專利名稱：核酸適配體修飾納米金催化共振散射光譜檢測(cè)汞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特殊化學(xué)分析技術(shù)，具體是核酸適配體修飾納米金催化共振散射光譜
檢測(cè)汞的方法。
背景技術(shù)：
汞是一種具有嚴(yán)重生理毒性的化學(xué)物質(zhì)，由于其具有持久性、易遷移性和高度的生物富集性，使其成為目前全球最引人關(guān)注的環(huán)境污染物之一?？扇苄怨x子(Hg2+)是最穩(wěn)定的無機(jī)汞，對(duì)細(xì)胞具有腐蝕性和致癌性；汞離子在環(huán)境中通過微生物的作用轉(zhuǎn)化為甲基汞，可通過食物鏈富集在人體，可引起腦損傷或其他慢性疾病。因此建立一種高靈敏度、高選擇性檢測(cè)汞離子的方法在環(huán)境監(jiān)控、食品安全及醫(yī)學(xué)方面具有十分重要的意義。常見的汞元素檢測(cè)方法主要是傳統(tǒng)的元素分析技術(shù)，包括原子吸收光譜、原子發(fā)射光譜、電感耦合等離子體質(zhì)譜、原子熒光光譜，但這些分析手段在實(shí)際應(yīng)用中需要昂貴的儀器，繁瑣。近年來，逐漸建立了汞離子的光學(xué)、分子探針和電化學(xué)等方法。核酸適配子(又稱適配體)是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)，從大容量的寡核苷酸庫(kù)中篩選出對(duì)靶分子結(jié)合具有高特異性和高結(jié)合性的核酸片段。它具有很高的親合力、高特異性、易標(biāo)記等特點(diǎn)，已用于核酸、酶、金屬離子，以及病毒顆粒和細(xì)菌孢子等檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，Hg"可以穩(wěn)定DNA序列中的T-T結(jié)構(gòu)，形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T結(jié)合物，這一原理已用于汞離子分析，建立了靈敏度較高、選擇性好的目視比色、光度、熒光方法。 納米金具有小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)和較好的生物相容性等特點(diǎn)，在納米生物分析領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。納米金共振散射效應(yīng)與免疫反應(yīng)和酶催化反應(yīng)等結(jié)合，發(fā)展了選擇性好和靈敏度較高的共振散射光譜分析新方法。納米金具有較強(qiáng)的催化活性，使其成為近期化學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)?；诩{米金催化-金、銀、銅微粒增強(qiáng)技術(shù)，已有酶催化、免疫反應(yīng)的光度法、電化學(xué)、表面等離子體共振、共振散射光譜分析方法報(bào)道。但未見核酸適配體修飾納米金催化菲林試劑-醛反應(yīng)的氧化亞銅微粒增強(qiáng)共振散射光譜研究及其測(cè)定Hg"的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種核酸適配體修飾納米金催化共振散射光譜檢測(cè)汞的方法。這種方法設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，特異性強(qiáng)，測(cè)定范圍寬。 本發(fā)明的原理是Hg2+適配體ssDNA序列含有多個(gè)T堿基，其與10nm的納米金結(jié)合時(shí)可形成DNA修飾的納米金AussDNA，當(dāng)Hg2+與AussDNA共存時(shí)，通過T-T錯(cuò)配，AussDNA與Hg2+反應(yīng)生成穩(wěn)定的Hg2+適配體-Hg2+復(fù)合物，與Hg2+反應(yīng)的AussDNA釋放出納米金，在高濃度NaCl作用下納米金聚集，溶液顏色由紅變藍(lán)，所生成的納米金簇的粒徑較大，可經(jīng)膜過濾除去。用濾液中過量的AussDNA作為納米催化晶種，催化Cu2+-糠醛的反應(yīng)還原為Cu+，生成的Cu+與溶液中的Off生成CuOH，最終生成Cu20微粒，導(dǎo)致共振散射光強(qiáng)度增大，隨著Hg"濃度的增加，濾液中AussDNA微粒減少，增強(qiáng)作用減弱，共振散射強(qiáng)度降低。據(jù)此
3可建立一個(gè)適配體修飾納米金催化_氧化亞銅微粒共振散射光譜檢測(cè)Hg2+的方法。 應(yīng)用核酸適配體修飾納米金檢測(cè)汞的共振散射光譜方法，包括以下步驟 (1)制備已知濃度的檢測(cè)體系在5支5mL刻度試管中，每管依次移取18 y L
0. 17iimol/L單鏈寡糖核苷酸(ssDNA、其序列為5，-TTT CTT CTT TCT TCC CCC CTT GTTTGT TGTTT-3，)溶液，400 ii L pH 7. 0濃度為0. 02mol/L NaH2P04_Na2HP04緩沖溶液，375 ii L58ii g/mL納米金溶液，搖勻，靜置5min后；五支試管分別加入1. 000X 10—2mol/L HgCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液5 400 ii L，再加入22. 5 ii L 2. Omol/L的NaCl溶液，稀釋至1. 5mL，混勻，用孔徑為150nm濾膜過濾，將濾液稀釋IO倍后，留做以下測(cè)定用， 另于5支5mL的具塞刻度試管中，分別移取69iiL 0. 20mol/L CuS04溶液，75 y L
