專利名稱：一種非破壞性測定花生種子主要脂肪酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及花生種子品質(zhì)成分的定量分析技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種應(yīng)用傅立葉變 換近紅外光譜分析技術(shù)、結(jié)合現(xiàn)代化學(xué)計(jì)量方法的非破壞性測定花生種子主要脂肪酸含量 的方法。
背景技術(shù)：
近年來，花生的育種目標(biāo)已從產(chǎn)量為主轉(zhuǎn)向了以產(chǎn)量和品質(zhì)并重，特別是注重了 對人類心腦血管疾病有防治作用的高油酸含量和高白藜蘆醇含量的選育研究。選育高油酸 含量(0/L值高)的花生新品種是花生品質(zhì)育種的最主要目標(biāo)之一。為改良花生的品質(zhì)，除 要求能簡便快捷處理大量樣品外，所采用的品質(zhì)檢測技術(shù)必須是非破壞性的，常規(guī)的化學(xué) 方法無法滿足上述要求。以往花生品種育種的內(nèi)在品質(zhì)測試均需常規(guī)化學(xué)方法，需要磨碎 部分樣品，因此品質(zhì)育種早期世代無法進(jìn)行選擇。所以，在育種技術(shù)上迫切需要研究出適合 早期世代選擇的簡便經(jīng)濟(jì)的品質(zhì)檢測技術(shù)。20世紀(jì)90年代后，由于傅立葉近紅外光譜技術(shù)的應(yīng)用，使得近紅外的應(yīng)用領(lǐng)域有 了很大的擴(kuò)展。由于傅立葉技術(shù)比傳統(tǒng)的光柵技術(shù)具有靈敏度高、分辨率高、波長準(zhǔn)確度和 精確度高、掃描速度快、信噪比好等顯著優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)有使用近紅外光譜技術(shù)非破壞性測定花 生單粒種子品質(zhì)的報(bào)道。但直接針對決定花生品質(zhì)的重要指標(biāo)——脂肪酸的含量進(jìn)行非破壞性測定的報(bào) 道尚未見到，由于花生種子顆粒較大且不均勻，使用近紅外光譜技術(shù)測定脂肪酸的含量需 要對現(xiàn)有技術(shù)作更多的改進(jìn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于現(xiàn)有技術(shù)中的傅立葉變換近紅外漫反射光譜技術(shù) 的測量方法，該方法采用積分球漫反射方式進(jìn)行光譜掃描，通過PLS算法的預(yù)測數(shù)學(xué)模型 對花生中主要脂肪酸含量進(jìn)行非破壞性分析。該方法操作簡單、靈敏度高、掃描速度快、測 定準(zhǔn)確性高。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種非破壞性測定花生種子主要脂肪酸含量的方法，包括 如下步驟第一步選擇有代表性的花生種子作為建立主要脂肪酸預(yù)測數(shù)學(xué)模型的標(biāo)準(zhǔn)樣品 集；第二步采用MPA型傅立葉變換近紅外光譜儀，使用漫反射大體積鍍金積分球作為 光譜采集手段，測定標(biāo)準(zhǔn)樣品集中的花生種子的漫反射光譜；第三步按照常規(guī)化學(xué)方法，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品集中的花生種子主要脂肪酸含量的測 定，所得值即為與第二步漫反射光譜對應(yīng)的化學(xué)值；第四步采用偏最小二乘法(PLS)的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立數(shù)學(xué)模型，使用內(nèi)部交叉 證實(shí)對模型進(jìn)行驗(yàn)證，比較樣品預(yù)測值與化學(xué)值的決定系數(shù)(R2)和均方差(RMSECV)，選取R2盡可能大而RMSECV盡可能小的組合，R2和RMSECV按照以下公式計(jì)算 其中=Differi表示第i個樣品的化學(xué)值和交叉證實(shí)預(yù)測值之差，M為樣品數(shù)，為 第i個樣品的化學(xué)值，Yffl為M個樣品交叉預(yù)測值的平均值；交叉證實(shí)預(yù)測值是每次交叉剔 除1個或幾個樣品(由實(shí)驗(yàn)者確定)，用其他樣品建模預(yù)測被剔除的樣品所獲得的值；第五步按照第二步的方法采集待測樣品的近紅外光譜信息，將光譜輸入預(yù)測模 型，確定待測樣品的主要脂肪酸含量。