專利名稱：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶電泳活性染色的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶的活性染色，尤其是涉及一種N-乙酰-P-D-氨基葡萄糖苷酶電泳活性染 色的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
酶作為診斷指標(biāo)具有簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)。NAGase是幾丁質(zhì)級(jí)聯(lián)催化降解途徑的關(guān)鍵酶之 一，廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)。在甲殼動(dòng)物體內(nèi)，NAGase與食物消化、幼體的孵 化、周期性蛻皮、抗菌防護(hù)等密切相關(guān)；人體內(nèi)，NAGase與糖尿病、腎病、乳腺癌、胃癌等 疾病有關(guān)，已作為生化指標(biāo)供這些疾病的診斷參考及檢測(cè)。
目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于NAGase的活力分析體系與方法研究已趨成熟完善，酶活力分析主要以 對(duì)硝基苯-N-乙酰-(3-D-氨基葡萄糖苷(pNp-P-D-GlcNAc)為底物，在偏酸性條件下，酶催化 底物水解的能力。該法能有效、簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)NAGase存在與活力大小，但該法對(duì)于酶的純 化制備、酶在生物體不同組織內(nèi)、不同生長(zhǎng)生理期的電泳活性染色是不適用的。迄今為止， 國(guó)內(nèi)外關(guān)于NAGase活性染色的研究還沒(méi)有系統(tǒng)地建立。1998年，Peter等([l] peters G, Saborowski R， Mentldn R, Buchholz F. Isoforms of N-acetyl國(guó)(3隱D隱gluGosaminidase from the Antarctic krill, Euphausia superba:purification and antibody production[J]Comparative Biochemistry and Physiology Part B 120(1998) 743-751 )報(bào)道萘酚AS-BI-N-乙酰-(5-D-氨基葡萄 糖苷為底物，用Fast Garnet GBC顯色對(duì)NAGase進(jìn)行電泳活性染色。具體步驟13 mg萘酚 AS-BI-N-乙酰-卩-D-氨基葡萄糖苷溶于2 ml乙二醇單甲醚，45 mg Fast Garnet GBC振蕩溶于2 ml 0.2mol/lCPB， pH5.5。再將凝膠置于混合液中，在35 。C下反應(yīng)15-30 min直至顯色明顯。最 后將凝膠放入脫色液(25%甲醇,10%乙酸)漂洗至背景色為暗黃色。國(guó)內(nèi)也有使用該法用于組 織染色的報(bào)道([2]黃幼蓉，苗德林.P-N-乙酰葡萄糖胺酶組織化學(xué)改良法在胃癌診斷中的應(yīng)用 [J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1994, 19(2): 146-147)。但該法存在使用的底物量大，成本較高，反 應(yīng)吋間較長(zhǎng)等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種N-乙酰-(3-D-氨基葡萄糖苷酶電泳活性染色的檢測(cè)方法。 本發(fā)明包括以下步驟1) 配制材料，配制材料包括配制反應(yīng)液、染色液和酶液；
2) 活性染色，活性染色包括以下步驟
(1) 配制Native-PAGE;
(2) 上樣將提取的對(duì)4下NAGase粗酶液上樣；
(3) 電泳在層析柜內(nèi)低溫電泳；
(4) 反應(yīng)電泳完取膠，用蒸餾水沖洗后，放入反應(yīng)液中，反應(yīng)后，用蒸餾水洗滌,-
(5) 染色放入染色液內(nèi)染色，取出用蒸餾水洗滌，放置在水中保存；
(6) 掃膠結(jié)果即可快速檢測(cè)NAGase的活性條帶。
