專利名稱：：應(yīng)用永久磁鐵的用于成像生物樣本中靶標(biāo)組分的方法和設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明大體上涉及成像液#(生物)樣本中的耙標(biāo)組分。更具體的，描述了提供用以陽(yáng)性選擇血液樣本中的靶細(xì)胞的方法和設(shè)備。將小的永久磁,接加入至恰有CD4免疫磁性標(biāo)記的熒光染色的吖啶銜AO)全血的血液樣本中。
背景技術(shù)：
：免疫磁性分離技術(shù)的應(yīng)用提供了在確定血液中的靶實(shí)體中的更高的敏感性和特異性，所述耙實(shí)體包括但不限于完整的循環(huán)癌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞?？梢詫⑦@些如(US6,365,362、US6,551,843、US6,623,982、US6，620,627、US6,645,731、WO02/077604、WO03/065042和WO03/019141)描述的那樣的簡(jiǎn)單而敏感的診斷工具用于本發(fā)明以基于閾水平關(guān)聯(lián)個(gè)體患者的統(tǒng)計(jì)生存能力。現(xiàn)有的診斷工具包括用針對(duì)上皮細(xì)胞表面抗原如EpCAM包被的磁珠孵育的來(lái)自腫瘤患者的血液樣^(W003/018757)。在用抗EpCAM包被的磁珠納^tf立子標(biāo)記后，用磁性分離器分離磁性標(biāo)記的細(xì)胞。進(jìn)一步處理免疫磁性富集的級(jí)分用于下游免疫細(xì)胞化學(xué)分析或圖像細(xì)胞計(jì)數(shù)，例如，在CellSpotter或CellTrackes⑧系統(tǒng)(ImmuniconCorp.,USA)中。磁性級(jí)分也可用于下游免疫細(xì)胞化學(xué)分析、RT-PCR、PCR、FISH、流式細(xì)胞術(shù)或其它鄉(xiāng)的圖像細(xì)胞計(jì)數(shù)。CellSpotter或CellTracke^系統(tǒng)禾,免疫磁性選擇和分離以高度富集和濃縮在全血樣本中存在的任何上皮細(xì)胞。用白細(xì)胞特異性的標(biāo)記以及用一種或多種腫瘤細(xì)胞特異性的熒光單克隆抗體可檢測(cè)地標(biāo)記俘獲的細(xì)胞，以允許俘獲的CTC的鑒別和計(jì)數(shù)，以及從污染的^PE細(xì)胞中儀器或可視的區(qū)分。每7.5ml血液中1或2個(gè)上皮細(xì)胞的敏感度使得這一測(cè)試法允許甚至在低腫瘤量的早期階段檢測(cè)腫瘤細(xì)胞。EasyCount②系統(tǒng)(PCT/US03/04468)是設(shè)計(jì)以區(qū)分淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的熒光成像系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括用于檢測(cè)和計(jì)數(shù)磁性標(biāo)記的靶細(xì)胞或粒子的緊密的電子光學(xué)儀器、分析方法、圖象采集和轉(zhuǎn)化算法。應(yīng)用全血作為樣本，應(yīng)用一種或多種耙特異性的熒光染料，諸如DNA染色染料熒光標(biāo)記血細(xì)胞。通過(guò)與綴合至強(qiáng)磁性顆粒的單克隆抗體孵育標(biāo)記血液樣本中的感興趣的細(xì)胞或靶細(xì)胞。然后將該樣本放置在合適的光學(xué)檢測(cè)室或倉(cāng)中，隨后將光學(xué)檢測(cè)室或倉(cāng)置于選擇性地使磁性標(biāo)記的細(xì)胞移向室的平面觀察表面的磁場(chǎng)梯度中。靶細(xì)胞被基本上一致地收集并固定在室的光學(xué)透明表面。然后fflil—個(gè)或多個(gè)LED(光劃寸二極管)的方式照亮這一表面的一部分以及在其上的被標(biāo)記的靶細(xì)胞。