專利名稱：：基于染色技術(shù)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)鏡檢裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及細(xì)胞分析領(lǐng)域，尤其是涉及基于染色技術(shù)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)鏡檢裝置。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有的血液分析儀可以提供豐富的數(shù)據(jù)，大大提高了臨床血液學(xué)檢驗(yàn)的質(zhì)量和速度，減輕了檢驗(yàn)人員的工作量。然而，它們只能作為血液常規(guī)分析過程中的過篩手段，當(dāng)自動化血球計(jì)數(shù)儀顯示異常結(jié)果時(shí)或?qū)Y(jié)果進(jìn)行了"標(biāo)記"時(shí)一定要作全血涂片染色檢查，血涂片染色鏡檢是提供鑒別診斷和提示進(jìn)一步必要檢查的重要工具，特別是在快速診斷某些特異性感染方面(如瘧原蟲、黑熱病原蟲及絲蟲病等)，血涂片染色鏡檢有其重要作用。傳統(tǒng)的方式是采用手工制作，先在一張載玻片上進(jìn)行血液推片，然后干燥、染色、干燥、觀察。人工方式勞動強(qiáng)度大、速度慢，不適合大批量的血樣處理。Coulter,Sysmex，Abbott等公司陸續(xù)開發(fā)出了自動推片染色機(jī)，對需要復(fù)檢的樣本進(jìn)行自動推片染色，用以減少部分復(fù)檢工作量。此類設(shè)備都是按照標(biāo)準(zhǔn)的方法，需要復(fù)雜的機(jī)械手進(jìn)行推片、烘干、染色等處理；染色后的血液細(xì)胞樣本固定在載玻片上送入顯微光學(xué)系統(tǒng)；在二維掃描平臺的帶動下，血片按照設(shè)定的掃描規(guī)律分區(qū)域掃描成像?，F(xiàn)有的自動推片染色機(jī)主要存在以下一些問題實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，體積龐大，價(jià)格昂貴；多幀圖像獲取過程中需要二維機(jī)械掃描，獲取速度慢；圖像中細(xì)胞數(shù)量過多，容易出現(xiàn)扎堆現(xiàn)象，很難采用圖像處理的方法進(jìn)行細(xì)胞識別和分割，即使人工計(jì)數(shù)也容易導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差；還存在故障率高、血涂片質(zhì)量不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是克服傳統(tǒng)自動染色機(jī)的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)一種基于染色技術(shù)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)快速鏡檢裝置和方法。本發(fā)明的技術(shù)路線簡介如下在本發(fā)明中擯棄了載物板，直接將采集到的微量細(xì)胞樣本和試劑在反應(yīng)池充分混合，經(jīng)一段時(shí)間反應(yīng)后送入顯微光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行鏡檢。在顯微光學(xué)系統(tǒng)內(nèi)，細(xì)胞樣本以流水線的方式通過，通過快速攝像技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)拍攝大量的顯微照片。本發(fā)明的一方面是提供一種基于染色技術(shù)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)鏡檢裝置，包括反應(yīng)池、測量室、液路單元、以及顯微光學(xué)系統(tǒng)。