專利名稱：一種蜂膠與楊樹膠的鑒別方法
技術領域：
本發(fā)明屬食品、藥品質(zhì)量控制方法，主要涉及一種蜂膠質(zhì)量控制方法，該 方法是利用液相色譜進行蜂膠與楊樹膠的鑒別。
背景技術：
蜂膠是蜜蜂采集植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的 膠粘性物質(zhì)。蜂膠具有預防創(chuàng)傷感染、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血脂、降血糖以
及抗病原微生物等多種生物學作用，現(xiàn)己廣泛用于保健行業(yè)，并于2005年被列 入中華人民共和國藥典。隨著人們生活水平的提高，國內(nèi)外市場對蜂膠的需求 量日益增大。
由于蜂膠產(chǎn)量少，價格相對較高， 一些不法分子用楊樹芽提取物來假冒蜂 膠提取物，這些楊樹膠在顏色、氣味、形狀上都與真蜂膠十分相似。這種假蜂 膠的生產(chǎn)成本要大大低于真蜂膠，用其制成的蜂膠產(chǎn)品，自然成本就低了很多。 假蜂膠盡管在總黃酮等方面有與真蜂膠相似之處，但它沒有蜜蜂在加工蜂膠過 程中所添加的某些生理活性物質(zhì)，而且假蜂膠的原料及加工過程會帶來很多不 安全因素，因此，用偽劣楊樹膠作原料的產(chǎn)品流入市場，貽害無窮。而我國現(xiàn) 有的蜂膠國家標準和行業(yè)標準中主要的檢測項目是狀態(tài)、氣味、顏色、乙醇 提取物含量、蜂蠟、氧化時間、總黃酮含量等。這些指標無法檢測出摻有楊樹 膠的蜂膠，更無法分辨提純過的蜂膠和楊樹膠。由于缺少相應的真假蜂膠鑒別 的方法，質(zhì)量監(jiān)管部門及加工、貿(mào)易企業(yè)無法在蜂膠生產(chǎn)和流通過程中進行有 效的監(jiān)管和控制，假蜂膠以假亂真，使真蜂膠的價值無法體現(xiàn)，消費者的權益 無法得到保障。因此，如何高效準確地鑒定蜂膠的質(zhì)量和真?zhèn)尉哂惺种匾?應用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蜂膠與楊樹膠的鑒別方法，該方法通過準確高 效的液相色譜法對以楊樹為主要膠源植物生產(chǎn)的蜂膠與楊樹膠進行鑒別，以控 制蜂膠質(zhì)量。
本發(fā)明的目的是通過以下方案實現(xiàn)
(1)將蜂膠用95%乙醇超聲提取、離心、過濾，得到蜂膠提取溶液；
3(2) 除去蜂膠乙醇提取液中的乙醇，加入氯仿萃取，用分液漏斗除去氯仿
相，反復幾次，留下水相，揮凈水相中的氯仿，用流動相定容；
(3) 用反相高效液相色譜儀進行分析，得到蜂膠的色譜(4) 重復上述(l)、 (2)、 (3)的方法，得到楊樹膠和摻有楊樹膠的蜂膠的色譜
(5) 將純蜂膠，楊樹膠和摻有楊樹膠的蜂膠的色譜圖進行比較，從而判斷 蜂膠的真假。
本發(fā)明所述的液相色譜儀的條件為流速為0.5 1.0mL/min，檢測波長為 213 220nm或260 270nm，進樣量為2 10pL，色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18 (4.6x250mm, 5pm)或相當?shù)纳V柱，柱溫為25 3(TC。
本發(fā)明所述的流動相為甲醇0.5%H3PO4=14 : 86 (容積比)。 本發(fā)明的另一個目的是提供該蜂膠與楊樹膠的鑒別方法在蜂膠與楊樹膠 鑒別中的應用。
