專利名稱：多重熒光 p c r同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及 對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的引物、探針、試劑盒及其檢測 方法。
背景技術：
白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)是對蟲下 白斑綜合征(white spot syndrome, WSS)的致病原，WSS是全球?qū)ξr 養(yǎng)殖業(yè)危害性最大的病害之一，是國際獸醫(yī)局(OIE)規(guī)定需要報告的 重要水生動物疾病，在我國農(nóng)業(yè)部2008年新發(fā)布的動物傳染病名錄 中被列為一類傳染病。自20世紀90年代初首先在我國臺灣地區(qū)發(fā)生 以來，至今已在世界各國的對蝦養(yǎng)殖地區(qū)流行，造成巨大的經(jīng)濟損失。 WSSV宿主十分廣泛，由該病毒引起的病害傳播迅速，可導致斑節(jié)對 蟲下(尸e/ aews /Z70/7ot/o/7)、 曰本對蟲下(尸.j'a/ oz icws)、 中國X寸蟲下 (尸e/7/ erope/5aezAS c力j-;7e/7SJ'51)、 印度對蟲下(尸.i/ Jic〃61)、 南美白對 蟲下(尸.ra/7/7a/z7^0、褐對蟲下(尸.a^ec〃s)、杉^紅對蟲下(尸.a^orar〃/z ) 等對蝦感染發(fā)病大規(guī)模死亡。對蝦傳染性皮下及造血器官壞死病 (Infections Hypodermal and Haematopoietic Nerosis Viurs IHHNV ) 也是世界各地養(yǎng)殖對蝦常見的傳染病之一，被國際獸醫(yī)局(OIE)列為 重要的甲殼動物傳染病。該病首先在夏威夷紅額角對蝦(尸. Wy">0"7^s)仔蝦體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，后來發(fā)現(xiàn)該病毒在亞洲和太平洋地區(qū) 廣泛存在。IHHNV主要危害紅額角對蝦，發(fā)病后死亡率可高達90%，
5對稚蝦和幼蝦危害最嚴重。對南美白對蝦、斑節(jié)對蝦和日本對蝦 也有較大危害，可導致慢性矮小殘缺綜合癥。該病毒還可感染短溝
對蟲下(尸.se加's^ca^s)、印度對蟲下、中國對蟲下和加州對蟲下(A c^J'/br/7ie77W^)。我國是養(yǎng)蟲下大國，對蝦養(yǎng)殖是我國許多沿海省市 的支柱產(chǎn)業(yè)，建立快速、準確的WSSV和IHHNV檢測方法，可以為口 岸動物檢疫提供檢測依據(jù)，有效地控制這些病害的傳播，應用到生產(chǎn) 實踐中，可以為預防這些傳染病提供診斷依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供了一種多重熒光PCR 同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病 毒的引物、探針、試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明具有特異性好，檢測 方法快速簡便，準確性高，靈敏度高的特點。
為達到上述的目的，本發(fā)明采用如下技術方案
一種多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性 皮下和造血器官壞死病毒的引物，由檢測對蝦白斑綜合征病毒(WSSV) 的正向引物FP1和反向引物RP1以及檢測對蝦傳染性皮下和造血器官 壞死病毒(I朋NV)的正向引物FP2和反向引物RP2組成；其中檢測 對蝦白斑綜合征病毒的引物的正向引物FP1的序列SEQ ID NO. 1和反 向引物RP1的序列SEQ ID NO. 2如下
SEQ ID NO. 1: 5' - TGGAATGTCATCGCCAGCAC -3';
SEQ ID NO. 2: 5, _ CAGTTCAGATTCGTTACCGTTTCC -3';
檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的引物的正向引物FP2 的序列SEQ ID NO. 4和反向引物RP2的序列SEQ ID NO, 5如下
SEQ ID NO. 4: 5， - GACATAGAGCTACAATCCTCGCCTAT-3，；
SEQ ID NO. 5: 5， - CAAGTACCGTAGTCGCTTCAGCTT -3，。一種多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性
皮下和造血器官壞死病毒的探針，由檢測對蝦白斑綜合征病毒(wssv)
的探針LP1和檢測對蟲下傳染性皮下和造血器官壞死病毒(I朋NV)的 探針LP2組成；其中檢測對蝦白斑綜合征病毒的引物配合使用的探針
LP1的核苷酸序列為
SEQ ID NO. 3: 5' - CACCGCCGACGCCAAGGGAACTG -3';
檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的引物配合使用的探 針LP2的核苷酸序列為
SEQ ID NO. 6: 5' - TGGGAGTTACCTTTGCTGCCAGAGCC -3'。
一種多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性 皮下和造血器官壞死病毒的試劑盒，該試劑盒包括檢測對蝦白斑綜合 征病毒(WSSV)的正向引物FP1和反向引物RP1，檢測對蝦傳染性皮 下和造血器官壞死病毒(IHHNV)的正向引物FP2和反向引物RP2; 以及檢測對蟲下白斑綜合征病毒(WSSV)的探針LP1和檢測對蝦傳染性 皮下和造血器官壞死病毒(IHHNV)的探針LP2。
一種多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性 皮下和造血器官壞死病毒的檢測方法，包括如下步驟
(1) 根據(jù)上述引物、探針的核苷酸序列信息合成引物FP1、 FP2、 RP1、 RP2和探針LP1、 LP2的試劑盒，其中探針一端標記有報告熒光 染料，另一端標記有淬滅熒光染料；上述探針和引物分別配制成濃度 為20 umol/L的溶液備用；
(2) 采集健康和表現(xiàn)臨床病狀的活對蝦制備總DNA溶液，并從 中分別提取健康活對蝦的總DNA模板和病癥對蝦的總DNA模板備用；
(3) 然后以總DNA為模板，利用核苷酸序列為SEQ ID NO. 1的 引物FP1、核苷酸序列為SEQ ID NO. 2的引物RP1、核苷酸序列為SEQID NO. 4的引物FP2、核苷酸序列為SEQ ID NO. 6的引物RP2以及核 苷酸序列為SEQ ID NO. 3的探針LP1和核苷酸序列為SEQ ID NO. 3的 探針LP2進行實時熒光PCR檢測，每個循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)并繪制熒光 強度變化曲線，反應結(jié)束后根據(jù)曲線來分析判定對蝦白斑綜合征病毒 (WSSV)和對i下傳染性皮下和造血器官壞死病毒(IHHNV)的存在。
所述的探針一端標記有報告熒光染料是指探針LP1的5'端和探 針LP2的5'標記有報告熒光染料，所述的另一端標記有淬滅熒光染 料是指LP1的3'端和LP2的3'端標記有淬滅熒光染料。
所述的報告熒光染料采用FAM熒光染料或HEX熒光染料中的一 種；淬滅熒光染料采用Eclipse熒光染料；其中探針LP1的5'端標 記有FAM熒光染料，LP2的5，標記有HEX熒光染料；LP1的3，端和 LP2的3'端都標記有Eclipse熒光染料。報告熒光染料和淬滅熒光 染料兩者之間構成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構，即報告熒光染料所發(fā)射的熒光可被 淬滅熒光染料吸收，當二者距離變遠時，抑制作用減弱，報告熒光染 料信號增強。在擴增反應過程中，探針同模板上的目的擴增片段雜交， 由于&《酶具有5'端到3'端的外切酶活性，在擴增延伸階段將探 針切斷，淬滅熒光染料的抑制作用消失，報告熒光染料信號增強，從 而實現(xiàn)對單個目的基因的檢測。
所述的熒光PCR檢測中，反應條件是在50 yL反應體系中加入 25 uL超纟屯7jC、 5 u L 10 XPCR buffer、 5 uLMgCI2 (25 mM) 、 4 uL dNTP(10mM)、1 u L Taq酶(2. 5U/u L )、1 p L引物FP1 (20 u mol/L)、 1 uL引物FP2 (20 umol/L)、 0.5 p L引物RP1 (20 "mol/L)、 0.5 uL引物RP2 (20 umol/L)、 0.5 u L探針LP1 (5 pmol/L)、 0. 5 ix L 探針LP2 (20 Pmol/L)、 6 p L模板DNA;熱循環(huán)參數(shù)為第一個循 環(huán)為95。C 10min;隨后40個循環(huán)95°C 15s， 60°C lmin。所述的熒光PCR檢測過程中退火溫度采用60°C 。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明基于復合熒光PCR原理，利用 TaqMan探針與目的基因的特異性反應，通過檢測不同的熒光信號， 可以同時對同一反應體系中的兩種探針進行檢測，從而實現(xiàn)對兩種目 的基因的檢測，檢測過程由儀器自動完成，可實時監(jiān)控，快速準確。 本發(fā)明選擇WSSV和IHHNV兩種病毒的基因序列，設計熒光標記探針 和引物，建立同時檢測對蝦WSSV和IHHNV兩種病毒的復合熒光PCR 檢測方法，反應結(jié)束即可根據(jù)擴增曲線判定樣品中是否有WSSV和 IHHNV。本發(fā)明選用的這兩條探針特異性好，用于熒光PCR檢測靈敏 性高，而且互相干擾較小。所建立的方法準確性高、靈敏度高，能夠 快速簡單地判斷樣品中是否含有WSSV和IHHNV。


