專利名稱：一種檢測(cè)雙烯雌酚的直接競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè) 雙烯雌酚的直接競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
雙烯雌酚(dienestrol， DE)是一種人工合成的非甾體類雌激素，其化學(xué)名為3,4-雙(對(duì) 羥基苯基)-2,4-己二烯，含有酚羥基，是一種弱酸性化合物。主要應(yīng)用于提高奶牛產(chǎn)奶量和畜 禽動(dòng)物的生長(zhǎng)催肥。相對(duì)于天然雌激素，人工合成雌激素通常穩(wěn)定，在體內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng),因?yàn)?其是親脂性物質(zhì),易在人和動(dòng)物的脂肪及組織中殘留。雌激素可以通過(guò)食物鏈危害人類健 康，使女性幼兒提前發(fā)育，男性兒童乳腺發(fā)育成女性化；使男性生殖發(fā)育異常與病變及女 性乳腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生率上升，同時(shí)具有致癌作用。已被世界上許多國(guó)家禁止應(yīng) 用。
現(xiàn)有的雙烯雌酚檢測(cè)方法為色譜法(參見(jiàn)，例如，中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2006， 18 (5)， 第420-422頁(yè))，但是這些方法需要有完善的實(shí)驗(yàn)室，有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員及復(fù)雜的儀器設(shè)備， 且檢測(cè)過(guò)程繁瑣，不適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)大量樣本的篩查。基于抗原抗體免疫反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù) 為小分子殘留物的分析檢測(cè)提供了一個(gè)新的途徑?；诖嗽斫⒌闹苯痈?jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫 檢測(cè)技術(shù)較間接方法進(jìn)一步縮短了檢測(cè)時(shí)間。該技術(shù)的關(guān)鍵是人工抗原和酶標(biāo)記抗原的合 成及抗體的制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)雙烯雌酚的酶聯(lián)免疫試劑盒。 本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理為
將雙烯雌酚抗體包被于固相載體上，加入樣本或雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液并加入酶標(biāo)記雙 烯雌酚辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物工作液，待測(cè)樣品中的雙烯雌酚與酶標(biāo)記雙烯雌酚競(jìng)爭(zhēng)固相 化的雙烯雌酚抗體，通過(guò)洗滌除去未結(jié)合的酶標(biāo)記物，顯色后終止，測(cè)定樣品的吸光度值， 該值與樣品中雙烯雌酚的量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出雙烯雌酚濃度范圍。本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)雙烯雌酚的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒包括雙烯雌酚特 異性抗體、包被有雙烯雌酚特異性抗體的酶標(biāo)板、雙烯雌酚辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物及其工 作液。其中雙烯雌酚特異性抗體為兔抗雙烯雌酚的多克隆抗體，用雙烯雌酚與載體蛋白偶 聯(lián)物作為免疫原通過(guò)免疫動(dòng)物(例如兔)制得。所述的雙烯雌酚辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物采 用化學(xué)方法偶聯(lián)得到，標(biāo)記所用的酶為辣根過(guò)氧化物酶，所述偶聯(lián)方法為琥珀酸酐法。
用于制備所述酶標(biāo)板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。 載體的形式是微量反應(yīng)板凹孔。
為方便現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大量樣本篩查，所述試劑盒還可以進(jìn)一步包括雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液、 顯色劑A液和顯色劑B液、濃縮洗滌液、終止液和濃縮樣品稀釋液。