所述第一步中選擇有代表性的花生種子，其步驟為首先對至少150份以上的不同 類型花生品種的飽滿種子進(jìn)行近紅外掃描，獲得這些種子的近紅外光譜，隨后采用重心法 和網(wǎng)格法選取有代表性的花生種子，作為建立主要脂肪酸預(yù)測數(shù)學(xué)模型的標(biāo)準(zhǔn)樣品集。所述第二步采用MPA型傅立葉變換近紅外光譜儀測定漫反射光譜時，花生種子裝 入光譜儀的石英樣品杯中，其體積需大于石英樣品杯的四分之三，并混勻樣品，使花生種子 間空隙盡量小。所述第二步中測定標(biāo)準(zhǔn)樣品集中花生種子的漫反射光譜，掃描譜區(qū)范圍為 4000-1250001^。所述第四步中建立預(yù)測數(shù)學(xué)模型的最優(yōu)譜區(qū)范圍是9997-4242CHT1。所述第四步中建立預(yù)測數(shù)學(xué)模型的光譜處理方式是一階導(dǎo)數(shù)加多元散射校正技 術(shù)。所述脂肪酸是油酸或亞油酸或棕櫚酸或硬脂酸。在第四步建立預(yù)測數(shù)學(xué)模型中上述的脂肪酸如油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸最佳 的主成分維數(shù)分別是10，9，6，9。本發(fā)明的原理是，以傅立葉變換近紅外漫反射技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代化學(xué)計(jì)量方 法，采用漫反射測定方式，以多種基因型的花生品種作為樣品背景，通過化學(xué)計(jì)量學(xué)方法， 采用偏最小二乘法建立數(shù)學(xué)模型，再由模型測定未知樣品的主要脂肪酸的含量。本發(fā)明適用于以提高花生重要脂肪酸含量為目的的品質(zhì)育種研究，可用于分離早 期世代花生種子重要脂肪酸含量的非破壞性檢測，也適用于花生種質(zhì)資源鑒定和遺傳規(guī)律 研究。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果1、本發(fā)明是一種非破壞性的分析方法，是以完整的花生種子為測定對象，樣品不 需要任何預(yù)處理就可以快速檢測出其主要脂肪酸的含量，對種子的活力和組織結(jié)構(gòu)無任何 損傷。2、本發(fā)明方法操作簡單、靈敏度高、掃描速度快、信噪比好、測定成本低、測定速度 快，可在短期內(nèi)處理大量樣品，特別適用于花生高油酸育種早期世代的篩選。3、本發(fā)明方法的測定準(zhǔn)確性較高，可滿足花生高油酸育種的要求。
圖1是本發(fā)明實(shí)施例中的花生種子的近紅外漫反射光譜圖2是本發(fā)明實(shí)施例中花生種子的油酸含量交叉驗(yàn)證相關(guān)圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例中花生種子的亞油酸含量交叉驗(yàn)證相關(guān)圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例中花生種子的棕櫚酸含量交叉驗(yàn)證相關(guān)圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例中花生種子的硬脂酸含量交叉驗(yàn)證相關(guān)圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的非破壞性測定花生種子主要脂肪酸含量的方法，包括如下步驟第一步選擇花生種子的標(biāo)準(zhǔn)樣品集為了建立主要脂肪酸預(yù)測數(shù)學(xué)模型，需要選擇花生種子的標(biāo)準(zhǔn)樣品集，樣品的數(shù) 量不能少于150份。本實(shí)施例中選擇具有不同基因型的花生品種作為建模的標(biāo)準(zhǔn)樣品集， 其中選擇了山東省花生研究所保存的地方品種、穩(wěn)定的突變體及育成的品種共計(jì)331份， 這些材料都是花生的成熟飽滿種子，其中普通型51份，龍生型13份，多粒型19份，珍珠豆 型116份，中間型132份。