隨后，MilCCD(電荷耦合器件)捕獲由單個(gè)靶細(xì)胞發(fā)出的光。應(yīng)用本文公開(kāi)的圖像采集方法、處理方法和算法計(jì)算捕獲的發(fā)射光的細(xì)胞數(shù)，并將數(shù)據(jù)輸出與每微升室內(nèi)分析樣本中的靶細(xì)胞相關(guān)聯(lián)，并最終與最初的樣本相關(guān)聯(lián)。當(dāng)前可用的方法沒(méi)有提供快速、低成本且一致可靠的通過(guò)流式或圖像細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞耙群體的方法。因此，顯然需要決速和精確檢測(cè)血液中的靶成分，諸如月中瘤或內(nèi)皮細(xì)胞。發(fā)明推，本發(fā)明是用于陽(yáng)性選擇和成像靶實(shí)體的方法和工具。其包括用于在本發(fā)明的系統(tǒng)中磁操作的包被的永久磁性裝置。該系統(tǒng)免疫磁性地濃縮靶實(shí)體、熒光標(biāo)記，通過(guò)陽(yáng)性計(jì)數(shù)鑒定和量化靶細(xì)胞。隨后的統(tǒng)計(jì)分析使臨床醫(yī)生能夠獲得可能的診斷信息。更具體地，本發(fā)明提供了用于在免疫磁性成像后診斷疾病病癥的裝置、方法和試劑盒。在從患者獲得全血樣本后，將小的7乂久磁鐵加入到全血樣本中。與之前描述的CellSpotterMagnest構(gòu)型不同，將小的NdFeB磁瓶接加入到樣本容器中，例如CellTrackes⑧筒US6,861,259和US7,011,794具有100|nlCD4免疫磁性標(biāo)記的和熒光染色的AO全血。IO併中后，應(yīng)用鐵棒或另一磁糊每小的永久磁^A人樣本中吸出。將磁鐵置于容器內(nèi)以允許圖像分析。本發(fā)明的另一實(shí)施方案具有固定至反應(yīng)室內(nèi)的漂浮裝置(浮子(floater))的磁鐵。在加入試劑、血液和浮子后，使免疫磁性標(biāo)記的靶細(xì)胞沿著單成像平面放置用于分析，所有均在反應(yīng)室內(nèi)。附圖簡(jiǎn)述圖1:使用CellSpotter筒作為成像容器的靶細(xì)胞免疫磁性成像步驟。圖2:小磁鐵的一個(gè)實(shí)施方案的概要圖。板1顯示耙實(shí)俠細(xì)卿。板2顯示以PDMS硅橡膠包被的磁鐵為方向的靶實(shí)體。圖3:(A)顯示了具有附著在一個(gè)面上的永久磁鐵的浮子的設(shè)計(jì)。(B)顯示了在具有用于成像的光學(xué)透明窗口的管室內(nèi)的浮子。圖4:(A)在浮子面上的熒光珠的圖像。所述面具有0.17毫米的厚度。(B)在浮子面上的磁珠的圖像。所述面具有0.7毫米的厚度。圖5:(A)顯示了在用吖啶徵以綠色顯示)和CD45-APC(以紅色顯示)染色后CD14-FF選擇的細(xì)胞的圖像。(B)從左至右，浮子、具有室的管，所述室具有用以標(biāo)記體積的線，以及室的蓋子。圖6:4頓三種不同的物鏡獲得的熒光圖像。(A)使用5xNA0.12物鏡獲得的圖像。(B)使用10x,NA0.25獲得的圖像，以及(C)使用40x,NA0.6物鏡的圖像。藍(lán)色代表DAPI，綠色是CD8-PE且紅色是CD4-APC。圖7:從兩種方法獲得的圖像。(A)顯示了用方法l在40個(gè)旋轉(zhuǎn)后得到的結(jié)果。(B)顯示了用方法2在500個(gè)旋轉(zhuǎn)后得到的結(jié)果。圖8:用5x和40x物鏡，以及加入20、40、60和80微升EpCam鐵磁流體(ferrofluid)(20mg/ml)獲得的圖像。圖9:代表作為時(shí)間與小磁鐵(l/16Xy4")和大磁鐵(l/16X'/2")的函數(shù)的所收集的細(xì)胞數(shù)目的圖表。發(fā)明詳述血液中的免疫磁性分離、富集和分析在最初的抽血后使免疫磁性富集技術(shù)及免疫熒光標(biāo)記技術(shù)與適當(dāng)?shù)姆治銎脚_(tái)聯(lián)合。