在步驟l)中，所述配制反應(yīng)液是在底物l mg萘酚AS-BI-N-乙酰-(3-D-氨基葡萄糖苷 (SIGMA，N4006)力卩0.2 ml 95%乙醇助溶后，再加O.l mol/L pH 7.5的磷酸緩沖液溶解至20 ml; 所述配制染色液是將20 mg Fast Blue BB salt溶于IO ml 0.01 mol / L的Tris-HCl緩沖液；所述 Fast Blue BB salt可采用廈門泰京生物技術(shù)有限公司產(chǎn)的Fluka44670，所述Tris-HCl緩沖液的 pH最好為7.5， 4°C;所述配制酶液是用O.Ol mol/L的Tris-HCl緩沖液pH 7.5抽提凡納濱對(duì)蝦 NAGase粗酶液。
在步驟2) (1)中，所述Native-PAGE中含10。/。分離膠，5%濃縮膠。 在步驟2) (3)中，所述低溫電泳的電流最好為恒流20mA，低溫電泳的時(shí)間最好為4h。 在步驟2) (4)中，所述放入反應(yīng)液中最好放入37'C保溫的反應(yīng)液中，反應(yīng)5 10min后， 用蒸餾水洗滌2 3次。
在步驟2) (5)中，所述放入染色液內(nèi)染色最好是在4"C下染色5min，取出用蒸餾水洗 滌2 3次。
本發(fā)明利用N-乙酰-(3-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC 3.2丄52)在中性條件下將基質(zhì)液 中的萘酚AS-BI-N-乙酰-p-D-氨基葡萄糖苷水解，產(chǎn)生萘酚AS-BI能與不同的色基重氮鹽偶合 成不同的色調(diào)和牢度的偶氮染料，定性檢測(cè)N-乙酰-p-D-氨基葡萄糖苷酶在生物組織存在。
本發(fā)明提供一種快速靈敏、簡(jiǎn)便鑒定NAGase凝膠電泳的固藍(lán)BB鹽活性染色方法，以對(duì)
蝦提取的粗NAGase酶液為樣品，直接將粗酶制品上樣進(jìn)行凝膠電冰。電泳完成后，將凝膠放
在萘酚AS-BI-N-乙酰-P-D-氨基葡萄糖苷反應(yīng)液中浸泡5min，然后再在固藍(lán)BB鹽染色液中，在
4'C的條件下染色5min，即可將凝膠中的酶分子定位帶顯示出來(lái)。這種固藍(lán)BB鹽的活性染色
方法耗時(shí)短，與考馬斯亮藍(lán)染色相比，可以清楚確定酶蛋白的存在。本方法較之使用底物量
少，采用不同偶氮染料，故無(wú)須脫色，操作更簡(jiǎn)便快捷，是對(duì)NAGase電泳活性染色方法的改
進(jìn)，對(duì)NAGase快速檢測(cè)有重要意義。


圖l為NAGase的Native-PAGE活性染色結(jié)果。在圖1中，上樣次序從左到右前4條帶依次為 某日提取的蝦殼膜粗酶液(15 ^， 20 nl，活力3.2241U)和內(nèi)臟粗酶液(15 nl, 20 nl，活力 1.03448U)，第5泳道為某日提取的蝦殼膜粗酶液(20 pl，活力4.1667U)，從圖中可以看出染 色深淺與酶活力和量的多少正相關(guān)。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
1) 配制材料，配制材料包括配制反應(yīng)液、染色液和酶液。
配制反應(yīng)液是在底物lmg萘酚AS-BI-N-乙酰-p-D-氨基葡萄糖苷(SIGMA，N4006)力叫.2 ml 95%乙醇助溶后，再加O.l mol/LpH7.5的磷酸緩沖液溶解至20ml。
配制染色液是將20 mg Fast Blue BB salt溶于IO ml 0.01 mol / L的Tris-HCl緩沖液；所述 Fast Blue BB salt可采用廈門泰京生物技術(shù)有限公司產(chǎn)的Fluka44670,所述Tris-HCl緩沖液的 pH最好為7.5， 4°C。
配制酶液是用O.Ol mol/L的Tris-HCl緩沖液pH 7.5抽提凡納濱對(duì)奸NAGase粗酶液。
2) 活性染色，活性染色包括以下步驟
(1) 配制Native-PAGE: 10%分離膠，5%濃縮膠；
(2) 上樣將提取的對(duì)蝦NAGase粗酶液上樣；
(3) 電泳在層析柜內(nèi)低溫電泳4h，恒流20mA;
(4) 反應(yīng)電泳完取膠，用蒸餾水沖洗后，立即放入37。C保溫的反應(yīng)液中，反應(yīng)5 10min 后，用蒸餾水洗滌2 3次；
(5) 染色放入新配制的預(yù)冷染色液內(nèi)，4'C染色5min，取出用蒸餾水洗滌2 3次，放 置在水中保存；
(6) 掃膠結(jié)果即可快速檢測(cè)NAGase的活性條帶。