圖1是本發(fā)明多重熒光PCR技術同時檢測對蝦白斑綜合征病毒和 對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的熒光強度變化曲線圖2是本發(fā)明檢測對蝦白斑綜合征病毒的靈敏度測試曲線圖； 圖3是本發(fā)明檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的靈敏 度測試曲線圖。
具體實施例方式
本實施例的一種多重熒光PCR同時檢測對蟲下白斑綜合征病毒及 對蟲下傳染性皮下和造血器官壞死病毒的弓I物，由檢測對蝦白斑綜合征 病毒(WSSV)的正向引物FP1和反向引物RP1以及檢測對蝦傳染性皮 下和造血器官壞死病毒(IHHNV)的正向引物FP2和反向引物RP2組 成；其中檢測對蝦白斑綜合征病毒的引物的正向引物FP1的序列SEQ ID NO. 1和反向引物RP1的序列SEQ ID NO. 2如下SEQ ID N0.1: 5, _ TGGAATGTCATCGCCAGCAC -3';
SEQ ID NO. 2: 5' - CAGTTCAGATTCGTTACCGTTTCC -3';
檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的引物的正向引物FP2 的序列SEQ ID NO. 4和反向引物RP2的序列SEQ ID NO. 5如下
SEQ ID NO. 4: 5' - GACATAGAGCTACAATCCTCGCCTAT-3';
SEQ ID NO. 5: 5， - CAAGTACCGTAGTCGCTTCAGCTT -3，。
一種多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性 皮下和造血器官壞死病毒的探針，由檢測對蟲下白斑綜合征病毒(WSSV) 的探針LP1和檢測對蟲下傳染性皮下和造血器官壞死病毒(IHHNV)的 探針LP2組成；其中檢測對蝦白斑綜合征病毒的引物配合使用的探針 LP1的核苷酸序列為
SEQ ID NO. 3: 5' - CACCGCCGACGCCAAGGGAACTG -3';
檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的引物配合使用的探 針LP2的核苷酸序列為
SEQ ID NO. 6: 5' - TGGGAGTTACCTTTGCTGCCAGAGCC -3'。
首先進行引物和探針的合成
根據(jù)上述核苷酸序列信息合成引物FP1、 FP2、 RP1、 RP2和探針 LP1、 LP2，在探針LP1的5'端用FAM熒光染料標記，探針LP2的5' 端用HEX熒光染料標記，3'端都用Eclipse熒光染料標記。將上述 引物和探針分別配制成濃度為20 umol/L的溶液作為試劑盒，備用。
其次是總DNA的提取(現(xiàn)有技術)
1)分別采集適量的健康和表現(xiàn)臨床病狀的活對蝦，取鰓絲、肝 胰腺、腹肢以及肌肉組織剪碎后，用液氮充分研磨混勻。從中取約 30 mg置于1. 5mL離心管中，按照OMEGA公司動物組織DNA抽提試劑 盒方法分別制備健康總DNA樣品溶液和病癥總DNA樣品溶液。
102) 加入200 pL裂解液(TL)和25 uL蛋白酶K，漩渦混勻， 55。C水浴約1 h，并不斷搖動，至組織完全消化。
3) 室溫，12000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。
4) 加入200 uL緩沖液(BL)， 70。C水浴10min;加入200 uL 無水乙醇，混勻。
5) 將離心管中的溶液轉(zhuǎn)移到HiBind DNA柱中，12000 r/min離 心2 min，棄收集管。
6) 將HiBindDNA柱子套在新的收集管，加入750 u L洗滌緩沖 液，12000 r/min離心1 min，棄離心液。
7) 重復步驟6)，然后12000 r/min再離心1 min。
8) 將HiBind DNA柱子置于l. 5 mL滅菌離心管中，加入50uL 70 "C預熱的DNA洗脫液，室溫靜置2 min。
9) 12000 r/min離心2 min。離心管中的液體即為提取的DNA 模板。檢測DNA濃度及質(zhì)量，備用。
再是實時PCR擴增
1、建立實時熒光PCR反應體系
取上述總DNA模板液分別配制成含1. 6 ng DNA的健康模板液和 1.6 ng DNA的病癥模板液，另外配制分別含有104拷貝/pL的WSSV 和I朋NV的陽性質(zhì)粒DNA作為陽性對照，建立三個反應體系，分別進 行如下實時熒光PCR反應
在3個50 u L反應體系中都加入25 y L超純水、5 u L 10XPCR buffer、 5 u L Mg CI2 (25 mM) 、 4 " L dNTP(10mM) 、 1 P L Taq酶 (2. 5U/uL )、 1 tiL引物FPl (20 umol/L)、 1 p L引物FP2 (20 umol/L)、 0.5 uL引物RPl (20 Pmol/L)、 0.5 pL引物RP2 (20umol/L)、 0.5 uL探針LPl (5 umol/L)、 0.5 u L探針LP2 (20 umol/L)、 6 uL模板DNA。然后在三個反應體系中分別加入1. 6 ng 的健康對蝦總DNA、病癥對蝦總DNA和陽性對照總DNA模板液。