所述的洗滌液為含有0.05%—0.5%吐溫一20的0.01mol/LpH 7.4的磷酸鹽緩沖液。顯 色劑A液含有底物過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，顯色劑B液含有供氫體四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺， 應(yīng)用時(shí)兩種混合液按l"比例混合。所述的濃縮樣品稀釋液為含0.1%吐溫一20的0. 1 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液。所述的雙烯雌酚辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物工作液為直接可以應(yīng)用的 液體，達(dá)到最佳應(yīng)用濃度，不需再稀釋。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)食品、畜產(chǎn)品、水產(chǎn)品或飼料樣品中雙烯雌酚含 量的方法，包括步驟
(1) 樣品前處理；
(2) 用本發(fā)明所述試劑盒對(duì)經(jīng)過(guò)前處理的樣品進(jìn)行檢測(cè)，向包被有雙烯雌酚抗體的酶標(biāo) 板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液100ul，再加入雙烯雌酚辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物工作液50ul， 室溫溫育30分鐘，洗液洗板4次，加等體積的顯色劑A液和B液各50ul，室溫溫育15分 鐘、50ul終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值；
(3) 分析檢測(cè)結(jié)果。
本發(fā)明所述樣品前處理是本領(lǐng)域通常所述的檢測(cè)前對(duì)樣品進(jìn)行的常規(guī)處理，通常包括 樣品的粉碎、勻漿、有機(jī)溶劑(例如，甲醇、乙酸乙酯等)提取。 有益效果
本發(fā)明檢測(cè)雙烯雌酚的試劑盒主要采用直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫測(cè)定法定性或定量檢測(cè)樣品 中雙烯雌酚含量；進(jìn)一步縮短了檢測(cè)時(shí)間，為l個(gè)小時(shí)以內(nèi)，對(duì)樣品的前處理要求低，樣 品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品。本發(fā)明采用高特異性的雙烯雌酚多克隆抗體，主要試劑以工作液形式提供，可以減少 試劑盒的操作步驟，為使用者節(jié)省時(shí)間并降低因操作步驟冗繁造成的誤差，本發(fā)明具有靈 敏度高、特異性強(qiáng)、精確度高、準(zhǔn)確度高、對(duì)儀器設(shè)備要求低、試劑保存時(shí)間長(zhǎng)、自動(dòng)化 程度高、無(wú)放射性同位素污染的等優(yōu)點(diǎn)，可在飼料、動(dòng)物源性產(chǎn)品及食品檢測(cè)中發(fā)揮重要 作用。


圖l為雙烯雌酚抑制曲線，其中橫坐標(biāo)為抑制濃度，抑制濃度由左至右分別為0， 1， 3， 9， 27， 81 (ng/ml)，縱坐標(biāo)為吸光度(OD)。
提供下述實(shí)施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，而決不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍 構(gòu)成任何限制。
實(shí)施例
實(shí)施例1雙烯雌酚免疫原的合成及免疫血清的制備
1.1試劑與儀器
雙烯雌酚(德國(guó)Dr)，琥珀酸酐(Sigma公司)，吡啶(Sigma公司)，EDC (上海共價(jià) 化學(xué)試劑公司)，牛血清白蛋白(BSA)、匙鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH， Sigma公司)，辣根過(guò) 氧化物酶(HRP)(上?？笊锛夹g(shù)有限公司)，其它試劑均為分析純。
雙光束紫外可見(jiàn)分光光度儀(TU-1909,北京普析通用儀器有限公司)，層析裝置(3057 型便攜式記錄儀，重慶川儀四廠；SBS系列數(shù)控計(jì)滴器，恒流泵，自動(dòng)部分收集器，層析 柱，上海滬西分析儀器廠)，磁力攪拌器(上海東榮豐科學(xué)儀器有限公司)，臺(tái)式離心機(jī)
(Minispin最大轉(zhuǎn)速13400rpm最大離心力12100rcf， 2mlxl2)。 1.2雙烯雌酚人工抗原的合成
I. 2.1免疫原的合成
稱取26.6毫克(O.lmmol)雙烯雌酚溶于lmlDMSO中,充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙?，加?br> II. 7毫克氯乙酸鈉,室溫?cái)嚢?小時(shí)；
稱取50毫克KLH，以0.1mol/L的PBS溶解，緩慢滴加DMSO充分?jǐn)嚢?，使其占?溶液的50%，將氯乙酸鈉活化的雙烯雌酚加入到KLH溶液中，以10M氫氧化鈉調(diào)溶液pH 值至ll，加入EDC0.2-0.3M (約100mg)，攪拌反應(yīng)過(guò)夜。過(guò)SephdexG-25M凝膠柱提純，