其特征在于，所述液路單元包括細(xì)胞樣本接口和至少一種試劑接口；所述液路單元至少與所述反應(yīng)池和所述測量室之一連通；所述反應(yīng)池和所述測量室之間連通；所述測量室同時(shí)位于所述顯微光學(xué)系統(tǒng)的內(nèi)部。本發(fā)明的另一方面是提供一種基于染色技術(shù)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)鏡檢方法，其特征在于液路單元將細(xì)胞樣本和至少一種試劑注入反應(yīng)池混合在一起；經(jīng)過一段時(shí)間，反應(yīng)池內(nèi)的細(xì)胞樣本被注入測量室；在測量室內(nèi)部流動的細(xì)胞樣本被顯微光學(xué)系統(tǒng)成像。采用本發(fā)明還可以在反應(yīng)池內(nèi)對細(xì)胞樣本進(jìn)一步稀釋，雖然經(jīng)過稀釋后單幀圖像拍攝到的細(xì)胞數(shù)量相對傳統(tǒng)技術(shù)要少的多，但本發(fā)明可以在單位時(shí)間內(nèi)拍攝大量的圖像，因而拍攝的細(xì)胞總體數(shù)量并不會減少，甚至還可以更多，保證了測量結(jié)果的統(tǒng)計(jì)性和可靠性。相對于傳統(tǒng)的技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞樣本和染色液充分混合，有利于提高染色質(zhì)量，加快染色速度；由于不要復(fù)雜的機(jī)械結(jié)構(gòu)進(jìn)行推片、染色、烘干以及在顯微系統(tǒng)下的二維掃描，可以實(shí)現(xiàn)緊湊、可靠的自動化檢驗(yàn)裝置；另外一方面，單幀圖像中細(xì)胞圖像越稀疏，越有利于采用圖像處理技術(shù)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞圖像的自動化分割、識別、統(tǒng)計(jì)和分類。圖1是本發(fā)明用于血液細(xì)胞瑞氏染色的一個(gè)原理圖。圖2是測量室構(gòu)件的主視圖。圖3是測量室構(gòu)件的俯視圖。圖4是本發(fā)明用于血液細(xì)胞瑞氏染色的工作流程圖。具體實(shí)施例方式以血液細(xì)胞的瑞氏染色做為在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例。圖1是該實(shí)施例的原理圖，一種基于染色技術(shù)的血液細(xì)胞形態(tài)學(xué)快速鏡檢裝置，包括反應(yīng)池1、測量室2、液路單元3、顯微光學(xué)系統(tǒng)4以及控制單元5。其特征在于液路單元3可以向反應(yīng)池1注入精確定量的血液樣本7和染色液8進(jìn)行染色，注入定量的緩沖液9對染色樣本進(jìn)行固定，注入稀釋液10對固定后的樣本進(jìn)行稀釋，或者注入清洗液11對反應(yīng)池進(jìn)行清洗；測量室2分別和反應(yīng)池1、液路單元3相連，同時(shí)測量室2也是顯微光學(xué)系統(tǒng)4的一個(gè)組件，位于顯微光學(xué)系統(tǒng)4的物面上。染色后的樣本由反應(yīng)池1經(jīng)測量室2流入液路單元3，并在顯微光學(xué)系統(tǒng)4內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速拍攝；為了保證染色的穩(wěn)定性和一致性，反應(yīng)池1放置在一個(gè)恒溫系統(tǒng)6內(nèi)?？刂茊卧?通過控制液路單元3、顯微光學(xué)系統(tǒng)4以及恒溫系統(tǒng)6實(shí)現(xiàn)染色、快速鏡檢、以及系統(tǒng)的清洗。液路單元3進(jìn)一步包括血液操作單元301、染色液操作單元302、緩沖液操作單元303、稀釋液操作單元304、清洗液操作單元305、染色樣本驅(qū)動單元306、廢液收集單元307。