2、 實時熒光PCR反應
將樣品分管放入ABI公司ABI 7300型號熒光PCR儀后，設置如 下條件進行反應第一個循環(huán)為95。C10 min;隨后40個循環(huán)，95°C 15s， 60°C lmin。反應過程中退火溫度為60°C，每個循環(huán)結(jié)束后采 集數(shù)據(jù)。熒光強度變化曲線如圖l所示。由圖l可以看出通過實時 熒光PCR檢測可觀察到病癥對蟲下和陽性對照均出現(xiàn)2條明顯的S型擴 增曲線，曲線1為WSSV陽性對照擴增曲線，曲線2為I朋NV陽性對 照擴增曲線，曲線3為臨床樣品WSSV擴增曲線，曲線4為臨床樣品 IHHNV擴增曲線，5、 6為健康對蝦樣品無擴增曲線?？梢钥闯霾捎?上述方法對WSSV和IHHNV的檢測很準確和靈敏。
3. 靈敏度測試
用超純水將陽性質(zhì)粒標準品作模板進行梯度稀釋，進行相對靈敏 度檢測，的進行實時熒定量分析，在50 u L反應體系中，WSSV和IHHNV 陽性質(zhì)粒DNA含量分別為108、 107、 106、 105、 104、 103、 1()2和101 拷貝/pL，如圖2、圖3所示圖中的1-8的標號分別為陽性質(zhì)粒DNA含 量為108、 107、 106、 105、 104、 103、 102、 104考貝AiL的標號。
按照如上方法，使用本發(fā)明的引物FP1、 FP2、 RP1、 RP2和探針 LP1、 LP2以及反應體系測試本發(fā)明方法的檢測靈敏度，結(jié)果如圖2 和圖3所示，圖2為不同濃度的WSSV陽性質(zhì)粒DNA擴增曲線，圖3 為不同濃度的IHHNV陽性質(zhì)粒DNA擴增曲線，結(jié)果表明本發(fā)明方法對 WSSV和IHHNV的最低檢測限可達1(V拷貝/ u L，本發(fā)明方法用于檢測 WSSV和IHHNV非常靈敏，效果非常好。
權利要求
1、一種多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的引物，其特征在于由檢測對蝦白斑綜合征病毒的正向引物FP1和反向引物RP1以及檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的正向引物FP2和反向引物RP2組成；其中檢測對蝦白斑綜合征病毒的引物的正向引物FP1的序列SEQ ID NO.1和反向引物RP1的序列SEQ ID NO.2如下SEQ ID NO.15′-TGGAATGTCATCGCCAGCAC-3′；SEQ ID NO.25′-CAGTTCAGATTCGTTACCGTTTCC-3′；檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的引物的正向引物FP2的序列SEQ ID NO.4和反向引物RP2的序列SEQ ID NO.5如下SEQ ID NO.45’-GACATAGAGCTACAATCCTCGCCTAT-3’；SEQ ID NO.55’-CAAGTACCGTAGTCGCTTCAGCTT-3’。
2、 一種多重熒光PCR同時檢測對蟲下白斑綜合征病毒及對蟲下傳染 性皮下和造血器官壞死病毒的探針，其特征在于由檢測對蟲下白斑綜 合征病毒的探針LP1和檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的 探針LP2組成；其中檢測對蝦白斑綜合征病毒的引物配合使用的探針 LP1的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3: 5' - CACCGCCGACGCCAAGGGAACTG -3'; 檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的引物配合使用的探 針LP2的核苷酸序列為SEQ ID NO. 6: 5, - TGGGAGTTACCTTTGCTGCCAGAGCC -3'。
3、 一種多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染 性皮下和造血器官壞死病毒的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括權利要求1所述的檢測對蝦白斑綜合征病毒的正向引物FP1和反向引物RP1，檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的正向引物FP2和反 向引物RP2;以及權利要求2所述的檢測對蝦白斑綜合征病毒的探針 LP1和檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的探針LP2。