5即得本發(fā)明所述的雙烯雌酚-KLH偶聯(lián)物(DE-KLH)，作為下述實(shí)驗(yàn)的免疫原。
I. 2.2包被抗原的合成
稱取26.6毫克(O.lmmol)雙烯雌酚溶于lmlDMSO中，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙猓尤?br> II. 7毫克6-溴己酸，室溫?cái)嚢?小時(shí)；
稱取67毫克BSA，以0.1 mol/L的PBS溶解，緩慢滴加DMSO充分?jǐn)嚢?，使其占?溶液的50%，將6-溴己酸活化的雙烯雌酚加入到BSA溶液中，以10M氫氧化鈉調(diào)溶液pH 值至ll，加入EDC0.2-0.3M (約100mg)，攪拌反應(yīng)過(guò)夜。過(guò)S印hdexG-25M凝膠柱提純， 即得本發(fā)明所述的雙烯雌酚-BSA偶聯(lián)物(DE-BSA),作為下述實(shí)驗(yàn)的包被抗原。 1.2.3酶標(biāo)記抗原的合成
稱取26.6毫克(O.lmmoI)的雙烯雌酚溶于lml無(wú)水吡啶中，加入10毫克琥珀酸酐， 室溫下攪拌4小時(shí)，N2吹干，以一定體積DMSO復(fù)溶。
稱取44毫克辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，以0.1 mol/L的PBS溶解，緩慢滴加DMSO 充分?jǐn)嚢?，使其占總?cè)芤旱?0%，將琥珀酸酐活化的雙烯雌酚加入到HRP溶液中，以10M 氫氧化鈉調(diào)溶液pH值至11，加入EDC 0.2-0.3M (約100-150mg)，攪拌反應(yīng)過(guò)夜。過(guò) SephdexG-25M凝膠柱提純，即得辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的雙烯雌酚(HRP-DE)提純后加等量 甘油保存與-20。C。 1.3免疫及特異性抗血清的制備
將1.2.1中制備的DE-KLH偶聯(lián)物用生理鹽水稀釋成lmg/ml溶液作為免疫原備用。
選取5只體重2 2.5Kg健康雄性新西蘭大白兔。將偶聯(lián)物與等量弗氏完全佐劑通過(guò)注 射器對(duì)抽法混合成油包水的乳濁液，按lmg/Kg體重的量進(jìn)行首次免疫，采取背部皮下多 點(diǎn)注射。每隔20天加強(qiáng)免疫一次，用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，劑量及方法同首 次免疫。從第三次免疫開(kāi)始，每次免疫后10天，耳緣靜脈取血lml,進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)， 當(dāng)抗體效價(jià)不再升高時(shí)，不加佐劑進(jìn)行最后一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天后頸動(dòng) 脈放血，室溫凝固2h后4'C過(guò)夜，8000r/min離心IO分鐘，除去血塊，提取血清。 1.4多克隆抗血清效價(jià)和特異性測(cè)定 1.4.1間接ELISA檢測(cè)多克隆抗血清效價(jià)
以10 u g/ml的DE-BSA按每孔100 n 1包被酶標(biāo)板，4'C包被24 h，洗滌5次，拍干， 每孔加入200lU2X的牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液(封閉液)，4'C下封閉12h，洗滌3次， 拍干。加入不同稀釋倍數(shù)的抗血清100iU， 37。C孵育2h，洗滌三次，立即加入lOOiU酶標(biāo)
6羊抗兔抗體，37。C孵育30min，洗滌三次，加50p 1顯色劑A液和50u 1顯色劑B液，室 溫避光作用15min，加50ul終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值(450nm)。同時(shí)設(shè)置陰性 血清對(duì)照孔和平行重復(fù)孔?？寡逡訧OOO倍、5000倍、10000倍、50000倍、100000倍、 1000000倍稀釋。以兩倍于陰性血清OD值的抗血清OD值對(duì)應(yīng)的抗血清稀釋度為抗血清 效價(jià)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表-1
表-l抗血清效價(jià)檢測(cè)結(jié)果(平均OD值)
血清稀 釋倍數(shù)1000500010000500001000001000000陰性血清空白
OD值3.5822.8672.3741.8751.3390.3890.1370.048
據(jù)上表數(shù)據(jù)可以確定抗血清效價(jià)為1000000以上，滿足實(shí)驗(yàn)要求。
1.4.2間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抗血清特異性