本發(fā)明所述的蜂膠指紋圖譜中有兩個明顯的峰，而相同條件下楊樹膠中不 含有這兩個峰，根據(jù)這兩個峰出現(xiàn)的先后分別編號為1號峰和2號峰；楊樹膠指 紋圖譜中有兩個明顯的峰，在相同條件下蜂膠中不含有這兩個峰，分別編號為 3號峰和4號峰。根據(jù)上述方法，分別測定了蜂膠、楊樹膠和摻入不同比例的蜂 膠的指紋圖譜。由得到的色譜圖可知，蜂膠指紋圖譜中含有1號和2號特征峰， 不含有3號和4號峰；楊樹膠指紋圖譜中含有3號和4號峰，不含有1號和2號峰； 而摻有10 30%楊樹膠的蜂膠中同時含有1、 2、 3和4號峰。
本發(fā)明經(jīng)采自不同地區(qū)的以楊樹為主要膠源植物生產(chǎn)的蜂膠樣本進行反 復驗證，證明該方法分離效果好、靈敏度高，可行性強，因此，可以鑒別蜂膠 與楊樹膠，同時可以判斷蜂膠中是否摻入楊樹膠。
本發(fā)明方法運用HPLC法進行蜂膠質(zhì)量控制，方法中所涉及的蜂膠與楊樹 膠各自特征峰明顯，相互間沒有干擾，易鑒別，因此不需使用質(zhì)譜、標準品等 進行確證，降低了成本，而且本發(fā)明方法靈敏度高，易掌握。


圖l為實例l蜂膠的色譜圖。
圖2為實例1楊樹膠的色譜圖。
圖3為實例1摻入10%楊樹膠的色譜圖。
圖4為實例1摻入20%楊樹膠的色譜圖。
圖5為實例1摻入3 0%楊樹膠的色譜圖。圖6為實例2蜂膠的色譜圖。 圖7為實例2楊樹膠的色譜圖。 圖8為實例3蜂膠的色譜圖。 圖9為實例3楊樹膠的色譜圖。 圖10為實例4蜂膠的色譜圖。 圖11為實例4楊樹膠的色譜圖。 圖12為實例5蜂膠的色譜圖。 圖13為實例5楊樹膠的色譜圖。 具體實施方案
本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進一步的說明。
實施例1:
取蜂膠10g，用80mL95。/。乙醇超聲溶解，離心，過濾，得到蜂膠溶液，用 真空干燥法除去乙醇，加入少量水，用氯仿萃取，除去水溶部分的殘留氯仿， 用流動相定容到25mL，混勻，用0.22,濾膜過濾，用HPLC分析。采用Agilent XDB-C18 (4.6x250mm，5pm)的色譜柱，流速調(diào)整至0.6 mL/min，檢測波長220 nm，柱溫3(TC，進樣量5pL。參見圖l。圖中1號峰和2號峰為蜂膠特征峰。
取楊樹膠2.5g，用80mL95。/。乙醇超聲溶解，離心，過濾，得到楊樹膠溶液， 用真空干燥法除去乙醇，加入少量水，用氯仿萃取，除去水溶部分的殘留氯仿， 用流動相定容到25mL，混勻，用0.22pm濾膜過濾，用HPLC分析。采用Agilent XDB-C18 (4.6x250mm, 5,)的色譜柱，流速調(diào)整至0.6 mL/min，檢測波長220 nm，柱溫3(TC，進樣量5^L。參見圖2。圖中3號峰和4號峰為楊樹膠特征峰。
取摻入10°/。、 20。/。和30。/。楊樹膠的蜂膠各10g，分別用80mL 95%乙醇超聲 溶解，離心，過濾，用真空干燥法除去乙醇，加入少量水，用氯仿萃取，除去 水溶部分的殘留氯仿，用流動相定容到25mL，混勻，用0.22^im濾膜過濾，用 HPLC分析。采用Agilent XDB-C18 (4.6x250mm, 5[im)的色譜柱，流速調(diào)整至 0.6mL/min，檢測波長220nm，柱溫3(TC，進樣量5jiL。分別見圖3、圖4和圖5。 圖中1號峰和2號峰為蜂膠的特征峰，而3號和4號峰為楊樹膠的特征峰。
根據(jù)上述方法，分別測定了蜂膠，楊樹膠和摻入10°/。、 20%和30%楊樹膠 的蜂膠指紋圖譜，其中圖譜中1號峰和2號峰為蜂膠特征峰，是楊樹膠中不含有 的，而3號峰和4號峰為楊樹膠特征峰，蜂膠中不具有這兩個峰。摻入10%、 20% 和30%楊樹膠的蜂膠中均可同時檢出1、 2、 3和4號特征峰。因此，可以以此鑒 別蜂膠與楊樹膠以及蜂膠中是否摻有楊樹膠。