權(quán)利要求
1.N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶電泳活性染色的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟1)配制材料，配制材料包括配制反應(yīng)液、染色液和酶液；2)活性染色，活性染色包括以下步驟(1)配制Native-PAGE；(2)上樣將提取的對(duì)蝦NAGase粗酶液上樣；(3)電泳在層析柜內(nèi)低溫電泳；(4)反應(yīng)電泳完取膠，用蒸餾水沖洗后，放入反應(yīng)液中，反應(yīng)后，用蒸餾水洗滌；(5)染色放入染色液內(nèi)染色，取出用蒸餾水洗滌，放置在水中保存；(6)掃膠結(jié)果即可快速檢測(cè)NAGase的活性條帶。
2. 如權(quán)利要求l所述的N-乙酰-P-D-氨基葡萄糖苷酶電泳活性染色的檢測(cè)方法，其特征在 于在步驟l)中，所述配制反應(yīng)液是在底物l mg萘酚AS-BI-N-乙酰-p-D-氨基葡萄糖苷 (SIGMA，N4006)力[]0.2 ml 95%乙醇助溶后，再加O.l mol/L pH 7.5的磷酸緩沖液溶解至20 ml; 所述配制染色液是將20 mg Fast Blue BB salt溶于IO ml 0.01 mol / L的Tris-HCl緩沖液。
3. 如權(quán)利要求2所述的N-乙酰-卩-D-氨基葡萄糖苷酶電泳活性染色的檢測(cè)方法，其特征在 于所述Tris-HCl緩沖液的pH為7.5， 4'C。
4. 如權(quán)利要求l所述的N-乙酰-l3-D-氨基葡萄糖苷酶電泳活性染色的檢測(cè)方法，其特征在 于在步驟l)中，所述配制酶液是用O.Ol mol/L的Tris-HCl緩沖液pH 7.5抽提凡納濱對(duì)蟲(chóng)下 NAGase粗酶液。
5. 如權(quán)利要求l所述的N-乙酰-p-D-氨基葡萄糖苷酶電泳活性染色的檢測(cè)方法，其特征在 于在步驟2) (1)中，所述Native-PAGE中含10。/。分離膠，5%濃縮膠。
6. 如權(quán)利要求l所述的N-乙酰-P-D-氨基葡萄糖苷酶電泳活性染色的檢測(cè)方法，其特征在 于在步驟2) (3)巾，所述低溫電泳的電流為恒流20mA，低溫電泳的時(shí)間為4h。
7. 如權(quán)利要求l所述的N-乙酰-卩-D-氨基葡萄糖苷酶電泳活性染色的檢測(cè)方法，其特征在 于在步驟2) (4)中，所述放入反應(yīng)液中是放入37'C保溫的反應(yīng)液中，反應(yīng)5 10min后，用 蒸餾水洗滌2 3次。
8. 如權(quán)利要求l所述的N-乙酰-P-D-氨基葡萄糖苷酶電泳活性染色的檢測(cè)方法，其特征在 于在歩驟2) (5)中，所述放入染色液內(nèi)染色是在4'C下染色5min，取出用蒸餾水洗滌2 3 次。
全文摘要
N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶電泳活性染色的檢測(cè)方法，涉及一種酶的活性染色。提供一種N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶電泳活性染色的檢測(cè)方法。配制材料包括配制反應(yīng)液、染色液和酶液；活性染色，活性染色包括以下步驟配制Native-PAGE；將提取的對(duì)蝦NAGase粗酶液上樣；在層析柜內(nèi)低溫電泳；電泳完取膠，用蒸餾水沖洗后，放入反應(yīng)液中，反應(yīng)后，用蒸餾水洗滌；放入染色液內(nèi)染色，取出用蒸餾水洗滌，放置在水中保存；結(jié)果即可快速檢測(cè)NAGase的活性條帶。使用底物量少，采用不同偶氮染料，無(wú)須脫色，操作更簡(jiǎn)便快捷，是對(duì)NAGase電泳活性染色方法的改進(jìn)，對(duì)NAGase快速檢測(cè)有重要意義。
文檔編號(hào)G01N1/30GK101666723SQ20091011257
公開(kāi)日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2009年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月23日
發(fā)明者燁 王, 謝曉蘭, 陳清西, 魏曉倩, 黃乾生 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)