ELISA操作方法同1.4.1。每孔加入100ul不同濃度的游離雙烯雌酚與包被物競(jìng)爭(zhēng)隨 后加入抗血清，得出不同的OD值。根據(jù)1.4.1的結(jié)果，所用抗血清最佳濃度為1 : 50000。 雙烯雌酚系列濃度和試驗(yàn)孔的排列順序見(jiàn)表一2，同時(shí)設(shè)置平行重復(fù)孔和空白對(duì)照孔。以0 抑制孔的OD值為最大值Bq,其它抑制濃度孔OD值為B， B/Bo^50。/。時(shí)對(duì)應(yīng)的雙烯雌酚 濃度為此抗體的IC5c值。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表-2
表-2抗血清特異性檢測(cè)結(jié)果(OD平均值)
抑制濃度01392781空白對(duì)照
ng/ml
雙烯雌酚1.5471.3841.0450.7280.4320.2040.053
己烯雌酚1.5181.5091.4671.4551.4281.4750.06
己垸雌酚1.4031.3681.4141.4161.4751.3560.047
由表中數(shù)據(jù)可知，雙烯雌酚抗血清ICso值在0.9 ng/ml左右，其它幾個(gè)類似物的IC50 值在所試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)未見(jiàn)明顯抑制，此范圍內(nèi)，幾乎沒(méi)有交叉反應(yīng)性，表明此抗血清 特異性較好。
1.5抗體提純
抗血清加等量生理鹽水混合，加入等體積飽和硫酸銨溶液，緩慢攪拌，4'C沉淀過(guò)夜， 離心，沉淀用生理鹽水重懸，再用33%飽和硫酸銨溶液沉淀兩次，沉淀物用磷酸鹽緩沖液 溶解，過(guò)SephdexG-25M凝膠柱，除去硫酸銨，即得本發(fā)明所述的雙烯雌酚特異性多克隆抗體，加等量甘油，-201:保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2直接競(jìng)爭(zhēng)免疫檢測(cè)方法的建立
2.1棋盤(pán)法確定直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA最佳反應(yīng)濃度
將1000u g/ml、 lOOti g/ml、 10u g/ml、 5 P g/ml、 1 u g/ml、 0.25 u g/ml系列濃度的雙 烯雌酚抗體按每孔100ul包被酶標(biāo)板，4-C包被過(guò)夜，洗滌3次，拍干，按每孔200yl封 閉液4。C下封閉過(guò)夜，洗滌3次，拍干。加入從l :200開(kāi)始倍比稀釋的酶標(biāo)雙烯雌酚，室 溫作用30分鐘。甩出孔中液體，每孔加入200ul洗滌液，30秒后甩出洗液，如此重復(fù)操 作共洗板4次，在吸水紙上拍干。加50yl顯色劑A液和50iU顯色劑B液，室溫避光作 用10min， 50nl終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值(450nm)。同時(shí)設(shè)置兩個(gè)平行，取 OD值為1.5左右時(shí)的包被濃度為最佳濃度。試驗(yàn)數(shù)據(jù)列于表一4。
表一4最佳反應(yīng)濃度結(jié)果表
酶標(biāo)物倍^^\^1000簡(jiǎn)1052.510.25空白
l : 5002.9951.8891.7261.6951.4211.1560.7260.056
i : iooo2.0541.7761.6571.5781.3811.1260.6950.057
i : 20001.8961.6961.5631.5041.251l惡0.6160.049
i : 40001.6751.5011.3461.2751.1320.9360.4660細(xì)
1 80001.3991.2871.1861.0781.0210.8560.1360.052
由表一4的數(shù)據(jù)中可以確定，最佳抗體包被濃度為5ug/ml，酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)l : 2000 達(dá)到最佳反應(yīng)濃度。
2.2建立標(biāo)準(zhǔn)曲線
ELISA操作方法同2.1 ，最佳抗體包被濃度為5 y g/ml，雙烯雌酚辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)物 稀釋倍數(shù)1 : 2000，準(zhǔn)備0ng/L、 lug/L、 3lig/L、 9ug/L、 27"g/L、 81ng/L 系列濃度的游離雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品。每孔加入100iU標(biāo)準(zhǔn)品，隨后加入50iU雙烯雌酚辣根 過(guò)氧化物酶標(biāo)記物工作液，室溫反應(yīng)30分鐘。甩出孔中液體，每孔加入200ul洗滌液， 30秒后甩出洗液，如此重復(fù)操作共洗板4次，在吸水紙上拍干。加50 lU顯色劑A液和50 U 1顯色劑B液，室溫避光作用10min，加入50ul終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀數(shù)。檢測(cè)結(jié) 果見(jiàn)表-5:_表-5:標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果_
雙烯雌酚的抑0 1 3 9 27 81
制濃度"g/
OD值_1.541 1.353 1.126 0.836 0.523 0.279
