專利名稱：一種利用光纖生物傳感器快速檢測(cè)乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用光纖生物傳感器快速檢測(cè)乳制品3 -內(nèi)酰胺酶的方法，屬于生物技術(shù) 領(lǐng)域。
技術(shù)背景"解抗劑"學(xué)名(3-內(nèi)酰胺酶，它是針對(duì)P-內(nèi)酰胺類抗生素提煉出來(lái)的一種化學(xué)品，是一種 抗生素分解劑，它能有效分解牛奶中殘留的抗生素。P-內(nèi)酰胺酶為我國(guó)不允許使用的食品添 加劑，該酶的使用掩蓋了牛奶中實(shí)際含有的抗生素。但是為了追求利益， 一些商販?zhǔn)褂盟鼇?lái) 降解掉牛乳中殘留的抗生素，生產(chǎn)所謂的"人造無(wú)抗奶"，致使抗生素酶解后的殘留物進(jìn)入乳 制品，對(duì)人體健康造成傷害，同時(shí)它也能夠使青霉素內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)破壞而失去活性，導(dǎo)致青霉 素、頭孢菌素等抗生素類藥物耐藥性增高，從而大大降低了人們抵抗傳染病的能力，給消費(fèi) 者的身體健康帶來(lái)危害。因此，迫切需要快速的檢測(cè)方法，從而能準(zhǔn)確的檢測(cè)乳制品中(3-內(nèi) 酰胺酶。目前，國(guó)內(nèi)常用的牛奶中的抗生素檢測(cè)主要依據(jù)GB方法進(jìn)行，此方法操作比較簡(jiǎn)便， 比較適合基層單位使用，但是存在著靈敏度較低、操作誤差較大等問(wèn)題，比如TTC顯色時(shí) 間的掌握和目測(cè)、菌種的保存和接種量等。也有相關(guān)機(jī)構(gòu)采用產(chǎn)生頭孢素法來(lái)檢測(cè)牛奶中的 卩-內(nèi)酰胺酶，這種方法靈敏度相對(duì)較高，但是能夠檢測(cè)的P-內(nèi)酰胺酶的類別比較少，實(shí)用性較差。生物傳感器是以生物化學(xué)和傳感技術(shù)為基礎(chǔ)，用酶、抗體、細(xì)胞等生物活性物質(zhì)作為分 子識(shí)別元件，配上信號(hào)轉(zhuǎn)換器和電子測(cè)量?jī)x所構(gòu)成的分析工具。生物傳感器具有準(zhǔn)確、靈敏、 易操作和可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)。其中光纖傳感器是一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備，抗腐蝕、抗電磁輻射和 電子頻率干擾，同時(shí)光纖低衰減率的高質(zhì)量傳輸可實(shí)現(xiàn)對(duì)危險(xiǎn)地區(qū)的遠(yuǎn)距離檢測(cè)。由于光纖 傳感器的上述特點(diǎn)，其在食品安全檢測(cè)控制領(lǐng)域的應(yīng)用有著廣闊的前景。利用生物傳感器，特別是光纖生物傳感器檢測(cè)乳制品中(3-內(nèi)酰胺酶的方法，還未見(jiàn)有此 類專利報(bào)道。本發(fā)明專利利用生物傳感器技術(shù)建立了一種快速檢測(cè)乳制品中P-內(nèi)酰胺酶方法。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供--種用于檢測(cè)p-內(nèi)酰胺酶的光纖生物傳感器。該傳感器是由光學(xué) 系統(tǒng)、電子學(xué)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)及控制與處理系統(tǒng)組成。所用的光纖材料為聚苯乙烯。 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種利用光纖生物傳感器檢測(cè)P-內(nèi)酰胺酶的方法，其檢測(cè)在光纖表面加上載有(3-內(nèi)酰胺酶抗體的生物敏感元件，當(dāng)倏逝波穿過(guò)生物敏感元件時(shí)，或產(chǎn)生光信號(hào)，或?qū)е沦渴挪ㄅc光纖內(nèi)傳播光線的強(qiáng)度、相位或頻率的改變，而測(cè)量這些變 化，即可獲得生物敏感元件上變化的信息。本發(fā)明所述的一種利用光纖生物傳感器檢測(cè)(3-內(nèi)酰胺酶的方法，具體包括以下歩驟所述的P-內(nèi)酰胺酶抗體制備取(3-內(nèi)酰胺酶100pg、卡介苗5mg，與等體積佛氏完全佐劑 研磨后注入6周齡雌性BALBPC小鼠腹腔，以后采用佛氏不完全佐劑，隔周腹腔注射5次，融 合前3天腹腔注射50 pgP-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，以50。/。PEG4000為融合劑，將小鼠脾細(xì)胞與NS1 細(xì)胞融合，IMDM2HAT選擇培養(yǎng)，2周后換HT培養(yǎng)液培養(yǎng)。