xiàn)象。該文蛤卵細(xì)胞石蠟切片清晰、對比度大、觀察方便。
實施例2
取溫州洞頭縣海區(qū)的寬殼全海筍親貝。受精后固定不同發(fā)育時期的受精卵，由于寬殼全海筍卵子直徑僅40-50 nm，更換固定液容易損失，所以固定卵量應(yīng)該大些，用離心機(jī)低速離心來加速沉降。
相比較實施例l，稱量紙上用針刺的孔應(yīng)小些，以減少脫水、透明、透蠟等過程中卵子的損失。
其余未涉及部分與實施例1相同。
觀察制得的寬殼全海筍卵細(xì)胞的石蠟切片，結(jié)果表明，寬殼全海筍成熟未受精卵核相處于第一次成熟分裂前期，有明顯的生發(fā)泡和核仁；受精后6-9min，生發(fā)泡逐漸萎縮、破裂；受精后20min、 30min，受精卵先后排出第一、第二極體；受精后50 min,受精卵分裂成2個大小不等的卵裂球；受精后65 - 70min，分裂為4細(xì)胞。實驗中也發(fā)現(xiàn)了少量的多精入卵和多極分離現(xiàn)象。
權(quán)利要求
1、一種海洋貝類卵細(xì)胞的石蠟切片方法，其特征在于包括下述步驟①樣品固定先用冷的Bouin氏液將樣品固定20-40min，待樣品自然沉降或低速離心后，用吸管除去上清液，至少更換二次固定液，然后再用Bouin氏液固定5小時后，移入70％酒精中，置4℃冰箱中保存；②卵細(xì)胞預(yù)處理向盛有卵細(xì)胞的離心管中加入幾滴1％的伊紅染液，染色1-2分鐘；用細(xì)針在稱量紙上刺些小孔，然后用稱量紙將染色后的卵細(xì)胞包起來，以使卵子在處理時不會漏出；③脫水與透明程序?qū)⒂梅Q量紙包好的卵細(xì)胞置于脫水機(jī)或染色缸中，用梯度乙醇脫水；先后采用70％乙醇脫水50分鐘、85％乙醇脫水50分鐘2次、95％乙醇脫水45分鐘2次、100％乙醇脫水45分鐘2次；然后用1∶1(體積比)的無水乙醇/二甲苯過渡處理25分鐘，再用二甲苯處理20分鐘2次，使之透明；④透蠟和包埋用1∶1(體積比)的二甲苯∶石蠟過渡處理40分鐘，52～56℃熔點的石蠟透蠟1小時2次；將紙包打開，將卵子置于包埋盒中，加注融蠟進(jìn)行包埋；⑤切片和烤片用生物切片機(jī)切片，切片厚度5μm，蠟帶用40℃恒溫水浴展片，貼于事先涂有粘片劑的載玻片上，然后在烤片機(jī)上烘干；⑥染色與封片染色采用伊紅-蘇木精復(fù)染方法，其中用蘇木精染色6～8分鐘，伊紅染色1.5～2分鐘；然后用中性樹膠封片。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋貝類卵細(xì)胞的石蠟切片方法，其特征在于所述的Bouin氏液配方為苦味酸飽和液、甲醛和冰醋酸的混合溶液，三者的體積比冰醋酸甲醛苦味酸飽和液為h 5: 15。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的海洋貝類卵細(xì)胞的石蠟切片方法，其特征在于所述的蘇木精染液配方為2g蘇木精溶于250mL無水乙醇中，10g硫酸鋁溶于750mL水中，兩液混合，加熱沸騰3分鐘，稍冷卻加入碘酸鈉0. 5g,檸檬酸1.0g，溶解后即得到蘇木精染液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋貝類卵細(xì)胞的石蠟切片方法，其特征在于所述的伊紅染液為1%的伊紅溶液，用70%乙醇溶解。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種海洋貝類卵細(xì)胞的石蠟切片方法，其包括固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色、封片等步驟，其特點是克服了貝類卵子體積小而難以浸蠟和包埋的問題，改進(jìn)了蘇木精-伊紅染色方法，獲得了良好的切片和染色效果。本方法簡單易行，毋需增加儀器設(shè)備，可對直徑≥40微米的大多數(shù)海洋貝類的卵細(xì)胞進(jìn)行石蠟切片，其中脫水、透明、透蠟步驟間均有過渡步驟，多為兩步處理，使試劑逐漸完全地進(jìn)入組織，完好地保存組織的原有結(jié)構(gòu)，為貝類受精及早期胚胎發(fā)育研究提供了有效的研究手段。
文檔編號G01N1/28GK101650273SQ20091010134
公開日2010年2月17日 申請日期2009年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月30日
發(fā)明者林志華, 董迎輝 申請人:浙江萬里學(xué)院