4、 一種多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染 性皮下和造血器官壞死病毒的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟(1) 根據(jù)權利要求1和權利要求2的引物、探針的核苷酸序列 信息合成引物FP1、 FP2、 RP1、 RP2和探針LP1、 LP2的試劑盒，其中 探針一端標記有報告熒光染料，另一端標記有淬滅熒光染料；上述探 針和引物分別配制成濃度為20 u mol/L的溶液備用；(2) 采集健康和表現(xiàn)臨床病狀的活對蝦制備總DNA溶液，并從 中分別提取健康活對蝦的總DNA模板和病癥對蝦的總DNA模板備用；(3) 然后以總DNA為模板，利用核苷酸序列為SEQ ID NO. 1的 引物FP1、核苷酸序列為SEQ ID NO. 2的引物RP1、核苷酸序列為SEQ ID NO. 4的引物FP2、核苷酸序列為SEQ ID NO. 6的引物RP2以及核 苷酸序列為SEQ ID NO. 3的探針LP1和核苷酸序列為SEQ ID NO. 3的 探針LP2進行實時熒光PCR檢測，每個循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)并繪制熒光 強度變化曲線，反應結(jié)束后根據(jù)曲線來分析判定對蝦白斑綜合征病毒 和對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的存在。
5、 如權利要求4所述的多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征 病毒及對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的檢測方法，其特征在 于所述的探針一端標記有報告熒光染料是指探針LP1的5'端和探 針LP2的5'標記有報告熒光染料，所述的另一端標記有淬滅熒光染 料是指LP1的3'端和LP2的3'端標記有淬滅熒光染料。
6、 如權利要求5所述的多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的檢測方法，其特征在 于所述的報告熒光染料采用FAM熒光染料或HEX熒光染料；淬滅熒光染料采用Eclipse熒光染料；其中探針LP1的5'端標記有FAM熒 光染料，LP2的5'標記有HEX熒光染料；LP1的3'端和LP2的3' 端都標記有Eclipse熒光染料。
7、 如權利要求4所述的多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征 病毒及對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的檢測方法，其特征在 于所述的熒光PCR檢測中，反應條件是在50 "L反應體系中加入 25 PL超純水、5 uL 10XPCR buffer、 5 uLMgCI2 (25 mM) 、 4 y L dNTP(10mM)、1 y L Taq酶(2. 5U/u L )、1 uL引物FP1(20 umol/L)、 1 uL引物FP2 (20 umol/L)、 0.5卩L引物RP1 (20 iimol/L)、 0.5 uL引物RP2 (20 Pmol/L)、 0.5 u L探針LP1 (5 umol/L)、 0. 5 u L 探針LP2 (20 umol/L)、 6 uL模板DNA;熱循環(huán)參數(shù)為第一個循 環(huán)為95。C 10min;隨后40個循環(huán)95°C 15s， 60°C lmin。
8、 如權利要求4所述的多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征 病毒及對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的檢測方法，其特征在 于所述的熒光PCR檢測過程中退火溫度采用60°C 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的引物、探針，其中引物由檢測對蝦白斑綜合征病毒的正向引物FP1和反向引物RP1以及檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的正向引物FP2和反向引物RP2組成；探針由檢測對蝦白斑綜合征病毒的探針LP1和檢測對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的探針LP2組成；以及具有上述引物和探針的試劑盒和利用多重熒光PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒及對蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的檢測方法。本發(fā)明具有特異性好，檢測方法快速簡單，準確性高，靈敏度高的特點。
文檔編號G01N21/64GK101603098SQ200910111460
公開日2009年12月16日 申請日期2009年4月7日 優(yōu)先權日2009年4月7日
發(fā)明者聰 任, 昱 周, 孔繁德, 徐淑菲, 陳信忠, 龔艷清 申請人:廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心