5實施例2:
取蜂膠10g，用80mL95。/。乙醇超聲溶解，離心，過濾，得到蜂膠溶液，用 真空干燥法除去乙醇，加入少量水，用氯仿萃取，除去水溶部分的殘留氯仿， 用流動相定容到25mL，混勻，用0.22nm濾膜過濾，用HPLC分析。采用Agilent XDB-C18 (4.6x250mm，5pm)的色譜柱，流速調(diào)整至0.5 mL/min，檢測波長213 nm，柱溫25""C，進樣量2pL。
取楊樹膠2.5g，用80mL95。/。乙醇超聲溶解，過濾，得到楊樹膠溶液，用真 空干燥法除去乙醇，加入少量水，用氯仿萃取，除去水溶部分的殘留氯仿，用 流動相定容到25mL，混勻，用0.22pm濾膜過濾，用HPLC分析。采用Agilent XDB-C18 (4.6x250mm， 5,)的色譜柱，流速調(diào)整至0.5 mL/min，檢測波長213 nm，柱溫25'C，進樣量2)iL。
根據(jù)上述方法，分別測定了蜂膠(圖6)和楊樹膠(圖7)的指紋圖譜，其 中圖6中1號峰和2號峰為蜂膠特征峰，是楊樹膠中不含有的；而圖7中3號峰和4 號峰為楊樹膠特征峰，是蜂膠中不含有的。因此，可以以此鑒別蜂膠與楊樹膠。
實施例3:
取蜂膠10g，用80mL95。/。乙醇超聲溶解，過濾，得到蜂膠溶液，用真空干 燥法除去乙醇，加入少量水，用氯仿萃取，除去水溶部分的殘留氯仿，用流動 相定容到25mL，混勻，用0.22)im濾膜過濾，用HPLC分析。采用Agilent XDB-C18 (4.6x250mm，5(im)的色譜柱，流速調(diào)整至l mL/min，檢測波長268 nm，柱溫 30°C，進樣量10^iL。
取楊樹膠2.5g，用80mL95。/。乙醇超聲溶解，過濾，得到楊樹膠溶液，用真 空干燥法除去乙醇，加入少量水，用氯仿萃取，除去水溶部分的殘留氯仿，用 流動相定容到25mL，混勻，用0.22pm濾膜過濾，用HPLC分析。采用Agilent XDB-C18(4.6x250mm, 5pm)的色譜柱，流速調(diào)整至l mL/min，檢測波長268 nm， 柱溫30'C，進樣量10(iL。
根據(jù)上述方法，分別測定了蜂膠(圖8)和楊樹膠(圖9)的指紋圖譜，其 中圖8中1號峰和2號峰為蜂膠特征峰，是楊樹膠中不含有的；而圖9中3號峰和4 號峰為楊樹膠特征峰，是蜂膠中不含有的。因此，可以以此鑒別蜂膠與楊樹膠。
實施例4:
取蜂膠10g，用80ml 95%乙醇超聲溶解，過濾，得到蜂膠溶液，用真空干燥法除去乙醇，加入少量水，用氯仿萃取，除去水溶部分的殘留氯仿，用流動
相定容到25ml，混勻，用0.22um濾膜過濾，用HPLC分析。采用Agilent XDB-C18(4.6X250mm， 5pm)的色譜柱，流速調(diào)整至0.6 ml/min，檢測波長 265nm，柱溫28。C，進樣量10jiL。
取楊樹膠2.5g，用80ml95。/。乙醇超聲溶解，過濾，得到楊樹膠溶液，用真 空干燥法除去乙醇，加入少量水，用氯仿萃取，除去水溶部分的殘留氯仿，用 流動相定容到25ml，混勻，用0.22pm濾膜過濾，用HPLC分析。采用Agilent XDB-C18 (4.6X250mm， 5pm)的色譜柱，流速調(diào)整至0.6 ml/min，檢測波長 265nm，柱溫28'C，進樣量10jiL。
