專利名稱：大腸桿菌o157:h7鼠血清抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大腸桿菌0157:H7鼠血清抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條，屬于抗體檢測(cè)試劑盒技術(shù)域。專用于鼠血清中大腸桿菌0157:H7抗體的快速檢測(cè)，適用于動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)、食品生產(chǎn)企業(yè)等地區(qū)調(diào)査與追溯鼠0157:H7感染狀況時(shí)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)以及在開(kāi)展食品安全環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)使用。
二背景技術(shù)：
大腸桿菌(￡sc/jen'cWa co/,', ￡. co/!') 0157:H7是一種重要的人獸共患病原微生物，人感染0157:H7可患腹瀉、出血性結(jié)腸炎(HC)、溶血性尿毒綜合征(HUS)及血栓性血小板減少紫癜(TTP)等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡(夏興霞，劉潔，王永山，諸玉梅，歐陽(yáng)偉，何孔旺，張雪寒.動(dòng)物源性人獸共患細(xì)菌病防控生物新制劑的研究I.分泌抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009,25(2):291-295)。 1982年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)，在此后的20多年中，由0157:H7所致的疾病在全世界范圍內(nèi)都有散發(fā)和暴發(fā)，1996年曾在日本暴發(fā)流行。2001年，在中國(guó)江蘇、安徽等地也發(fā)生了多次食源性感染0157:H7事件，導(dǎo)致177人死亡，弓l起了全社會(huì)的廣泛關(guān)注。0157:H7的感染因具有暴發(fā)流行趨勢(shì)、強(qiáng)烈的致病性與致死性以及抗生素治療可能會(huì)加劇病情等特點(diǎn)，已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，世界衛(wèi)生組織已將0157:H7列為新的食源性病原菌。
食源性以及與帶菌動(dòng)物接觸是人感染0157:H7的主要途徑，反芻動(dòng)物是0157:H7的主要宿主，陽(yáng)性率0.1%~16%，此外，從鵝、雞、馬、鹿、海鷗、綿羊、山羊、鴿子、鴨、兔、狗、貓的糞便中也可分離到0157:H7。鼠與食品生產(chǎn)和人類生活關(guān)系密切，在疫病傳播中起重要作用，對(duì)食品安全和人類健康威脅極大，但至今缺乏有關(guān)鼠感染0157:H7的狀況及其流行病學(xué)意義的研究資料。
本發(fā)明基于我國(guó)食品安全的嚴(yán)峻形勢(shì)和對(duì)快速檢測(cè)試劑盒的迫切需求，運(yùn)用膠體金免疫層析技術(shù)，制備鼠血清0157:H7抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條，為監(jiān)測(cè)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)、食品生產(chǎn)企業(yè)等地區(qū)鼠0157:H7的感染狀況提供簡(jiǎn)便快速的抗體檢測(cè)方法，為開(kāi)展0157:H7流行病學(xué)追溯、調(diào)査以及食品安全環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支撐。