聯(lián)合的測(cè)試具有檢測(cè)血液樣本中稀有細(xì)胞的敏感性和特異性，可以用于研究它們?cè)诩膊≈T如上皮起源的惡性腫瘤的臨床過(guò)程中的作用。利用這一類技術(shù)，已顯示循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)在血液中以可^^測(cè)量存在。CellSpotter和CellTracl^^系統(tǒng)分析免疫磁性富集的樣本的圖像細(xì)胞術(shù)分析利用了基于熒光的顯微鏡圖像分析系統(tǒng)，與流式細(xì)胞術(shù)分析相比，所述分析系統(tǒng)提供了事件的形象化以及形態(tài)學(xué)特征的評(píng)估，以進(jìn)一步鑒定目標(biāo)(US6,365,362)。CellSpotter和CellTrackes系統(tǒng)是指用于自動(dòng)計(jì)數(shù)從血液中分離的細(xì)胞的自動(dòng)熒光顯微檢查系統(tǒng)。該系統(tǒng)含有控制熒光顯微鏡的集成電子計(jì)算機(jī)和支承一次性樣本筒的具有磁軛配件的自動(dòng)臺(tái)。設(shè)計(jì)磁軛以使得樣本室內(nèi)的鐵磁流體標(biāo)記的候選腫瘤細(xì)胞磁性地定位于樣本筒的上層視圖面用于顯微視圖。軟件將用針對(duì)細(xì)胞角蛋白的抗體標(biāo)記的并具有上皮起源的耙細(xì)胞呈現(xiàn)給操作者，用于最終選擇?？梢酝I(lǐng)域公知的方法完成耙細(xì)胞的分離。在磁性分離后，結(jié)合至免疫磁性連接的抗體的細(xì)胞被磁性地扣留在管壁上。然后吸出未結(jié)合的樣本，然后加入等滲溶液以重懸浮樣本。然后用核酸染料、針對(duì)細(xì)胞角蛋白(上皮細(xì)胞的標(biāo)記)和CD45(廣譜白細(xì)胞標(biāo)記)的單克隆抗體與樣本孵育。在磁性分離后，再次吸出未結(jié)合級(jí)分，并將結(jié)合且標(biāo)記的細(xì)胞重懸于0.2ml等滲溶液中。將樣本懸浮于細(xì)KI^室中，并置于磁體中，所述磁錢(qián)的磁場(chǎng)定向磁標(biāo)記的細(xì)胞用于熒光顯微鏡檢查。自動(dòng)地鑒別細(xì)胞，并將候選靶實(shí)體遞呈給操作者用于清單計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)清單由預(yù)先確定的構(gòu)成完整細(xì)胞的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)組成。本發(fā)明利用了直接加入到血液樣本中免疫磁性標(biāo)記的靶實(shí)體的小磁鐵。進(jìn)一步用成像核酸染料、細(xì)胞膜和/或細(xì)胞骨架免疫熒光標(biāo)記來(lái)標(biāo)記耙標(biāo)。例如，圖1描述了用于成像全血樣本中表達(dá)CD4的耙細(xì)胞的方法。自CD4進(jìn)行免疫磁性標(biāo)記和熒光標(biāo)記后，將小的釹(NdFeB)永久磁鐵加入到全血樣本中。10併中后，從流儲(chǔ)本中分離小的永久磁鐵，并在樣本容器中待Mii視圖面觀察。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)案中，磁鐵是具有1.6mm直徑和0.8mm高的盤(pán)(參見(jiàn)圖2)。更小的磁頓于本發(fā)明是更的。利用這一磁鐵，靶實(shí)辨細(xì)卿只附著至該磁鐵。細(xì)胞不在一個(gè)焦面上，難以獲得優(yōu)質(zhì)的圖像。使用用PDMS硅橡膠包被的磁行相同的方法。細(xì)胞沿著單焦面附著。在磁鐵頂部的PDMS層約為lmm。PDMS的寬度約為3mm。有需要設(shè)計(jì)用于將磁鐵移A^i移出細(xì)胞懸浮液的方法，因?yàn)樵谝迫牖蛞瞥鰬腋∫簳r(shí)，損失磁鐵的機(jī)會(huì)是很大的。磁鐵必需足夠小以減少將其從細(xì)胞懸浮液中吸出的力。