根據(jù)上述方法，分別測定了蜂膠(圖IO)和楊樹膠(圖ll)的指紋圖譜， 其中圖10中1號峰和2號峰為蜂膠特征峰，是楊樹膠中不含有的；而圖11中3號 峰和4號峰楊樹膠特征峰，是蜂膠中不含有的。因此，可以以此鑒別蜂膠與楊 樹膠。
實施例5:
取蜂膠10g，用80ml 95%乙醇超聲溶解，過濾，得到蜂膠溶液，用真空干 燥法除去乙醇，加入少量水，用氯仿萃取，除去水溶部分的殘留氯仿，用流動 相定容到25ml，混勻，用0.22pm濾膜過濾，用HPLC分析。采用AgilentXDB-C18 (4.6X250mm, 5pm)的色譜柱，流速調(diào)整至0.8 ml/min，檢測波長220nm，柱 溫26'C，進樣量8jiL。
取楊樹膠2.5g，用80ml95。/。乙醇超聲溶解，過濾，得到楊樹膠溶液，用真 空干燥法除去乙醇，加入少量水，用氯仿萃取，除去水溶部分的殘留氯仿，用 流動相定容到25ml，混勻，用0.22um濾膜過濾，用HPLC分析。采用Agilent XDB-C18 (4.6X250mm, 5pm)的色譜柱，流速調(diào)整至0.8 ml/min，檢測波長 220nm，柱溫26。C，進樣量8pL。
根據(jù)上述方法，分別測定了蜂膠(圖12)和楊樹膠(圖13)的指紋圖譜， 其中圖12中1號峰和2號峰為蜂膠特征峰，是楊樹膠中不含有的；而圖13中3號 峰和4號峰為楊樹膠特征峰，是蜂膠中不含有的。因此，可以以此鑒別蜂膠與 楊樹膠。
權利要求
1.一種蜂膠與楊樹膠的鑒別方法，通過以下方案實現(xiàn)(1)將蜂膠、楊樹膠和摻有楊樹膠的蜂膠分別用95％乙醇常規(guī)超聲提取、離心、過濾，分別得到蜂膠提取溶液、楊樹膠提取溶液和摻有楊樹膠的蜂膠提取溶液，(2)分別除去各提取液中的乙醇，加入氯仿萃取，用分液漏斗除去氯仿相，反復幾次，留下水相，揮凈水相中的氯仿，用流動相定容，(3)用反相高效液相色譜儀進行分析，分別得到蜂膠、楊樹膠和摻有楊樹膠的蜂膠的色譜圖，(4)將蜂膠，楊樹膠和摻有楊樹膠的蜂膠的色譜圖進行鑒別比較，從而判斷蜂膠的真假；步驟(3)所述的液相色譜儀的條件為流速為0.5～1.5mL/min，檢測波長為213～220nm，進樣量為2～10μL，選用4.6×250mm，5μm的Agilent EclipseXDB-C18色譜柱，柱溫為25～30℃。
2. 根據(jù)權利要求l所述的一種蜂膠與楊樹膠的鑒別方法，其特征在于，步 驟(2)所述的流動相的容積比為甲醇0.5。/。H3PO4-14:86。
3. 根據(jù)權利要求l所述的一種蜂膠與楊樹膠的鑒別方法，其特征在于，步 驟(3)所述的檢測波長選用260 270nm。
4. 權利要求l所述的一種蜂膠與楊樹膠的鑒別方法在鑒別蜂膠與楊樹膠中 的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蜂膠與楊樹膠的鑒別方法，通過反相高效液相色譜儀分別測定了蜂膠、楊樹膠和摻入不同比例的蜂膠的指紋圖譜，通過指紋圖譜對比，判斷蜂膠的真假，以控制蜂膠質(zhì)量。本發(fā)明方法運用HPLC法進行蜂膠質(zhì)量控制，分離效果好、靈敏度高，可行性強，方法中所涉及的蜂膠與楊樹膠各自特征峰明顯，相互間沒有干擾，易鑒別，因此不需使用質(zhì)譜、標準品等進行確證，降低了成本，而且本發(fā)明方法靈敏度高，易掌握，本發(fā)明方法可在蜂膠與楊樹膠鑒別中應用，可以鑒別蜂膠與楊樹膠，同時可以判斷蜂膠中是否摻入楊樹膠。
文檔編號G01N30/00GK101620208SQ200910101428
公開日2010年1月6日 申請日期2009年8月6日 優(yōu)先權日2009年8月6日
發(fā)明者張翠平, 胡福良 申請人:浙江大學