以p-內(nèi)酰胺酶為抗原，經(jīng)間接ELISA 法篩選陽(yáng)性克隆后的雜交瘤細(xì)胞，所得細(xì)胞株繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。將陽(yáng)性細(xì)胞株注入BALBPC小 鼠腹腔，誘生腹水，用兔抗鼠免疫球蛋白及瓊脂雙擴(kuò)散法檢測(cè)(3-內(nèi)酰胺酶抗體；所述的抗體包被液為0.02 mol/L的Na2CO3和0.04 mol/L的NaHC03溶液，pH值為9.6;所述的稀釋液為0.5。/。的干酪素和0.01 mol/L的PBS， pH值為9.6;所述的清洗液為0.02mol/L磷酸鹽，0.05。/。的TritonX-100和0.1 g/L的NaN;， pH值為7.2; 所述P-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制取一定量的(3-內(nèi)酰胺酶，配制為濃度分別為0、 5、 10、 50、 100和200昭/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；所述包被抗體的制備用包被液將p-內(nèi)酰胺酶抗體稀釋至一定濃度并裝入毛細(xì)管中，將光纖插入4'C孵育12 16h,然后可用于相應(yīng)的免疫反應(yīng)。暫時(shí)不用時(shí)可置4。C保存；所述標(biāo)記抗體的制備將所測(cè)標(biāo)本的抗體用稀釋液稀釋到一定濃度，在堿性環(huán)境下與熒光素染料Cy5結(jié)合后，通過(guò)凝膠過(guò)濾分離到標(biāo)記了Cy5的單克隆抗體。所述抗體固定的制作通過(guò)三氨基丙基三乙基硅垸等硅垸類物質(zhì)將光纖表面硅垸化，然 后借助雙功能交聯(lián)劑戊二醛將標(biāo)記了Cy5的P-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體進(jìn)行固定。所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將標(biāo)記了Cy5的p-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體固定到活化器上，放入光纖 生物傳感器，取一定量的不同濃度的(3-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加到傳感器敏感膜上，再將傳感 器插入到系統(tǒng)接口中，按下測(cè)試鍵，響應(yīng)一段時(shí)間，約300s后，將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行顯示和保存。 記錄不同濃度的P-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液所對(duì)應(yīng)的光信號(hào)值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述乳制品中P-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)試時(shí)，可直接將經(jīng)過(guò)適當(dāng)預(yù)處理的樣品放 入光纖生物傳感器進(jìn)行測(cè)試，根據(jù)所測(cè)得的光信號(hào)，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出樣品中IB-內(nèi)酰 胺酶的濃度。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的積極效果(1) 本發(fā)明首次公開(kāi)了一種光纖生物傳感器，可用于檢測(cè)乳制品中的(3-內(nèi)酰胺酶；(2) 抗原-抗體特異性結(jié)合決定了該光纖生物傳感器的高靈敏度，不受其他干擾，降低了檢出下限，且該光纖傳感器具有抗電磁輻射、抗電子頻率千擾、抗腐蝕等優(yōu)點(diǎn)；(3) 體積小，方便攜帶，且所需檢測(cè)樣品少；(4) 使用熒光取代了放射性物質(zhì)，響應(yīng)時(shí)間快，易于操作和成本低廉。 具體實(shí)施例本發(fā)明的內(nèi)容可通過(guò)以下實(shí)施例作進(jìn)一歩詳細(xì)闡述，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例1卩-內(nèi)酰胺酶抗體制備取P-內(nèi)酰胺酶IOO pg、卡介苗5mg，與等體積佛氏完全佐劑研磨后注入6周齡雌性BALBPC 小鼠腹腔，以后采用佛氏不完全佐劑，隔周腹腔注射5次，融合前3天腹腔注射50路(3-內(nèi)酰胺 酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，以50% PEG4000為融合劑，將小鼠脾細(xì)胞與NS1細(xì)胞融合，IMDM2HAT選擇培 養(yǎng)，2周后換HT培養(yǎng)液培養(yǎng)。