室壁和磁鐵之間的摩擦力可能太大而不能從細(xì)胞懸浮液中吸出磁鐵，因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)的方向是與磁力垂直的。甚至在具有用于擴(kuò)大的磁鐵的外殼大小時(shí)，細(xì)胞也可能移向磁極并妨礙檢測(cè)。在本發(fā)明描述的另一個(gè)實(shí)施方案中考慮了這些問(wèn)題。圖3顯示了本方法的基本步驟。將7乂久磁鐵安裝在中空管一面的內(nèi)部，封閉所有側(cè)面，如圖3A所示。安裝有磁體的面具有規(guī)定的厚度(d)。該表面可以是平的，或含有促進(jìn)捕獲并觀察感興趣目標(biāo)以及限制液體中干擾組分(即游離的未結(jié)合的磁性顆粒)影響的結(jié)構(gòu)。表面的厚度決定了細(xì)胞在外側(cè)的分布。浮子的高獻(xiàn)直徑比決定了磁場(chǎng)對(duì)浮子外側(cè)區(qū)域的影響。因此，該比值應(yīng)當(dāng)將磁場(chǎng)的影響限制為大致到達(dá)安裝了磁鐵的浮子的外側(cè)面。將細(xì)胞懸浮液注射進(jìn)具有平坦表面、具有光學(xué)透明窗口的管中。加入免疫磁性顆粒和熒光染料。孵育后，將含有永久磁鐵的浮子插入管中，使磁鐵面向管底部并且關(guān)閉管?；蛘呖梢栽诤推渌噭┫嗤臅r(shí)間插入浮子。通過(guò)使試管倒過(guò)來(lái)，浮子升至流體外面。在試管和浮子之間留有小的流體層，可以忽略其對(duì)總體積的影響。使懸浮液與試劑孵育，不干擾浮子或不干擾磁場(chǎng)。孵育后，將管置于試管旋轉(zhuǎn)裝置或類似裝置上，以使浮子上下移動(dòng)M細(xì)胞懸浮液，如圖3B闡明的那樣。在足夠的時(shí)間以完全捕獲磁性標(biāo)記的物俠細(xì)胞)后，從旋轉(zhuǎn)裝置上取下管，并顛倒放置，以使得浮子升向管平坦表面的光學(xué)窗口。利用標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡，aai管底部成像呈現(xiàn)在浮子表面的細(xì)胞。圖4A展示了具有8聽(tīng)直徑的磁性綠色熒光,angs珠)的熒光圖像。使用1/32"x1/16"釹永久盤(pán)狀磁鐵在浮子表面上收集珠子，所述磁鐵的表面具有0.17毫米的厚度。圖4B顯示了在浮子表面上成像的磁珠。圖5A展示了在浮子表面收集的CD14-FF選擇的細(xì)胞的重疊圖，所述浮子具有12腿的夕卜直徑，j頓l/16"x1/4"釹7乂柱狀磁鐵，表面厚度為約0.34mm的2個(gè)蓋片?？梢宰鳛榫G色信號(hào)顯示吖啶橙的強(qiáng)度，以區(qū)分用于CD45-APC標(biāo)記的紅色。圖5B顯示了浮子、室和室的蓋。對(duì)于每一樣本的制備，將200^血液(CellSavePreservative管，Immunicon股份公司)與10CD14-FF(0.88g/ml)、10|_d吖啶銜lmM)及10CD45-APC在玻璃室中孵育10分鐘，如圖5A所示。加入磷Kk緩沖鹽水(PBS;2ml)到室中至預(yù)定量。加入浮子至室中，使含有磁鐵的面朝向室的玻璃底部。旋轉(zhuǎn)室以保證完全混合。IO併中后，顛倒室，并熒光成像在磁鐵表面收集的細(xì)胞。實(shí)施例1CD-Chex，捕獲效率為測(cè)定捕獲效率，使用了具有已知絕對(duì)數(shù)量的白細(xì)胞的CD-Chex和它們的表型。材料和方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>往50WCD-Chex中加入10jnlCD3-FF(克隆Cris7)、10CD4-APC和10CD8-PE。孵育25併中后，將10nl該溶液注入室內(nèi)。加入具有100nlDAPI的PBS(1.8ml)。然后插入浮子。蓋蓋后，將室置于旋轉(zhuǎn)裝置上，并旋轉(zhuǎn)過(guò)夜(約16小時(shí))。顛倒室，獲得浮子的圖像。