三、 發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明針對(duì)當(dāng)前我國(guó)部分動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)、食品生產(chǎn)企業(yè)等地區(qū)鼠較多的環(huán)境現(xiàn)狀，研制一種簡(jiǎn)便、快速、并適合于現(xiàn)場(chǎng)使用的監(jiān)測(cè)鼠大腸桿菌0157:H7抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條，用于0157:H7流行病學(xué)調(diào)査、追溯以及食品安全環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。
技術(shù)方案本發(fā)明的具體實(shí)施方案如下
一種大腸桿菌(￡ ^en'c/i/aco/!、 ￡. co/f) 0157:H7鼠血清抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條，由顆粒為20nm的膠體金溶液標(biāo)記純化的羊抗鼠IgG制成膠體金墊、分別用0157:H7抗原和純化的鼠血清IgG包被的硝酸纖維素膜作為檢測(cè)線和質(zhì)控線、玻璃纖維素膜制成的樣品吸收墊、吸水濾紙制成的吸收墊組裝成的檢測(cè)試紙條、陽(yáng)性血清、陰性血清、血清樣品稀釋液和試紙條使用說(shuō)明書(shū)組成。上述檢測(cè)試紙條，其制備方法為
1) 大腸桿菌0157:H7抗原的制備
培養(yǎng)大腸桿菌0157:H7， 3500 r/min離心30min，用PBS重懸，0.5%甲醛滅活，PBS洗3次，沉淀重懸于PBS， -20(>(:凍存?zhèn)溆茫?br> 2) 免疫膠體金的制備
取20nm顆粒膠體金溶液(在波長(zhǎng)521nm時(shí)的光吸收值為1.847， 4521 =1.847)20ml，在磁力攪拌(200 r/min)下緩慢加入已純化的羊抗鼠IgG，在室溫下攪拌30min，加質(zhì)量體積比10%牛血清白蛋白BSA使其終濃度為質(zhì)量體積比0.4%，室溫?cái)嚢?min，加質(zhì)量體積比10% PEG使PEG終濃度為質(zhì)量體積比0.2。/。，室溫?cái)嚢?min; 12000 r/min離心45min,吸取離心上清，沉淀溶于2ml保存液中，用0.45拜濾膜過(guò)濾，置4。C保存?zhèn)溆?，制得膠體金標(biāo)記抗體原液；
3) 金標(biāo)抗體玻璃纖維素膜的制備
取膠體金標(biāo)記抗體原液lml，加入工作液2ml稀釋，混勻，均勻地加在玻璃纖維素膜上，制成金標(biāo)抗體玻璃纖維素膜，即膠體金墊，37'C干燥，4'C保存?zhèn)溆茫?br> 4) 固相硝酸纖維素膜NC的制備
用0.01M pH7.2的PBS分別稀釋大腸桿菌0157:H7抗原和純化的鼠血清IgG，用蛋白濃度為2.0 mg/ml大腸桿菌0157:H7抗原和純化的鼠血清IgG點(diǎn)樣于NC膜上分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，室溫干燥，封閉，層析試驗(yàn)背景清晰；
5) 試紙條的組裝
在寬2X長(zhǎng)9cmPVC底板上(1)，中間段粘貼寬2X長(zhǎng)3cm固相硝酸纖維素膜，即NC膜(2);靠近固相纖維素膜檢測(cè)線T線一端的PVC底板表面粘貼2X2cm的膠體金-羊抗鼠IgG抗體結(jié)合物玻璃纖維膜(5)，此玻璃纖維素膜與NC膜(2)重疊O.lcm，另一端與2Xlcm的樣品吸收墊(7)重疊0.2 11;靠近固相纖維素膜質(zhì)控線C線一端的PVC底板表面黏貼2X3.5cm的吸水紙(6)，與NC膜重疊O.lcm;抗體固相硝酸纖維素膜NC膜(2)上劃有一條大腸桿菌0157:H7抗原檢測(cè)線T線(3)和一條鼠血清IgG質(zhì)控線C線(4)。