其中血液操作單元301可以將微量的血液樣本7加入到反應(yīng)池1內(nèi)，染色液操作單元302可以將定量的染色液8加入反應(yīng)池1內(nèi)，緩沖液操作單元303可以將定量的緩沖液9加入反應(yīng)池1內(nèi)，稀釋液操作單元304可以將定量的稀釋液10加入反應(yīng)池1內(nèi)，清洗液操作單元305可以將定量的清洗液11加入反應(yīng)池1內(nèi)，染色樣本驅(qū)動單元306用于將染色稀釋后的血液樣本由反應(yīng)池1送入測量室2進(jìn)行檢測，廢液收集單元307將液路系統(tǒng)中的廢液送入廢液容器12內(nèi)。液路單元3內(nèi)部的各單元之間可以是完全隔離的，也可共用一些管路、泵、閥等組件，將血液樣本7和各種試劑染色液8、緩沖液9、稀釋液10、清洗液11通過一條或多條管路送入反應(yīng)池內(nèi)。顯微光學(xué)系統(tǒng)4進(jìn)一步包括光源401、光源會聚透鏡402、成像透鏡403、攝像機(jī)404，測量室2也是顯微光學(xué)系統(tǒng)4的一個(gè)部件，位于顯微光學(xué)系統(tǒng)的物面位置。測量室2包括兩個(gè)端口A、B，分別和反應(yīng)池1、液路單元3聯(lián)通。染色后的血液樣本在液路單元3的4驅(qū)動下由反應(yīng)池1流經(jīng)測量室2并到達(dá)液路單元3。由光源401發(fā)出的光經(jīng)光源會聚透鏡202會聚到測量室2的測量區(qū)域，對流經(jīng)該區(qū)域的血液細(xì)胞進(jìn)行照明，被照明的細(xì)胞經(jīng)成像透鏡403成像到攝像機(jī)404的靶面，最終由控制單元5獲取。測量室2采用透明材料加工而成，如透明塑料、有機(jī)玻璃，普通光學(xué)玻璃，石英、寶石等等。其結(jié)構(gòu)如圖2、3所示，在透明材料中心形成一個(gè)扁平的通道，測量過程中，在其中流過的血液細(xì)胞樣本形成層流狀態(tài)。通道在光學(xué)軸向的高度h要足夠小，接近于成像透鏡403的景深，保證細(xì)胞在不同的位置均可以得到清晰的圖像?？紤]到流速分布對測量結(jié)果的影響，通道寬度d應(yīng)是成像透鏡403的視場直徑的36倍。為了便于形成穩(wěn)定的層流，通道長度1應(yīng)是大于其寬度d(如4倍以上)，通道兩側(cè)應(yīng)該盡可能光滑過度。染色后血液細(xì)胞樣本在測量室2內(nèi)快速通過，為了便于觀察其形態(tài)和顏色，對光源401和攝像機(jī)404提出了如下要求*高亮度、寬光譜光源；攝像機(jī)工作于幀曝光方式；如果選擇可工作于頻閃方式的光源，則攝像機(jī)404的電子快門的可以工作在較長的曝光時(shí)間模式下；如果光源只能工作于持續(xù)照明方式，則攝像機(jī)404的電子快門必須能夠調(diào)到較小的曝光時(shí)間?？蛇x用的光源包括，高亮度的白色LED，鹵鎢燈、頻閃放電管等。其中，鹵鎢燈只能工作于持續(xù)照明方式，頻閃放電管工作于頻閃方式，而LED則可以工作于兩種方式，具有更大的靈活性，但亮度要低一些。在實(shí)際應(yīng)用中，攝像機(jī)404的像元尺寸和數(shù)量也是需要綜合考慮的因素；較大的像元尺寸可以獲得更多的光照能量，因此具有更好的信噪比，但是會導(dǎo)致像元數(shù)量減少，降低采樣圖像的空間分辨率；反之，增加像元數(shù)量提高了圖像空間分辨率，但是降低了圖像的信噪比。在本發(fā)明的設(shè)計(jì)中，成像透鏡403可以選用商品化的顯微物鏡，也可根據(jù)實(shí)際情況自行設(shè)計(jì)?？刂茊卧?進(jìn)一步包括邏輯控制單元501、液路控制單元502、溫度控制單元503、攝像機(jī)控制單元504、光源控制單元505。邏輯控制單元501依據(jù)設(shè)定的邏輯功能通過對液路單元3、恒溫系統(tǒng)6、顯微光學(xué)系統(tǒng)4的協(xié)同控制實(shí)現(xiàn)血液樣本的染色和快速鏡檢，并在鏡檢后實(shí)現(xiàn)整個(gè)系統(tǒng)的清洗，邏輯控制單元501可以是一臺PC機(jī)，也可以是含有CPU的控制板；液路控制單元502實(shí)現(xiàn)對液路單元3元件的控制，包括泵、閥、電機(jī)等組件；溫度控制單元503實(shí)現(xiàn)對恒溫系統(tǒng)6的控制；攝像機(jī)控制單元504實(shí)現(xiàn)對顯微光學(xué)系統(tǒng)4中的攝像機(jī)404的控制；光源控制單元505實(shí)現(xiàn)對顯微光學(xué)系統(tǒng)4中的光源401的控制。