結(jié)果對(duì)于100%的捕獲效率，浮子表面含有CD3+:10328個(gè)細(xì)胞CD3+/CD4+:6783個(gè)細(xì)胞CD3+/CD8+:3200個(gè)細(xì)胞用不同的物鏡獲得圖像，所得到的疊加圖像如圖6所示。圖6A展示了使用5xNA0.12物鏡獲得的圖像。圖B和C分別是4頓10x,NA0.25和4(KNA0.6物鏡獲得的圖像。藍(lán)色代表DAPI，綠色是CD8-PE且紅色是CD4-APC。預(yù)計(jì)CD8-PE(綠色)標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)目是3200，而實(shí)際的CD8-PE標(biāo)記的細(xì)胞約等于500，捕獲效率是16%。實(shí)施例2:fTO7乂久磁鐵的兩種方法之間的比較為確定CdlTracke^分析后對(duì)照細(xì)胞的圖像，所述分析使用了插入和從細(xì)胞懸浮液移除磁鐵的方銜方法l)和使用了具有固定在如本發(fā)明描述的浮子上的永久磁鐵的方S(方法2)。才才料和方法在用CellTracke,系統(tǒng)分析后，將來(lái)自CellTracke,筒的對(duì)照細(xì)胞轉(zhuǎn)移至類似圖5B的室內(nèi)。使用巴斯德吸管用PBS洗滌筒若干次，并且將所有用于洗滌的液俠約500微升)轉(zhuǎn)移至室內(nèi)。添加額外的PBS至2ml的總^f只。將小瓶置于管旋轉(zhuǎn)裝置上。設(shè)置轉(zhuǎn)速使得在一次旋轉(zhuǎn)中浮子移動(dòng)通過(guò)全部流體。在完全混合后，將1.5ml對(duì)照細(xì)胞、以及50inlEpcam鐵磁流體和10DAPI試劑(CellSearchTM，VeridexLLC)注入小瓶中。孵育30併中后，在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得圖像。結(jié)果方法l:圖7A的圖像顯示了40個(gè)旋轉(zhuǎn)后的結(jié)果。圖片質(zhì)量適合于很容易地計(jì)數(shù)細(xì)胞。綠色細(xì)胞的數(shù)目對(duì)應(yīng)于556個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的最高值和47個(gè)CTC的低值。ioo個(gè)旋轉(zhuǎn)后，大多數(shù)細(xì)胞M;埋在鐵磁流體層之下。此時(shí)細(xì)胞不可見(jiàn)并不能被計(jì)數(shù)。方法2圖7B的圖像是皿500個(gè)旋轉(zhuǎn)后的獲得的。盡管是更低量的鐵磁流體，圖片質(zhì)量仍然足以計(jì)數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)目如下高值209，低值25，預(yù)期的是高值435，低值23。因此，對(duì)于高值的回收率是45%，以顏于低值是100%。實(shí)施例3鐵磁流體的量用遞增的鐵磁流體確定圖片質(zhì)量。隨著鐵磁流體量的增加，圖片質(zhì)量降低。細(xì)胞變得埋藏在鐵磁流體層之下，并且不能被檢測(cè)到。這在某種程度上導(dǎo)致了低的回收率。材料和方法以1:100稀釋COMPEL磁性微球體，Dragon綠，2.914107/ml，直徑8.44lot#6548(BangsLaboratoriesInc，目錄號(hào)UMC4F)。將系統(tǒng)緩沖液(1.5ml)加入到玻璃小瓶中，并加入50微升含有14570個(gè)小珠、以及20、40、60和80微升EpCam鐵磁流俠20mg/ml)。旋轉(zhuǎn)15和30併中后，獲得熒光圖像。將管旋轉(zhuǎn)裝置設(shè)置在10ipm，導(dǎo)致150和300個(gè)旋轉(zhuǎn)。浮子是Coming1/16"直徑磁鐵。結(jié)果用5x和40x物鏡獲得圖像。如圖8所示，用5x和40x物鏡成像20、40、60和80微升的EpCam。