對這331份花生材料進(jìn)行近紅外掃描，獲得其近紅外光譜，然后 采用重心法和網(wǎng)格法選取有代表性的60份材料，作為建立主要脂肪酸預(yù)測數(shù)學(xué)模型的標(biāo) 準(zhǔn)樣品集。將選定作為標(biāo)準(zhǔn)樣品集的花生材料在60-65°C下恒溫烘干6個小時，使含水量小 于8%，密閉備用。本發(fā)明所說的樣品代表性是指樣品遺傳背景的多樣化、時間(年份和季 節(jié))和空間(產(chǎn)地來源)分布的多樣性。樣品集代表性的好壞對預(yù)測模型的穩(wěn)定性、適應(yīng) 性有很大影響。第二步測定標(biāo)準(zhǔn)樣品集中花生種子的近紅外漫反射光譜采用MPA型傅立葉變換近紅外光譜儀(德國布魯克光譜儀器公司制造)，使用漫反 射大體積鍍金積分球作為光譜采集手段，采樣窗口直徑2cm，高靈敏度的PbS檢測器，掃描 譜區(qū)范圍^OO-USOOcnT1，掃描次數(shù)為64次，分辨率為ScnT1。采用旋轉(zhuǎn)樣品臺以增加采樣 面積，樣品杯為5cm內(nèi)徑，旋轉(zhuǎn)后實(shí)際采集光譜的樣品面積為18. 84cm-10將花生種子直接 倒入光譜儀的石英樣品杯中，裝入的體積應(yīng)不少于樣品杯體積的四分之三，約30-50粒，混 勻樣品，使花生種子間空隙盡量小。測定時樣品杯自動旋轉(zhuǎn)，以獲得較多種子的近紅外光譜 信息。積分球直徑為10cm，大體積積分球可以對大顆粒樣品漫反射譜進(jìn)行平均，以得到好的 光譜重現(xiàn)性。通常在4000-12500CHT1譜區(qū)內(nèi)，花生種子的近紅外漫反射光譜有獨(dú)特的吸收 特征，見圖1?；ㄉN子中豐富的油脂類和蛋白質(zhì)含有大量的C-H、0-Η、Ν-Η基團(tuán)，在 4000-5300cm-1的合頻區(qū)形成強(qiáng)烈的吸收；在δβΟΟ-ΤΟΟΟαιΓ1的一倍頻區(qū)也有較為強(qiáng)烈的吸 收；在TOOO-USOOcnT1的高倍頻區(qū)吸收相對較弱。鮮明的漫反射光譜吸收特征為含油量的
定量分析提供了豐富的信息基礎(chǔ)。第三步標(biāo)準(zhǔn)樣品集中花生種子的主要脂肪酸含量化學(xué)值的測定將第一步選取的60份標(biāo)準(zhǔn)樣品集中的花生種子按常規(guī)化學(xué)方法測定其主要的脂 肪酸含量，可參照GB10219-88方法來測定，由農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(濟(jì)南) 完成該步驟的測定。第四步花生種子的主要脂肪酸含量預(yù)測數(shù)學(xué)模型的建立和優(yōu)化采用偏最小二乘法(PLS)的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立數(shù)學(xué)模型，使用內(nèi)部交叉證實(shí) 對模型進(jìn)行驗(yàn)證，即是每次交叉剔除1個或幾個樣品(由實(shí)驗(yàn)者確定)，用其他樣品建模預(yù)測被剔除的樣品，依次進(jìn)行，并通過比較樣品預(yù)測值與化學(xué)值的決定系數(shù)(R2)和均方差 (RMSECV)，選取R2盡可能大而RMSECV盡可能小的組合，R2和RMSECV按照以下公式計(jì)算 其中=Differi表示第i個樣品的化學(xué)值和交叉證實(shí)預(yù)測值之差，M為樣品數(shù)，為 第i個樣品的化學(xué)值，Yffl為M個樣品交叉預(yù)測值的平均值。本實(shí)施例采用布魯克光譜儀器公司OPUS軟件的自動優(yōu)化功能，根據(jù)RMSECV最小 的原則，選擇出最佳的分析譜區(qū)，最好的光譜預(yù)處理方式，以及最佳的主成分維數(shù)的模型參 數(shù)組合。經(jīng)反復(fù)測試比較，獲得脂肪酸的信息廣泛分布在9997-4242CHT1的范圍，并且最好 的光譜處理方式是一階導(dǎo)數(shù)加多元散射校正技術(shù)，對油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸最佳的 主成分維數(shù)分別是10、9、6、9。