根據(jù)表中數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線見(jiàn)附圖1，結(jié)果表明，本發(fā)明制備的雙烯雌酚ELISA 直接競(jìng)爭(zhēng)法IC5Q值在9yg/L左右，靈敏度達(dá)到lug/L左右。
實(shí)施例3檢測(cè)雙烯雌酚的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建
組建檢測(cè)雙烯雌酚的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分
(1) 包被有雙烯雌酚抗體的酶標(biāo)板-,
(2) 雙烯雌酚辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物工作液；
(3) 雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分另U為Oug/L、 lug/L、 3yg/L、 9ng/L、 27yg/L、 81ug/:L;
(4) 顯色劑A，包含底物過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，顯色劑B包含供氫體四甲基聯(lián)苯胺或 鄰苯二胺；
(6) 濃縮洗滌液為含0.5%吐溫-20的IO倍的磷酸鹽緩沖液，使用時(shí)10倍稀釋?xiě)?yīng)用；
(7) 濃縮樣品稀釋液為0.1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，使用時(shí)10倍稀釋?xiě)?yīng)用； (9)終止液為2mol/L的硫酸溶液。
實(shí)驗(yàn)例4試劑盒的回收率試驗(yàn)
以牛奶為基質(zhì)，在牛奶中添加雙烯雌酚，濃度分別為1 g / L、 27 y g / L、 81 P g / L， 作為樣品。實(shí)驗(yàn)時(shí)，每孔加入100lU上述配好的樣品，隨后加入50lU雙烯雌酚辣根過(guò)氧 化物酶標(biāo)記物工作液，室溫孵育30分鐘。甩出孔中液體，每孔加入200 u 1經(jīng)10倍稀釋了 的洗滌液，30秒后甩出洗液，如此重復(fù)操作共洗板4次，在吸水紙上拍干。加50nl顯色 劑A液和50ii 1顯色劑B液，室溫避光作用10min，每孔加入50 U 1終止液(2mo1 / L硫酸)， 輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算回收 率。
表-6直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果
9添加量重復(fù)OD平均值 對(duì)應(yīng)濃度 回收率(％) 變異系數(shù) ng/ml
1 4 1.301 0.16 27 4 0.519 1.27 81_4 0.249_6.09
結(jié)果表明飼料中的添加回收率為80% —106%。
實(shí)驗(yàn)例5試劑盒保存期試驗(yàn)
試劑盒保存條件為2-8。C，經(jīng)過(guò)12個(gè)月的測(cè)定，試劑盒的最大吸光度值(零添加)、 50%抑制濃度、雙烯雌酚添加實(shí)際測(cè)定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運(yùn)輸和使用過(guò)程中， 會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37'C保存條件下放置兩周，進(jìn)行破壞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表 明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2 — 8"C保存12個(gè)月 以上。
實(shí)施例6樣品中雙烯雌酚殘留的檢測(cè)
6.1、 樣品前處理
準(zhǔn)確稱取5g魚(yú)肉樣品于40ml離心管中，研磨成粥狀，加入20mlDMSO振蕩1小時(shí)， 離心取上清，用樣品稀釋液稀釋，制備樣品溶液。
6.2、 用試劑盒進(jìn)行檢測(cè) 向包被有雙烯雌酚抗體的酶標(biāo)板微孔中加系列標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液100lU，再加入雙烯
雌酚酶標(biāo)記物工作液50ul，室溫反應(yīng)30分鐘。甩出孔中液體，每孔加入200ul經(jīng)10倍 稀釋了的洗滌液，30秒后甩出洗液，如此重復(fù)操作共洗板4次，在吸水紙上拍干。加50 y 1顯色劑A液和50 y 1顯色劑B液，室溫避光作用10min，每孔加入終止液(2mo1 / L硫酸)50 lU，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值(OD值)。 結(jié)果分析
計(jì)算百分吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品中雙烯雌酚的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn) 曲線上讀出，也可以用回歸方程法計(jì)算出在樣本中雙烯雌酚的含量。利用專業(yè)電腦軟件更 便于大量的樣本的快速分析。根據(jù)酶標(biāo)板上的樣本顏色的深淺與系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色的