圖8所示缺失的圖像在保存過(guò)程中遺失了。實(shí)施例4評(píng)估捕獲效率為確定不同大小的磁鐵的捕獲效率材料和方法方法A:1.用對(duì)照細(xì)胞分析CellTracks筒之后，清空筒中內(nèi)裝物。收集兩個(gè)筒中的內(nèi)裝物。不清楚從筒中移出的對(duì)照細(xì)胞的精確數(shù)目，因?yàn)橐恍┘?xì)胞粘附在玻璃上。將100Ml這一細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至試管中，并加入1.5mlPBS。2.裝滿四個(gè)管，且其中兩個(gè)^柳浮子和Coming1/16"直徑長(zhǎng)度1/4"的磁鐵，而另外兩個(gè)使用Coming1/16"直徑長(zhǎng)度1/2"的磁鐵。3.將管置于管旋轉(zhuǎn)裝置上30併中。旋車(chē)ti!度10RPM。4.從管中移除浮子，并將管置于Quadrupole磁鐵中10併中。10^!中后，移除液體并用300微升PBS替換。移除并渦旋振蕩管。5.將300微升轉(zhuǎn)移至筒中，并在CellTracks⑧系統(tǒng)上重復(fù)掃描筒以確定有多少個(gè)細(xì)胞剩余在液體中。6.通過(guò)將浮子上的細(xì)胞數(shù)除以剩余液體的重復(fù)掃描中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞數(shù)來(lái)計(jì)算效率。結(jié)果磁鐵浮子CellTracks重復(fù)掃描捕獲效率1/16XW256199.6%1/16X'/4"225nana201/16X1/2，，230299.1l/16X!/2"218na方法B1.用對(duì)照細(xì)胞分析CellTracks筒之后，清空筒中內(nèi)裝物。如果需要大量的細(xì)胞的話，可以匯集筒。不清楚從筒中移出的對(duì)照細(xì)胞的精確數(shù)目，因?yàn)橐恍┘?xì)胞粘附在玻璃上。將IOOmI這一細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至管中，并加入1.5mlPBS。2.兩類浮子，Coming1/16"直徑長(zhǎng)度1/4"的磁鐵和Comingl/16'，直徑長(zhǎng)度l/2"。3.將管置于管旋轉(zhuǎn)裝置上15併中。旋^fil度10RPM。4.從管中移除浮子，并將有剩余液體的管置于Quadrupole磁鐵內(nèi)部10併中。10併中后，移除液體并用300微升PBS替換。從Quadrupole中移出管，并渦旋振蕩。5.將300微升轉(zhuǎn)移至CellTracks筒并置于磁鐵內(nèi)部，15射中后，在CellTracks上重復(fù)掃描。6.通過(guò)將浮子上的細(xì)胞數(shù)除以剩余液體的重復(fù)掃描中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞數(shù)計(jì)算效率。結(jié)果:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>方法C:1.用對(duì)照細(xì)胞分析CellTracks筒之后，清空筒中內(nèi)裝物。如果需要大量的細(xì)胞的話，可以匯集筒。不清楚從筒中移出的對(duì)照細(xì)胞的精確數(shù)目，因?yàn)橐恍┘?xì)胞粘附在玻璃上。2.用儀器緩沖液兩倍稀釋細(xì)胞懸浮液，并將100^1這一細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至管中，并力口入1.5mlPBS。3.兩類浮子，Coming1/16"直徑長(zhǎng)度l/4，，的纖禾口Corning謹(jǐn)，，直徑長(zhǎng)度1/2"。4.將管置于管旋轉(zhuǎn)裝置上。旋轉(zhuǎn)速度IORPM。5.