第五步模型預(yù)測效果分析采用內(nèi)部交叉證實(shí)對預(yù)測數(shù)學(xué)模型進(jìn)行驗(yàn)證。內(nèi)部交叉證實(shí)是指依次剔除建模樣 品集中一個或多個樣品，用剩余樣品來建模預(yù)測被剔除樣品的含量，比較被剔除樣品預(yù)測 值與化學(xué)值的差異，由此判斷所建模型的預(yù)測準(zhǔn)確性。圖2、3、4、5是四種脂肪酸的交叉驗(yàn) 證預(yù)測結(jié)果。油酸含量交叉驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果的主要參數(shù)R2為98. 74%, RMSECV為1. 87，含量 范圍為38-84. 4%；亞油酸含量交叉驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果的主要參數(shù)R2為98. 97%,RMSECV為1. 5， 含量范圍為2. 3-43. 1% ；棕櫚酸含量交叉驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果的主要參數(shù)R2為96. 02%, RMSECV 為0. 52，含量范圍為5. 3-13. 1%;硬脂酸含量交叉驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果的主要參數(shù)R2為73. 91%, RMSECV 為 0. 37，含量范圍為 2. 1-6. 5%0經(jīng)效果驗(yàn)證分析后，如果所建模型的預(yù)測準(zhǔn)確性達(dá)到要求，則可進(jìn)入下一步驟，如 果沒有達(dá)到要求，則繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整參數(shù)直到達(dá)到要求。第六步應(yīng)用模型測定未知樣品建立好預(yù)測數(shù)學(xué)模型之后，就可以測定未知樣品的主要脂肪酸含量。重復(fù)第二步 采集未知樣品的近紅外光譜，將光譜輸入預(yù)測模型，計(jì)算機(jī)立即給出未知樣品主要脂肪酸 的含量。
權(quán)利要求
一種非破壞性測定花生種子主要脂肪酸含量的方法，其特征在于包括如下步驟第一步選擇有代表性的花生種子作為建立主要脂肪酸預(yù)測數(shù)學(xué)模型的標(biāo)準(zhǔn)樣品集；第二步采用MPA型傅立葉變換近紅外光譜儀，使用漫反射大體積鍍金積分球作為光譜采集手段，測定標(biāo)準(zhǔn)樣品集的花生種子的漫反射光譜；第三步按照常規(guī)化學(xué)方法，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品集的花生種子主要脂肪酸含量的測定，所得值即為與第二步中漫反射光譜對應(yīng)的化學(xué)值；第四步采用偏最小二乘法的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立主要脂肪酸預(yù)測數(shù)學(xué)模型，使用內(nèi)部交叉證實(shí)對模型進(jìn)行驗(yàn)證，比較樣品預(yù)測值與化學(xué)值的決定系數(shù)R2和均方差RMSECV，選取R2盡可能大而RMSECV盡可能小的組合，R2和RMSECV按照以下公式計(jì)算 <mrow><mi>RMSECV</mi><mo>=</mo><msqrt> <mfrac><mn>1</mn><mi>M</mi> </mfrac> <mi>Σ</mi> <msup><mrow> <mo>(</mo> <msub><mi>Differ</mi><mi>i</mi> </msub> <mo>)</mo></mrow><mn>2</mn> </msup></msqrt> </mrow> <mrow><msup> <mi>R</mi> <mn>2</mn></msup><mo>=</mo><mrow> <mo>(</mo> <msup><mrow> <mn>1</mn> <mo>-</mo> <mfrac><mrow> <mi>Σ</mi> <mrow><mo>(</mo><msub> <mi>Differ</mi> <mi>i</mi></msub><mo>)