T線劃在長(zhǎng)3cmX寬2cm NC膜一側(cè)lcm的位置上，將濃度為2.0mg/mL的大腸桿菌0157:H7抗原裝入劃膜機(jī)，噴涂于NC膜上，另一噴頭劃質(zhì)控線C線，濃度為2.0mg/mL的鼠血清IgG， C線劃在NC膜另一側(cè)lcm的位置上，檢測(cè)線與質(zhì)控線的距離為lcm,點(diǎn)樣量均為5pl噴在硝酸纖維膜上，組裝好的紙板按縱向剪切，裁成寬度為2.5mm的條狀，即為抗體檢測(cè)試紙條成品。
上述檢測(cè)試紙條的用法，其特征在于在檢測(cè)抗體時(shí)，將待檢鼠血清樣本用含多聯(lián)菌免疫兔血清的樣品稀釋液稀釋100倍，取200^滴加于試紙條的反應(yīng)區(qū)，若在檢測(cè)線處和質(zhì)控線處均出現(xiàn)紅色條帶，表明待檢血清樣本中含有大腸桿菌0157:H7抗體，判為陽(yáng)性；若僅在質(zhì)控線處出現(xiàn)紅色條帶，表明待檢樣品中不含大腸桿菌0157:H7抗體，則判為陰性；若質(zhì)控線不出現(xiàn)紅色條帶，不論檢測(cè)線是否出現(xiàn)紅色條帶，均表示實(shí)驗(yàn)失敗或試紙條失效。
上述檢測(cè)試紙條的用法中，使用含體積比2X多聯(lián)菌免疫兔血清的0.01M pH7.2的PBS溶液稀釋受試鼠血清樣本。
有益效果本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)如下
大腸桿菌0157:H7是一種經(jīng)食源傳播和感染的病原菌，建立快速、敏感、特異的檢測(cè)試劑是防控該病的重要措施之一。目前，國(guó)內(nèi)外研制的檢測(cè)試劑均以檢測(cè)抗原或核酸為基礎(chǔ)，尚缺乏抗體檢測(cè)方法。
本發(fā)明針對(duì)當(dāng)前我國(guó)食品衛(wèi)生安全的主要問(wèn)題和對(duì)快速檢測(cè)試劑盒的迫切需求，運(yùn)用先進(jìn)的膠體金免疫層析技術(shù)，建立了大腸桿菌0157:H7鼠血清抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條，該試紙條使用簡(jiǎn)便、快速、特異、敏感、實(shí)用，10分鐘內(nèi)即可獲得結(jié)果，在0157:H7流行病學(xué)調(diào)査、追溯以及食品安全環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
四

圖l膠體金免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)
l.PVC底板；2.硝酸纖維素膜(NC膜)；3.檢測(cè)線；4.質(zhì)控線5.膠體金墊；6.吸收墊(吸水濾紙)；7.樣品吸收墊(玻璃纖維素膜)
圖2膠體金免疫層析試紙條結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)圖3.試紙條的檢測(cè)結(jié)果
l.水；2.陰性鼠血清；3.陽(yáng)性鼠血清
圖4.試紙條的敏感性檢測(cè)結(jié)果
1.陰性對(duì)照；2-7.分別為陽(yáng)性鼠血清稀釋度為1:1X1(^ 1:1X102
五具體實(shí)施方式
1實(shí)驗(yàn)材料
玻璃纖維素膜、硝酸纖維素(NC)膜和20nm顆粒膠體金溶液(在波長(zhǎng)521nm時(shí)的光吸收值為1.847， J521 =1.847)購(gòu)自上海捷寧生物科技有限公司；
純化的鼠血清IgG系用硫酸酸銨鹽析和DEAE纖維素方法(劉玉斌，茍仕金主編.動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù).長(zhǎng)春吉林科學(xué)技術(shù)出版社，1989， 8-15)從鼠血清中提??；
純化羊抗鼠IgG系用純化的鼠血清IgG注射免疫山羊4次后，制備免疫血清，進(jìn)一步用硫酸酸銨鹽析和DEAE纖維素方法純化；
多聯(lián)菌免疫兔血清系用腸炎沙門(mén)氏菌(&/mo"e//a e"feWcfl )、大腸桿菌(Esc/ie/vc/Ka co") K88、 K99、 0159、 0141、 TOPIO、 B121、 BJ5183和豬鏈球菌(S/r印tococc"sj"&) SS-1混合抗原(所述菌株均購(gòu)自南京天邦生物科技有限公司)，注射免疫4次后的兔血清；