106%
98%
82%
1.36% 1.02% 0.98%比較，可以判斷出樣本中雙烯雌酚的濃度范圍,
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)雙烯雌酚的直接競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫試劑盒，其中包括雙烯雌酚特異性抗體、包被 有雙烯雌酚特異性抗體的酶標(biāo)板、雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品和雙烯雌酚辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物及工作液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括包被有雙烯雌酚特異性抗體的酶標(biāo)板、雙烯雌酚辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物工作液、雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色劑A液和顯色劑B液、洗滌液、終止液、濃縮樣品稀釋液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述雙烯雌酚特異性抗體為多克隆抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)記雙烯雌酚所用的酶為辣根過(guò)氧化物酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記雙烯雌酚，所述標(biāo)記方法為琥珀酸酐法。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的洗滌液為含有0. 05% —O. 5%吐溫—20磷酸鹽緩沖液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的顯色劑A含有底物過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，顯色劑B含有供氫體四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的濃縮樣品稀釋液為含O. 1%吐溫一20的10倍磷酸鹽緩沖液。
9. 一種檢測(cè)樣品中雙烯雌酚含量的方法，包括步驟(1) 樣品前處理；(2) 用權(quán)利要求l一8項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，向包被有雙烯雌酚抗體的酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，再加入雙烯雌酚辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物工作液，室溫溫育30分鐘。甩出孔中液體，每孔加入200wl洗滌液，30秒后甩出洗液，如此重復(fù)操作共洗板4次，在吸水紙上拍干。加顯色劑A液和顯色劑B液，室溫溫育10分鐘、加入50ul終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值；(3) 分析檢測(cè)結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)雙烯雌酚的直接競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明所提供的雙烯雌酚的酶聯(lián)免疫試劑盒包括雙烯雌酚特異性抗體、包被有雙烯雌酚特異性抗體的酶標(biāo)板、雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品和雙烯雌酚辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物及工作液。本發(fā)明的檢測(cè)雙烯雌酚的酶聯(lián)免疫試劑盒靈敏、快速、準(zhǔn)確，主要用于大批樣品的篩查；盒中的主要試劑均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏性、高精確性、高準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，可快速檢測(cè)飼料及畜產(chǎn)品中殘留的雙烯雌酚。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101672846SQ20091017791
公開(kāi)日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2009年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月19日
發(fā)明者于洪俠, 張薇薇, 平 李, 楊曙明, 靜 邱, 剛 陳 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所