專利名稱：：氨基酸與肉毒堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明屬生物化學
技術(shù)領域：
，涉及氨基酸與肉毒堿定量檢測試劑盒，具體涉及一種串聯(lián)質(zhì)譜檢測先天代謝性疾病患兒血液樣本中氨基酸與肉毒堿的試劑盒。
背景技術(shù)：
：氨基酸和肉毒堿是參與人體生理代謝的重要物質(zhì)，這類物質(zhì)在人體內(nèi)正常代謝保持一定的水平。這類物質(zhì)的濃度改變往往提示人體代謝途徑發(fā)生異常。通過檢測這些物質(zhì)的濃度，結(jié)合臨床表現(xiàn)，幫助臨床疾病的判斷。串聯(lián)質(zhì)譜定量技術(shù)的基本原理利用同位素取代的方法，將待分析物(包括氨基酸和肉毒堿)中的氫原子、碳原子或氮原子用氖原子或碳13原子置換，形成與待分析物分子結(jié)構(gòu)一致而分子量相差1-9的標準物質(zhì)。標準物質(zhì)與樣品中的待分析物一起被送入到串聯(lián)質(zhì)譜儀中被檢測到。被分析物的濃度與通過串聯(lián)質(zhì)譜檢測到的離子豐度成正比。而高分辨的串聯(lián)質(zhì)譜又可以將相差l-9個質(zhì)子大小的分子區(qū)分開。根據(jù)已知濃度的內(nèi)標準品的離子豐度和被分析物的離子豐度，就可以得到被分析物的濃度。先天代謝性疾病是由于先天代謝的酶缺乏而導致。這些先天代謝異常疾病通常在出生后會有一段時間的無癥狀期，之后會出現(xiàn)急性癥狀(如嘔吐、昏迷、肝衰竭)或其它癥狀。先天代謝性疾病種類多，缺乏特異性臨床癥狀及早期可靠的實驗室指標，早期診斷十分困難。目前尚無有效的手段進行早期確診。串聯(lián)質(zhì)譜檢測是近幾年興起的技術(shù)，具有準確性高、重現(xiàn)性好等特點，已廣泛用于蛋白分子結(jié)構(gòu)研究、生物小分子定性定量檢測等諸多領域，在檢測與應用領域是目前的研究熱點之一。建立快速可靠的篩查和診斷新生兒先天代謝性疾病的新方法已成為可能并被嘗試。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供氨基酸與肉毒堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測試劑盒，該試劑盒由氨基酸和肉毒堿同位素標準品、衍生化溶液、萃取溶液、復溶液、流動相、96孔反應板、包裝盒體、襯墊和操作說明書組成，襯墊設有容器孔，分別放置同位素標準品、衍生化溶液、萃取溶液、復溶液和流動相，96孔反應板單獨排列放置。其中氨基酸和肉毒堿同位素標準品含有12種氨基酸和8種肉毒堿，衍生化溶液含丁醇，萃取溶液含甲醇和水，復溶液含乙腈和水，流動相含乙腈、水或甲酸中的一種。所有溶液必須用0.22iim膜過濾預處理。其中氨基酸內(nèi)標準品為15N，2-13C-GlycineH4_AlanineHs_Valine'H—LeucineH_MethionineH5_Pheny1a1anine'C6_TyrosineH3_Aspartate'H—GlutamateH9_0rnithine2HC1H9_CitrullineH4，C一ArginineHCl肉毒堿內(nèi)標準品為2H9-CN)-carnitine(freecarnitine,2H3--acetylcarnitine(C2)2H3--propionylcarnitine(C3)2H3--butyrylcarnitine(C4)2H9-—iSOTalerylcarnitine(C5)2H3--octanoylcarnitine(C8)2H9--myristoylcarnitine(C14)4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本試劑盒保存于2-8°C。本發(fā)明試劑盒使用方法—、干血片的制作新生兒在出生后喂飽母乳48小時后進行血樣采集。