50份0157:H7免疫鼠血清(陽(yáng)性血清)系用0157:H7免疫BALB/c小鼠方法制備；20份陰性血清采自清潔級(jí)小鼠。以上動(dòng)物均購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。2大腸桿菌0157:H7抗原的制備
大量培養(yǎng)大腸桿菌0157:H7500mL， 3500 r/min離心30min，用PBS重懸，0.5%甲醛滅活，PBS洗3次，沉淀重懸于PBS， -20°(:凍存?zhèn)溆?夏興霞，劉潔，王永山，諸玉梅，歐陽(yáng)偉，何孔旺，張雪寒.動(dòng)物源性人獸共患細(xì)菌病防控生物新制劑的研究I.分泌抗大腸桿菌0157:H7單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009,25(2):291-295)。
3免疫膠體金的制備
3.1膠體金標(biāo)記的最佳pH測(cè)定
取lmg/mL羊抗鼠3pL,分別加入100 ^LpH值為7.0、 8.0、 9.0、 10.0的膠體金中，混勻，室溫下放置10 15min;再分別加入10。/。NaCl溶液2(HiL，混勻，靜置2h后觀察結(jié)果，確定金標(biāo)記最適pH值。當(dāng)膠體金pH值為7.0、 8.0、 9.0、 10.0時(shí)，免疫膠體金溶液穩(wěn)定，顏色鮮艷，膠體金標(biāo)記蛋白時(shí)pH值為7.0 (步驟3.3中用到的標(biāo)記最適PH)。
3.2最適標(biāo)記蛋白濃度的測(cè)定
取10支試管，各加入l.Oml膠體金溶液。將羊抗鼠IgG用0.01M PB pH7.2分別稀釋成50pg/ml、 45ng/ml、 40pg/ml、 35ng/ml、 30pg/ml、 25ng/ml、 20pg/ml、 15ng/ml、10ng/ml，各取l.Oml按順序加入上述膠體金溶液中。對(duì)照管加入lml稀釋液(不含蛋白質(zhì))，混勻。放置5min后，在上述每試管中加入10%氯化鈉水溶液0.1ml?；靹蚴覝仂o置1 2小時(shí)，觀察結(jié)果。穩(wěn)定膠體金的最小蛋白用量為25ng/ml。在此基礎(chǔ)上再增加10% 20%即為待標(biāo)記蛋白的實(shí)際用量，本試驗(yàn)所用的蛋白量為27.5ng/ml (步驟3.3用到的標(biāo)記最適蛋白濃度)。
3.3膠體金的標(biāo)記
取20nm顆粒膠體金溶液20ml，在磁力攪拌下緩慢加入已純化的羊抗鼠IgG，在室溫下攪拌30min。力n 10% BSA使其終濃度為0.4%，室溫?cái)嚢?min。力tl 10% PEG使其終濃度為0.2%，室溫?cái)嚢?min。 12000 r/min離心45min，小心吸取離心上清，沉淀溶于2ml保存液中(保存液配制方法O.lg四硼酸鈉、0.25g BSA、 0.025g NaN3加水溶解后用6N HC1調(diào)pH至7.4，補(bǔ)水至250ml，用0.45nm濾膜過(guò)濾后，4'C保存)，用0.45阿濾膜過(guò)濾，置4'C保存?zhèn)溆谩?br> 4大腸桿菌0157:H7抗體膠體金免疫層析試紙條的制備
4.1金標(biāo)抗體玻璃纖維素膜的制備
取金標(biāo)抗體原液lml，加入工作液2ml稀釋(工作液配制方法6.1gNa2HP04.12H20、 8.5gNaCl、 5.0gPVP40、 2.1g硼酸、1.0gPEG4000、 0.5gBSA加水溶解后用6N HC1調(diào)pH至7.4，補(bǔ)水至1000ml，用0.45卿濾膜過(guò)濾后，4'C保存)，混勻，均勻的加在玻璃纖維素膜上，制成金標(biāo)抗體玻璃纖維素膜(膠體金墊)，37'C干燥，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 4.2固相硝酸纖維素膜(NC)的制備