在第l、2、3、4、5、7、10和15分鐘確定所收集的細(xì)胞數(shù)。6.在DAPI和DIOC上鑒定細(xì)胞。結(jié)果圖9中的圖表以時(shí)間函數(shù)顯示了所收集的細(xì)胞數(shù)。盡管上面描述并詳細(xì)地例示了本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方案，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施方案?？梢詫?duì)其進(jìn)行各種修改，而不違背本發(fā)明的精神，該改進(jìn)的全部的保護(hù)范圍描述于下述權(quán)利要求中。權(quán)利要求1.檢測(cè)和計(jì)數(shù)生物樣本中靶群體的方法，其包括a.從個(gè)體獲得所述生物樣本；b.用熒光標(biāo)記來(lái)標(biāo)記所述生物樣本中的所述靶群體，其中所述標(biāo)記物對(duì)于所述靶群體是特異性的；c.將所述靶群體與磁性顆粒偶聯(lián)；d.將小永久磁鐵直接加入到所述樣本中；e.分離所述標(biāo)記的靶群體，其中所述分離包括從所述樣本中移出含有所述靶群體的所述磁鐵；f獲得所述靶群體的圖像，并且g.分析所述圖像以檢測(cè)并計(jì)數(shù)所述標(biāo)記的靶群體。2.權(quán)利要求1的靶群體，其中所述耙群體是表達(dá)CD4的細(xì)胞。3.權(quán)利要求1的小7K久磁鐵，其中所述磁鐵是釹。4.權(quán)利要求1的小永久磁鐵，其中所述磁鐵是具有約1.6mm的直徑和0.8mm高度的盤(pán)。5.用PDMS硅酮包被的權(quán)利要求1的小永久磁鐵。6.檢測(cè)和計(jì)數(shù)生物樣本中耙群體的方法，其包括a.在室中獲得所述生物樣本；b.用熒光標(biāo)記物標(biāo)記所述生物樣本中的所述靶群體，其中所述標(biāo)記物對(duì)于所述耙群體是特異性的；c.將所述耙群體與磁性顆粒偶聯(lián)；d.將含有小永久磁鐵的浮子直接加入到所述樣本中；e.使浮子沿著室的觀察窗口穩(wěn)定；f.獲得所述耙群體的圖像，并且g.分析所述圖像以檢測(cè)并計(jì)數(shù)所述標(biāo)記的$巴群體。7.檢測(cè)和計(jì)數(shù)生物樣本中革巴群體的裝置，其包括a.樣本收集管，其中所述收集管在一個(gè)面上具有光學(xué)觀察表面；b.在所述收集管內(nèi)的含有7ll久磁鐵的浮子；以及c.所述收集管的蓋子。全文摘要描述了用于通過(guò)圖像細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)液體中細(xì)胞的系統(tǒng)，用于評(píng)估靶群體，諸如在不同體液中的白細(xì)胞子集或在環(huán)境樣本、食品和體液中的細(xì)菌污染。簡(jiǎn)而言之，將熒光標(biāo)記的靶細(xì)胞與磁性顆?；蛑檫B接。在一個(gè)實(shí)施方案中，將小的永久磁鐵直接插入到含有標(biāo)記的細(xì)胞的室中。用PDMS硅橡膠包被磁鐵以提供平滑和平坦的表面上，其允許在單焦面上成像。從樣本中移除磁鐵，并通過(guò)CCD相機(jī)捕獲通過(guò)靶細(xì)胞發(fā)射的熒光亮光。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有永久磁鐵的浮子使得靶細(xì)胞在樣本溶液內(nèi)沿著單成像平面排列?？梢杂眯碌乃惴ㄟM(jìn)行圖像分析，以提供表面上的細(xì)胞的計(jì)數(shù)，反映出最初樣本中的靶細(xì)胞濃度。文檔編號(hào)G01N21/64GK101533012SQ20091013077公開(kāi)日2009年9月16日申請(qǐng)日期2009年2月13日優(yōu)先權(quán)日2008年2月15日發(fā)明者A·G·J·蒂貝,L·W·M·M·特爾斯塔彭申請(qǐng)人:維里德克斯有限責(zé)任公司