在本實(shí)施例中，用到的試劑如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>試劑名稱主要成分緩沖液9磷酸鹽緩沖液，PH值到6.57.0稀釋液10生理鹽水清洗液11含表面活性劑的溶液其它參數(shù)還包括，測量室2:扁平通道尺寸0.1mm(h)X2mm(w)X10mm(1);光源401:超高亮度的白色LED，工作于持續(xù)照明方式；攝像機(jī)404:微視圖像的CMOS彩色攝像機(jī)MVC1280SAC_GE27，有效像素1280X1024，像素尺寸6.7X6.7iim，快門速度8ys26ms可調(diào)(實(shí)際設(shè)定在16ys)，幀率27fps，千兆以太網(wǎng)接口；成像透鏡403:20X的顯微物鏡?！獋€(gè)典型的控制流程如圖4所示，描述如下*血液操作單元301和染色液操作單元302分別輸送一定量的血液樣本7(20y1)和染色液8(1001)到反應(yīng)池1內(nèi)混合染色一段時(shí)間(約30秒)，為了保證染色的一致性，反應(yīng)池1處于恒溫系統(tǒng)6內(nèi)并維持在30±0.5t:范圍內(nèi)；緩沖液操作單元303加入一定量的緩沖液9(100y1)到反應(yīng)池1內(nèi)一段時(shí)間(5分鐘)，使染色后的血液細(xì)胞樣本穩(wěn)定化。稀釋液操作單元304加入一定量的稀釋液10(1.8ml)到反應(yīng)池1內(nèi)對染色后的血液樣本進(jìn)行稀釋。，染色樣本驅(qū)動單元306驅(qū)動染色樣本由反應(yīng)池1按照一定的流速(4ii1/s)進(jìn)入測量室2，同時(shí)由攝像機(jī)控制單元504啟動圖像采集程序測量一段時(shí)間(20s)。*測量完畢后，由清洗液操作單元305加入一定量的清洗液11(2.5ml)到反應(yīng)池1內(nèi)對反應(yīng)池進(jìn)行清洗，并由廢液收集單元307將清洗后的的液體排至廢液容器12內(nèi)，此過程重復(fù)23次實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的徹底清洗。假定某正常成人的紅細(xì)胞數(shù)量為4X107P1，直徑在69iim范圍內(nèi)，白細(xì)胞數(shù)量為6X103/1，直徑在725m范圍內(nèi)，基于以上參數(shù)可以得到染色稀釋后的血液樣本大約被稀釋了100倍，即紅細(xì)胞濃度變?yōu)?X10ViU，白細(xì)胞為60/iU;顯微視場的區(qū)域?yàn)?.43mmX0.34mm，厚度即測量室2的厚度0.lmm，那么顯微視場對應(yīng)體積為0.015iil，相應(yīng)的紅細(xì)胞數(shù)量分別為600個(gè)和0.87個(gè)；如果20s內(nèi)的幀率保證在25fps，那么共可以得到500幀圖像，在這些圖像中共可以得到約3X105個(gè)紅細(xì)胞以及435個(gè)白細(xì)胞，保證了測量結(jié)果的統(tǒng)計(jì)性；在顯微圖像中，紅細(xì)胞的直徑約為1827個(gè)像素，白細(xì)胞直徑約為2175像素；*血液樣本在測量室內(nèi)的流速約為20mm/s，在攝像機(jī)的電子曝光時(shí)間(16ys)內(nèi)，樣本液移動的距離為0.32iim，在靶面上對應(yīng)于0.96像素，不會造成因運(yùn)動而產(chǎn)生的拖尾*在攝像機(jī)的拍攝的兩幀圖像時(shí)間間隔內(nèi)(約40ms)，樣本液移動的距離為0.8mm，大于顯微視場的區(qū)域最大邊長0.43mm，因此，攝像機(jī)每一幀圖像都是全新的圖像，沒有重復(fù)拍攝的區(qū)域。該實(shí)施例進(jìn)一步表明采用本發(fā)明的裝置可以實(shí)現(xiàn)快速的血液細(xì)胞形態(tài)學(xué)鏡檢，得到大量、清晰的細(xì)胞染色圖像。