用穿剌針進行足跟采血，滴在S&S903濾紙片上，讓血液均勻擴散，并在室溫下風干4小時以上，及時送檢，如不能及時送檢，套入有封口的塑料袋內(nèi)密封后放2-『C冰箱保存。二、實驗操作內(nèi)標標準萃取工作溶液準備依據(jù)本次實驗標本量計算內(nèi)標標準萃取工作溶液的量，按1:200濃度將濃縮的內(nèi)標標準用萃取溶液稀釋，注意充分混勻。萃取用打孔器從血片上打下血斑，放入到96孔U型底微孔板相應孔的位置，用多孔移液器或連續(xù)移液器以90iiL/孔，加入預先配制好的含內(nèi)標萃取溶液。封上粘性膜進行恒溫振蕩，溫度設定為30°C，頻率為750rpm/分鐘，振蕩30分鐘。每孔取60yL轉(zhuǎn)移到V型96孔微孔板對應的孔內(nèi)，放96孔氮氣吹干儀上進行吹干，條件設定上部45°C，流量50L/min，下部45tV流量25L/min;時間為10-15分鐘。衍生目測V型底微孔板已經(jīng)吹干，每孔加50iiL的衍生化試劑3N-HCl-n-Butanol。封上熱封膜恒溫靜置，溫度設定為6(TC，放置30分鐘。揭去熱封膜，放96孔氮氣吹干儀上進行吹干，條件設定上部45tV流量50L/min，下部45tV流量25L/min;時間為10-15分鐘。復溶取出完全吹干的V型底微孔板，每孔加入75iiL的復溶液，用鋁膜包起，恒溫振蕩，溫度設定為27t:，頻率為750rpm/分鐘，振蕩10分鐘。三、上機測定。四、定量結(jié)果報告根據(jù)儀器設定程序自動得到各種氨基酸和肉毒堿的濃度。本發(fā)明的有益之處是該試劑盒運用串聯(lián)質(zhì)譜方法實現(xiàn)了一次測定能對幾十種物質(zhì)的定性和定量分析。有效地解決了以往一次測定只得到一種分析物的問題，對多種代謝性疾病進行聯(lián)合篩查檢測，提高了篩查檢測的效率和檢出率，為代謝性疾病的早期檢測提供依據(jù)。圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為苯丙氨尿癥患者質(zhì)譜分析圖譜。圖3為正常人的質(zhì)譜分析圖譜。圖4為丙酸血癥患者質(zhì)譜分析圖譜。圖5為正常人的質(zhì)譜分析圖譜。圖6為楓糖尿癥患者質(zhì)譜分析圖譜。圖7為正常人的質(zhì)譜分析圖譜。具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實施例作進一步說明。應該理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實施例1參見圖l，試劑盒由氨基酸和肉毒堿同位素標準品1、衍生化溶液2、萃取溶液3、復溶液4、流動相5、96孔反應板6、包裝盒體7、襯墊8和操作說明書9組成，襯墊8設有容器孔，分別放置同位素標準品1、萃取溶液2、衍生化溶液3、復溶液4和流動相5，96孔反應板6單獨排列放置。本試劑盒保存于2-8°C。其中氨基酸和肉毒堿同位素標準品含有12種氨基酸和8種肉毒堿，衍生化溶液含丁醇，萃取溶液含甲醇和水，復溶液含乙腈和水，流動相含乙腈、水或甲酸中的一種。所有溶液必須用0.22iim膜過濾預處理。氨基酸內(nèi)標準品為<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>肉毒堿內(nèi)標準品為<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2應用實施例1試劑盒對5000余例新生兒血樣標本進行檢測。累計檢測出苯丙酮尿癥患兒4例，丙酸血癥患兒2例，楓糖尿癥患兒2例。苯丙酮尿癥患兒及正常人的質(zhì)譜分析圖譜結(jié)果分別參見圖2、3，丙酸血癥患兒及正常人的質(zhì)譜分析圖譜結(jié)果分別參見圖4、5，楓糖尿癥患兒及正常人的質(zhì)譜分析圖譜結(jié)果分別參見圖6、7。試劑材料實施例1所描述試劑盒(960T);標本全省收集的新生兒血斑；檢測方法1.按l:200濃度將濃縮的內(nèi)標標準用取溶液稀釋；2.用打孔器從血片上打下血斑，放入到96孔U型底微孔板相應孔的位置，用多孔移液器或連續(xù)移液器以90L/孔，加入預先配制好的含內(nèi)標萃取溶液。