用0.01M pH7.2的PBS分別稀釋大腸桿菌0157:H7抗原和純化的鼠血清IgG，以不同的蛋白濃度點(diǎn)樣于NC膜上分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，在檢測(cè)線的一端做好標(biāo)記，室溫干燥。以0157:H7免疫鼠血清為檢測(cè)樣品進(jìn)行層析試驗(yàn)，觀察顯色情況，優(yōu)化點(diǎn)樣蛋白濃度。用蛋白濃度為2.0 mg/ml大腸桿菌0157:H7抗原和純化的鼠血清IgG點(diǎn)樣f NC膜上分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，室溫干燥，封閉，層析試驗(yàn)背景清晰。
4.3試紙條的組裝
如圖1所示，在約寬2X長(zhǎng)9 cm PVC底板上(1)，中間段粘貼寬2X長(zhǎng)3cm固相硝酸纖維素膜(NC膜2);靠近固相纖維素膜檢測(cè)線(T線) 一端的PVC底板表面粘貼2X2cm的膠體金-羊抗鼠IgG抗體結(jié)合物玻璃纖維膜(5)，此玻璃纖維素膜與NC膜(2)重疊0.1cm，另一端與2Xlcm的樣品吸收墊(7)重疊0.2cm;靠近固相纖維素膜質(zhì)控線(C線) 一端的PVC底板表面黏貼2X3.5cm的吸水紙(6)，與NC膜重疊O.lcm;抗體固相硝酸纖維素膜(NC膜2)上劃有一條大腸桿菌0157:H7抗原檢測(cè)線T線(3)和一條鼠血清IgG質(zhì)控線C線(4)。
T線劃在長(zhǎng)3cmX寬2cm NC膜一側(cè)lcm的位置上，將濃度為2.0mg/mL的大腸桿菌0157:H7抗原裝入劃膜機(jī)，噴涂于NC膜上，另一噴頭劃質(zhì)控線C線，濃度為2.0mg/mL的鼠血清IgG， C線劃在NC膜另一側(cè)lcm的位置上，檢測(cè)線與質(zhì)控線的距離為lcm，點(diǎn)樣量均為5pl噴在硝酸纖維膜上。組裝好的紙板按縱向剪切，裁成寬度為2.5皿的條狀，即為抗體檢測(cè)試紙條成品。
4.4試紙條的使用
在抗體檢測(cè)時(shí)，將待檢鼠血清樣本用含2%多聯(lián)菌免疫兔血清的0.01M PBS pH7.2溶液進(jìn)行1:100稀釋，取200nl滴加于試紙條的反應(yīng)區(qū)，若在檢測(cè)線處和質(zhì)控線處均出現(xiàn)紅色條帶，表明待檢樣品中含有大腸桿菌0157:H7抗體，判為陽(yáng)性；若僅在質(zhì)控線處出現(xiàn)紅色條帶，表明待檢樣品中不含大腸桿菌0157:H7抗體，則判為陰性；若質(zhì)控線不出現(xiàn)紅色條帶，不論檢測(cè)線是否出現(xiàn)紅色條帶，均表示實(shí)驗(yàn)失敗或試紙條失效(圖2)。用組裝成的試紙條分別檢測(cè)0157:H7陽(yáng)性鼠血清、陰性鼠血清和水三種檢測(cè)樣品，只有0157:H7陽(yáng)性鼠血清樣品在檢測(cè)線處出現(xiàn)紅色條帶，結(jié)果清晰易辨(圖3)。
5膠體金免疫層析試紙條的特異性檢測(cè)
用試紙條檢測(cè)大腸桿菌0157:H7免疫鼠血清樣本，均為陽(yáng)性；檢測(cè)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌K88、 K99、 0159、 0141、 TOPIO、 BL21、 BJ5183和鏈球菌SS-1免疫的鼠血清、清潔級(jí)鼠血清以及純凈水，全部為陰性，表明本試紙條具有良好的特異性。
6膠體金免疫層析試紙條的敏感性檢測(cè)
將大腸桿菌0157:H7免疫鼠血清樣本從1:1 X 102對(duì)數(shù)倍比稀釋至1:1 X 107，將每一稀釋度取200nl分別點(diǎn)樣于膠體金免疫試紙條的點(diǎn)樣處，10min后觀察結(jié)果。同時(shí)用大腸桿菌0157:H7抗原包被的間接ELISA檢須ij，比較兩者的檢測(cè)結(jié)果。用試紙條檢測(cè)1:1乂102 1:1乂106稀釋度的0157:H7免疫鼠血清，在檢測(cè)線與質(zhì)控線處均出現(xiàn)紅色條帶，表明抗體檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；而1:1乂107稀釋度的血清，僅在質(zhì)控線處出現(xiàn)明顯的紅色條帶，表明抗體檢測(cè)結(jié)果為陰性，與陰性對(duì)照相同(圖4)。