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對本發(fā)明所做的進(jìn)一步的詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明有所提交的權(quán)利要求書確定的專利保護(hù)范圍。權(quán)利要求一種基于染色技術(shù)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)鏡檢裝置，包括反應(yīng)池(1)、測量室(2)、液路單元(3)、以及顯微光學(xué)系統(tǒng)(4)，其特征在于，所述液路單元(3)包括細(xì)胞樣本接口和至少一種試劑接口；所述液路單元(3)至少與所述反應(yīng)池(1)和所述測量室(2)之一連通；所述反應(yīng)池(1)和所述測量室(2)之間連通；所述測量室(2)同時(shí)位于所述顯微光學(xué)系統(tǒng)(4)的內(nèi)部。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏡檢裝置，其特征在于所述的連通是指液體在兩個(gè)部件之間相互或者單向傳輸。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的鏡檢裝置，其特征在于所述測量室(2)是由透明材料構(gòu)成的扁平流體通道，光學(xué)測量方向厚度h小于通道寬度d，通道寬度d小于通道長度1。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鏡檢裝置，其特征在于所述扁平流體通道位于所述顯微光學(xué)系統(tǒng)(4)的物面位置。5.—種基于染色技術(shù)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)鏡檢方法，其特征在于，液路單元(3)將細(xì)胞樣本和至少一種試劑注入反應(yīng)池混合在一起；經(jīng)過一段時(shí)間，反應(yīng)池(1)內(nèi)的細(xì)胞樣本被注入測量室(2);在測量室(2)內(nèi)部流動的細(xì)胞樣本被顯微光學(xué)系統(tǒng)(4)成像。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鏡檢方法，其特征在于所述試劑包括化學(xué)染色試劑、熒光染色試劑、溶血劑、緩沖液、稀釋液、清洗液。全文摘要一種基于染色技術(shù)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)鏡檢裝置，包括反應(yīng)池、測量室、液路單元、以及顯微光學(xué)系統(tǒng)，其特征在于，液路單元包括細(xì)胞樣本接口和至少一種試劑接口；液路單元至少與反應(yīng)池和測量室之一連通；反應(yīng)池和測量室之間連通；測量室同時(shí)位于顯微光學(xué)系統(tǒng)的內(nèi)部。一種基于染色技術(shù)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)鏡檢方法，其特征在于液路單元將細(xì)胞樣本和至少一種試劑注入反應(yīng)池混合在一起；經(jīng)過一段時(shí)間，反應(yīng)池內(nèi)的細(xì)胞樣本被注入測量室；在測量室內(nèi)部流動的細(xì)胞樣本被顯微光學(xué)系統(tǒng)成像。本發(fā)明不需要復(fù)雜的機(jī)械涂片裝置，顯微光學(xué)系統(tǒng)固定，染色后的細(xì)胞樣本以流水線的方式快速通過顯微光學(xué)系統(tǒng)，因而可以實(shí)現(xiàn)高度自動化、結(jié)構(gòu)緊湊、快速的細(xì)胞形態(tài)學(xué)鏡檢。文檔編號G01N1/30GK101762585SQ200910136280公開日2010年6月30日申請日期2009年5月5日優(yōu)先權(quán)日2009年5月5日發(fā)明者孔兵申請人:孔兵