封上粘性膜進行恒溫振蕩，溫度設定為30°C，頻率為750rpm/分鐘，振蕩30分鐘。每孔取60yL轉(zhuǎn)移到V型96孔微孔板對應的孔內(nèi)，放96孔氮氣吹干儀上進行吹干，條件設定上部45°C，流量50L/min，下部45tV流量25L/min;時間為10-15分鐘；3.目測V型底微孔板已經(jīng)吹干，每孔加50iiL的衍生化試劑3N-HCl-n-Butano1。封上熱封膜恒溫靜置，溫度設定為6(TC，放置30分鐘。揭去熱封膜，放96孔氮氣吹干儀上進行吹干，條件設定上部45tV流量50L/min，下部45tV流量25L/min;時間為10-15分鐘；4.取出完全吹干的V型底微孔板，每孔加入75i！L的復溶液，用鋁膜包起，恒溫振蕩，溫度設定為27t:，頻率為750rpm/分鐘，振蕩10分鐘；5.上機測定，根據(jù)儀器設定程序自動得到各種氨基酸和肉毒堿的濃度。圖2和圖3中，代表苯丙氨酸的峰與代表苯丙氨酸內(nèi)標準品的峰分別表示的是樣本中的苯丙氨酸和苯丙氨酸內(nèi)標準品的離子豐度，與他們的濃度成正比。在正常人圖譜中，樣本的苯丙氨酸與內(nèi)標準品相比其濃度低，在正常范圍內(nèi)；在本丙酮尿癥患者的圖譜中，樣本的苯丙氨酸與內(nèi)標準品相比其濃度高出很多，超出正常范圍。本發(fā)明是結(jié)合試劑盒進行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求一種氨基酸與肉毒堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測試劑盒，其特征是由氨基酸和肉毒堿同位素標準品(1)、衍生化溶液(2)、萃取溶液(3)、復溶液(4)、流動相(5)、96孔反應板(6)、包裝盒體(7)、襯墊(8)和操作說明書(9)組成，襯墊(8)設有容器孔，分別放置同位素標準品(1)、衍生化溶液(2)、萃取溶液(3)、復溶液(4)、流動相(5)，96孔反應板(6)單獨排列放置。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氨基酸與肉毒堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測試劑盒，其特征是其中氨基酸和肉毒堿同位素標準品(1)含有12種氨基酸和8種肉毒堿，衍生化溶液(2)含丁醇，萃取溶液(3)含甲醇和水，復溶液(4)含乙腈和水，流動相(5)含乙腈、水或甲酸中的一種，所有溶液必須用0.22iim膜過濾預處理。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氨基酸與肉毒堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測試劑盒，其特征是試劑盒保存于2-『C。全文摘要本發(fā)明一種提供氨基酸與肉毒堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測試劑盒，由氨基酸和肉毒堿同位素標準品、衍生化溶液、萃取溶液、復溶液、流動相、96孔反應板、包裝盒體、襯墊和操作說明書組成，襯墊設有容器孔，分別放置同位素標準品、衍生化溶液、萃取溶液、復溶液、流動相，96孔反應板單獨排列放置。本發(fā)明試劑盒運用串聯(lián)質(zhì)譜方法實現(xiàn)一次測定能對幾十種物質(zhì)的定性和定量分析，有效地解決了以往一次測定只得到一種分析物的問題，對多種代謝性疾病進行聯(lián)合篩查檢測，提高了篩查檢測的效率和檢出率，為代謝性疾病的早期檢測提供依據(jù)。文檔編號G01N27/62GK101788528SQ20091015713公開日2010年7月28日申請日期2009年12月22日優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日發(fā)明者尚世強,趙正言,黃成剛申請人:浙江大學