在ELISA平行對(duì)照檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，陽(yáng)性鼠血清的效價(jià)為1X105，與膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)方法的敏感度相當(dāng)。本試紙條操作簡(jiǎn)便、快速、IO分鐘內(nèi)可獲得結(jié)果；而用ELISA檢測(cè)，從加入待檢血清到判定結(jié)果至少需2小時(shí)。7膠體金免疫層析試紙條的穩(wěn)定性檢測(cè)
將試紙條置于干燥器內(nèi)，4'C密封干燥保存，每隔30d抽取一批，與新制備的試紙條平行檢測(cè)陽(yáng)性和陰性鼠血清樣本，比較兩者的檢測(cè)結(jié)果。膠體金試紙條在4'C干燥保存6個(gè)月后，與新制備的試紙條對(duì)比檢測(cè)陽(yáng)性和陰性鼠血清，特異性和敏感性均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)降低，說(shuō)明本試紙條具有良好的穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1、一種大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)O157:H7鼠血清抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條，由顆粒為20nm的膠體金溶液標(biāo)記純化的羊抗鼠IgG制成膠體金墊、分別用O157:H7抗原和純化的鼠血清IgG包被的硝酸纖維素膜作為檢測(cè)線和質(zhì)控線、玻璃纖維素膜制成的樣品吸收墊、吸水濾紙制成的吸收墊組裝成的檢測(cè)試紙條、陽(yáng)性血清、陰性血清、血清樣品稀釋液和試紙條使用說(shuō)明書(shū)組成。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試紙條，其制備方法為1) 大腸桿菌0157:H7抗原的制備培養(yǎng)大腸桿菌0157:H7， 3500 r/min離心30min，用PBS重懸，0.5%甲醛滅活， PBS洗3次，沉淀重懸于PBS， .20'C凍存?zhèn)溆茫?) 免疫膠體金的制備取20nm顆粒膠體金溶液，加入已純化的羊抗鼠IgG，在室溫下攪拌30min，加 質(zhì)量體積比10°/。牛血清白蛋白BSA使其終濃度為質(zhì)量體積比0.4%，室溫?cái)嚢?min, 加質(zhì)量體積比10。/。PEG使PEG終濃度為質(zhì)量體積比0.2。/。，室溫?cái)嚢?min; 12000 r/min 離心45min，吸取離心上清，沉淀溶于2ml保存液中，用0.45nm濾膜過(guò)濾，置4'C保 存?zhèn)溆?，制得膠體金標(biāo)記抗體原液；3) 金標(biāo)抗體玻璃纖維素膜的制備取膠體金標(biāo)記抗體原液lml，加入工作液2ml稀釋，混勻，均勻地加在玻璃纖維 素膜上，制成金標(biāo)抗體玻璃纖維素膜，即膠體金墊，37'C干燥，4。C保存?zhèn)溆茫?) 固相硝酸纖維素膜NC的制備用0.01M pH7.2的PBS分別稀釋大腸桿菌0157:H7抗原和純化的鼠血清IgG， 用蛋白濃度為2.0 mg/ml大腸桿菌0157:H7抗原和純化的鼠血清IgG點(diǎn)樣于NC膜上 分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，室溫干燥，封閉，層析試驗(yàn)背景清晰；5) 試紙條的組裝在寬2X長(zhǎng)9cmPVC底板上(1)，中間段粘貼寬2X長(zhǎng)3cm固相硝酸纖維素膜， 即NC膜(2);靠近固相纖維素膜檢測(cè)線T線一端的PVC底板表面粘貼2X2cm的膠 體金-羊抗鼠IgG抗體結(jié)合物玻璃纖維膜(.5)，此玻璃纖維素膜與NC膜(2)重疊O.lcm, 另一端與2Xlcm的樣品吸收墊(7)重疊0.2cm;靠近固相纖維素膜質(zhì)控線C線一端 的PVC底板表面黏貼2X3.5cm的吸水紙(6)，與NC膜重疊0.1cm;抗體固相硝酸 纖維素膜NC膜(2)上劃有一條大腸桿菌0157:H7抗原檢測(cè)線T線(3)和一條鼠血 清IgG質(zhì)控線C線(4)。