1. 2311101/11(化(:411406，該1(^(:411406溶液含6. 25mol/L NaOH，各試管分別加入按步驟(1)制備的濾液各80 ii L，再加入900 ii L 23. 2mmol/L糠醛溶液，定容至3. OmL，混勻，7(TC下水浴反應(yīng)6min，流水快速冷卻至室溫； (2)用步驟(1)方法不加Hg2+做空白對(duì)照體系溶液； (3)分別取按步驟(1 2)制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液及空白對(duì)照體系溶液適量，置于石英比色皿中，用熒光分光光度計(jì)在低靈敏度、狹縫3nm、激發(fā)波長(zhǎng)等于發(fā)射波長(zhǎng)的條件下同步掃描，獲得同步發(fā)射光譜記錄其共振散射光譜，測(cè)定605nm波長(zhǎng)處的共振散射光強(qiáng)度I6。5nm，并
測(cè)定其空白值(IJb，計(jì)算A 丄605nm =(丄605nJ b—丄605nm f (4)以不同濃度Hg2+(。與對(duì)應(yīng)的共振散射強(qiáng)度Ale。^作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(5)制備樣品檢測(cè)體系取一定體積樣品，必要時(shí)濾過，然后用硝酸-鹽酸(體積比1 : 3)微波消化10min，取消化后的樣品一定量替換Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，按步驟(1) (3)操作，求其AI#$ (6)根據(jù)樣品測(cè)得的八1#，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求得樣品的汞含量。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)靈敏度高，特異性強(qiáng)，測(cè)定范圍寬，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，適合測(cè)定
含汞的各種試樣，為環(huán)境監(jiān)測(cè)及食品、化妝品等提供可靠的分析數(shù)據(jù)。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例測(cè)定汞的共振散射光譜圖。 圖中a. 4. 6mmol/L CuS04+3. 08 X 10—2mol/L KNaC4H406+6. 96mmol/L糠醛+38. 57ng/mLAussDNA(以Au濃度計(jì))+O.Onmol/L Hg2+;b. a+0. 133nmol/L Hg2+;c.a+667畫l/L Hg2+;d. a+1000翻l/L Hg2+;e. a+1333翻l/L Hg2+;f. 4. 6mmol/LCuS04+3. 08X 10—2mol/LKNaC4H406， +6. 96mmol/L糠醛
具體實(shí)施例方式
(1)制備已知濃度的測(cè)試體系準(zhǔn)備5支5mL刻度試管，每管依次移取18iiL0. 17iimol/L單鏈寡糖核苷酸(ssDNA、其序列為5' -TTT CTT CTT TCT TCC CCC CTTGTT TGTTGT TT-3')溶液，400 ii L pH 7. 0濃度為0. 02mol/L NaH2P04-Na2HP04緩沖溶液，375 iiL 58iig/mL納米金溶液，搖勻，靜置5min后；五支試管分別加入1. 000X 10—2mol/LHgCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液50、100、200、300、400ii L，再加入22. 5 ii L 2. Omol/L的NaCl溶液，稀釋至1. 5mL，混勻，用孔徑為150nm濾膜過濾，將濾液稀釋10倍后，留做以下測(cè)定用，
另于五支5mL的具塞刻度試管中，分別移取69iiL 0. 20mol/L CuS04溶液，75 y L 1.23mol/L 1(化(:411406，該1(化(:411406溶液含6. 25mol/L NaOH，各試管分別加入按步驟(1)制 備的濾液1 5各80 ii L，再加入900 ii L 23. 2mmol/L糠醛溶液，定容至3. OmL，混勻，70°C 下水浴反應(yīng)6min，流水快速冷卻至室溫j (2)用步驟(1)方法不加Hg2+做空白對(duì)照溶液體系-, (3)分別取按步驟(1 2)制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液及空白對(duì)照體系溶液適量，置于石英比 色皿中，用熒光分光光度計(jì)在低靈敏度、狹縫3nm、激發(fā)波長(zhǎng)等于發(fā)射波長(zhǎng)的條件下同步掃 描，獲得同步發(fā)射光譜記錄其共振散射光譜，測(cè)定605nm波長(zhǎng)處的共振散射光強(qiáng)度I6。8nm，并 測(cè)定其空白值(IJb，計(jì)算A (4)以不同濃度Hg"C助)與對(duì)應(yīng)的共振散射強(qiáng)度厶16。5 作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其 回歸方程為A I6。5nm = 0. 097CHg+8. 12 J (5)制備樣品的測(cè)試體系取一定體積廢水過濾，然后用硝酸-鹽酸(體積比 1 : 3)微波消化lOmin，取消化后的廢水樣lmL替換Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，按步驟(1) (3)操 作，制備樣品測(cè)試體系，并求得其AI#; (6)根據(jù)樣品測(cè)得的八1#，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求得樣品的汞含量。 驗(yàn)證用本發(fā)明方法測(cè)定廢水樣品2份，用上述(1) (6)的步驟進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)