</mo> </mrow></mrow><mrow> <mi>Σ</mi> <mrow><mo>(</mo><msub> <mi>y</mi> <mi>i</mi></msub><mo>-</mo><msub> <mi>y</mi> <mi>m</mi></msub><msup> <mo>)</mo> <mn>2</mn></msup> </mrow></mrow> </mfrac></mrow><mn>2</mn> </msup> <mo>)</mo></mrow> </mrow>其中Differi表示第i個樣品的化學(xué)值和交叉證實(shí)預(yù)測值之差，M為樣品數(shù)，yi為第i個樣品的化學(xué)值，ym為M個樣品交叉預(yù)測值的平均值；第五步按照第二步的方法采集待測樣品的近紅外光譜信息，將光譜輸入預(yù)測模型，確定待測樣品的主要脂肪酸含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非破壞性測定花生種子主要脂肪酸含量的方法，其特征在于 所述第一步中選擇有代表性的花生種子，其步驟為首先對至少150份以上的不同基因型 花生品種的飽滿種子進(jìn)行近紅外掃描，獲得這些種子的近紅外光譜，隨后采用重心法和網(wǎng) 格法選取有代表性的花生種子，作為建立主要脂肪酸預(yù)測數(shù)學(xué)模型的標(biāo)準(zhǔn)樣品集。
3 根據(jù)權(quán)利要求1所述的非破壞性測定花生種子主要脂肪酸含量的方法，其特征在于 所述第二步采用MPA型傅立葉變換近紅外光譜儀測定漫反射光譜時，花生種子裝入光譜儀 的石英樣品杯中，其體積需大于石英樣品杯的四分之三，并混勻樣品，使花生種子間空隙盡 量小。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的非破壞性測定花生種子主要脂肪酸含量的方 法，其特征在于所述第二步中測定標(biāo)準(zhǔn)樣品集中花生種子的漫反射光譜，掃描譜區(qū)范圍為 4000-1250001^。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非破壞性測定花生種子主要脂肪酸含量的方法，其特征在于 建立預(yù)測數(shù)學(xué)模型的最優(yōu)譜區(qū)范圍是9997-4242CHT1。
6 根據(jù)權(quán)利要求5所述的非破壞性測定花生種子主要脂肪酸含量的方法，其特征在于 建立預(yù)測數(shù)學(xué)模型光譜處理方式是一階導(dǎo)數(shù)加多元散射校正技術(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非破壞性測定花生種子主要脂肪酸含量的方法，其特征在于 主要脂肪酸是油酸或亞油酸或棕櫚酸或硬脂酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的非破壞性測定花生種子主要脂肪酸含量的方法，其特征在于 建立預(yù)測數(shù)學(xué)模型中油酸或亞油酸或棕櫚酸或硬脂酸的主成分維數(shù)分別是10，9，6，9。
全文摘要
本發(fā)明是一種非破壞性測定花生種子主要脂肪酸含量的方法，該方法以傅立葉變換近紅外漫反射光譜技術(shù)為基礎(chǔ)，采用消除固體顆粒不均勻性最好的積分球漫反射方式進(jìn)行光譜掃描，以多種基因型的花生飽滿種子為標(biāo)準(zhǔn)樣品集建立多元回歸數(shù)學(xué)模型，通過模型預(yù)測未知樣品的主要脂肪酸含量。本發(fā)明方法是非破壞性的，不需要對樣品進(jìn)行任何預(yù)處理，不傷害種子活力和組織結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的方法操作簡單，靈敏度高，掃描速度快，信噪比好，測定速度快，適用于花生高油酸品質(zhì)育種、種質(zhì)資源鑒定和遺傳規(guī)律研究。
文檔編號G01N21/51GK101887018SQ200910136388
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月13日
發(fā)明者曹玉良, 朱雨杰, 楊慶利, 潘麗娟, 禹山林, 閔平 申請人:山東省花生研究所