T線劃在長(zhǎng)3cmX寬2cm NC膜一側(cè)lcm的位置上，將濃度為2.0mg/mL的大腸 桿菌0157:H7抗原裝入劃膜機(jī)，噴涂于NC膜上，另一噴頭劃質(zhì)控線C線，濃度為 2.0mg/mL的鼠血清IgG, C線劃在NC膜另一側(cè)lcm的位置上，檢測(cè)線與質(zhì)控線的 距離為lcm，點(diǎn)樣量均為5pl噴在硝酸纖維膜上，組裝好的紙板按縱向剪切，裁成寬度為2.5mm的條狀，即為抗體檢測(cè)試紙條成品。
3、 權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)試紙條的用法，其特征在于 在檢測(cè)抗體時(shí)，將待檢鼠血清樣本用含多聯(lián)菌免疫兔血清的樣品稀釋液稀釋100倍，取200nl滴加于試紙條的反應(yīng)區(qū)，若在檢測(cè)線處和質(zhì)控線處均出現(xiàn)紅色條帶，表 明待檢血清樣本中含有大腸桿菌0157:H7抗體，判為陽(yáng)性；若僅在質(zhì)控線處出現(xiàn)紅色 條帶，表明待檢樣品中不含大腸桿菌0157:H7抗體，則判為陰性；若質(zhì)控線不出現(xiàn)紅 色條帶，不論檢測(cè)線是否出現(xiàn)紅色條帶，均表示實(shí)驗(yàn)失敗或試紙條失效。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述檢測(cè)試紙睪的用法，其特征在于使用含體積比2%多 聯(lián)菌免疫兔血清的0.01MpH7.2的PBS溶液稀釋受試鼠血清樣本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大腸桿菌O157:H7鼠血清抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條，屬于抗體檢測(cè)試劑盒技術(shù)領(lǐng)域。由顆粒為20nm的膠體金溶液標(biāo)記純化的羊抗鼠IgG制成膠體金墊、分別用大腸桿菌O157:H7抗原和純化的鼠血清IgG包被的硝酸纖維素膜作為檢測(cè)線和質(zhì)控線、玻璃纖維素膜制成的樣品吸收墊、吸水濾紙制成的吸收墊組裝成的檢測(cè)試紙條、陽(yáng)性血清、陰性血清、血清樣品稀釋液和試紙條使用說(shuō)明書(shū)組成。該試紙條使用簡(jiǎn)便、快速、敏感，10分鐘內(nèi)即可獲得檢測(cè)結(jié)果，適用于在動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)、食品生產(chǎn)企業(yè)等地區(qū)調(diào)查與追溯鼠O157:H7感染狀況時(shí)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)以及在開(kāi)展食品安全環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)使用。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101666799SQ200910181759
公開(kāi)日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2009年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月23日
發(fā)明者何孔旺, 潔 劉, 夏興霞, 張雪寒, 王永山, 費(fèi)榮梅 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院