結(jié)果是汞含量分別為334. 8nmol/L、94. 6nmol/L，證明了本方法的可靠性。本發(fā)明實(shí)施例測(cè)定汞的線性范圍為0. 133 1333nmol/L，檢出限為0. 07nmol/L。
權(quán)利要求
核酸適配體修飾納米金催化共振散射光譜檢測(cè)汞的方法，其特征是檢測(cè)方法包括以下步驟(1)制備已知濃度的檢測(cè)體系在5支5mL刻度試管中，每管依次移取18μL單鏈寡糖核苷酸，序列為5’-TTT CTT CTT TCT TCC CCC CTT GTT TGT TGT TT-3’溶液，再加入NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液、納米金溶液，搖勻，靜置5min后；五支試管分別加入1.000×10-2mol/L HgCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入NaCl溶液，稀釋至1.5mL，混勻，用濾膜過濾，將濾液稀釋10倍后，留做以下測(cè)定用；另于5支5mL的具塞刻度試管中，分別移取CuSO4溶液、KNaC4H4O6，該KNaC4H4O6溶液含6.25mol/L NaOH，各試管分別加入按步驟(1)制備的濾液各80μL，再加入糠醛溶液，定容至3.0mL，混勻，70℃下水浴反應(yīng)6min，流水快速冷卻至室溫；(2)用步驟(1)方法不加Hg2+做空白對(duì)照體系溶液；(3)分別取按步驟(1、2)制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液及空白對(duì)照體系溶液適量，置于石英比色皿中，用熒光分光光度計(jì)在低靈敏度、狹縫3nm、激發(fā)波長(zhǎng)等于發(fā)射波長(zhǎng)的條件下同步掃描，獲得同步發(fā)射光譜記錄其共振散射光譜，測(cè)定605nm波長(zhǎng)處的共振散射光強(qiáng)度I605nm，并測(cè)定其空白值(I605nm)b，計(jì)算ΔI605nm＝(I605nm)b-I605nm；(4)以不同濃度Hg2+與對(duì)應(yīng)的共振散射強(qiáng)度ΔI605nm作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)制備樣品檢測(cè)體系取一定體積樣品，必要時(shí)濾過，然后用硝酸-鹽酸(體積比1∶3)微波消化10min，取消化后的樣品一定量替換Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，按步驟(1)～(3)操作，求其ΔI樣；(6)根據(jù)樣品測(cè)得的ΔI樣，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求得樣品的汞含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述制備已知濃度的檢測(cè)體系，每管加入 的單鏈寡糖核苷酸為0. 17 ii mol/L的18 ii L， NaH2P04-Na2HP04緩沖溶液為pH 7. 0濃度為 0. 02mol/L的400 ii L，納米金溶液為375 ii L 58 ii g/mL， HgCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液為5 400 ii L， NaCl 溶液為2. Omol/L的22. 5 y L，濾膜的孔徑為150nm，加入的CuS04溶液為69 y L 0. 20mol/L， KNaC4H406為75 ii LI. 23mol/L，糠醛溶液為900 ii L23. 2mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種核酸適配體修飾納米金催化共振散射光譜檢測(cè)汞的方法，它是利用Hg2+適配體ssDNA與納米金結(jié)合形成DNA修飾的納米金AussDNA，當(dāng)Hg2+與AussDNA共存時(shí)，通過T-T錯(cuò)配，生成穩(wěn)定的Hg2+適配體-Hg2+復(fù)合物，在高濃度NaCl作用下納米金聚集，經(jīng)膜過濾除后，用濾液中過量的AussDNA作為納米催化晶種，催化Cu2+-糠醛的反應(yīng)還原為Cu+，Cu+與溶液中的OH-生成CuOH，最終生成Cu2O微粒。以此制備已知汞濃度的被測(cè)體系和試劑空白體系，測(cè)兩體系在605nm處的共振散射強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再制備樣品檢測(cè)體系，求其ΔI樣，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中汞含量。其優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高，特異性強(qiáng)，測(cè)定范圍寬，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，適合測(cè)定含汞的各種試樣，為環(huán)境監(jiān)測(cè)及食品、化妝品等提供可靠的分析數(shù)據(jù)。
文檔編號(hào)G01N1/28GK101726473SQ20091011450
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日
發(fā)明者劉慶業(yè), 李紀(jì)順, 梁愛惠, 溫桂清, 蔣治良 申請(qǐng)人:廣西師范大學(xué)