以(3-內(nèi)酰胺酶為抗原，經(jīng)間接EUSA法篩選陽(yáng)性克隆后的雜交瘤 細(xì)胞，所得細(xì)胞株繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。將陽(yáng)性細(xì)胞株注入BALBPC小鼠腹腔，誘生腹水，用兔抗 鼠免疫球蛋白及瓊脂雙擴(kuò)散法檢測(cè)(3-內(nèi)酰胺酶抗體，制備(3-內(nèi)酰胺酶抗體。實(shí)施例2(1) 包被抗體的制備用包被液將P-內(nèi)酰胺酶抗體稀釋至一定濃度并裝入毛細(xì)管中，將光纖插入4'C孵育12 16 h，然后可用于相應(yīng)的免疫反應(yīng)。暫時(shí)不用時(shí)可置4。C保存。(2) 標(biāo)記抗體的制備將所測(cè)標(biāo)本的抗體用稀釋液稀釋到一定濃度，在堿性環(huán)境下與熒光素染料Cy5結(jié)合后， 通過(guò)凝膠過(guò)濾分離到標(biāo)記了Cy5的單克隆抗體。(3) 抗體固定的制作通過(guò)三氨基丙基三乙基硅烷等硅垸類物質(zhì)將光纖表面硅烷化，然后借助雙功能交聯(lián)劑戊 二醛將標(biāo)記了Cy5的p-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體進(jìn)行固定。(4)具體實(shí)施方式
將標(biāo)記了Cy5的P-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體固定到活化器上，放入光纖生物傳感器，檢測(cè)時(shí)， 取一定量預(yù)處理好的樣品或(3-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加到傳感器敏感膜上，再將傳感器插入到 系統(tǒng)接口中，按下測(cè)試鍵，響應(yīng)一段時(shí)間后，將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行顯示和保存。記錄不同樣品溶 液所對(duì)應(yīng)的光信號(hào)值。實(shí)施例3(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取一定量的不同濃度的P-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加到傳感器敏感膜上，再將傳感器插入到系統(tǒng)接口中，按下測(cè)試鍵，響應(yīng)一段時(shí)間，約300 s后，將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行顯示和保存。記錄不 同濃度的P-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液所對(duì)應(yīng)的光信號(hào)值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (2)樣品的預(yù)處理及檢測(cè)稱取不含p-內(nèi)酰胺酶的奶粉1 g，加入5倍體積DMSO振蕩1 h，離心取上清液2 pl。向 上述清液中添加終濃度為50嗎/L的P-內(nèi)酰胺酶，稀釋IO倍作為檢測(cè)對(duì)照樣品，利用光纖生 物傳感器進(jìn)行測(cè)試。取20ul的樣品，滴加到光纖傳感器的敏感膜上，再將傳感器插入到系統(tǒng)接口中，按下測(cè) 試鍵，響應(yīng)一段時(shí)間，等待數(shù)據(jù)穩(wěn)定，約300 s后，讀取所測(cè)計(jì)算機(jī)所顯示的信號(hào)的強(qiáng)度，對(duì) 照所作的(3-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣品溶液(3-內(nèi)酰胺酶的含量，乘以樣品稀釋倍數(shù)10倍， 得出所測(cè)樣品中(3-內(nèi)酰胺酶的含量。
權(quán)利要求
1.一種利用光纖生物傳感器快速檢測(cè)乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的方法，其步驟為(1)β-內(nèi)酰胺酶抗體的制備取β-內(nèi)酰胺酶100μg、卡介苗5mg，與等體積佛氏完全佐劑研磨后注入6周齡雌性BALBPC小鼠腹腔，以后采用佛氏不完全佐劑，隔周腹腔注射5次，融合前3天腹腔注射50μg β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，以50％PEG4000為融合劑，將小鼠脾細(xì)胞與NS1細(xì)胞融合，IMDM2HAT選擇培養(yǎng)，2周后換HT培養(yǎng)液培養(yǎng)。以β-內(nèi)酰胺酶為抗原，經(jīng)間接ELISA法篩選陽(yáng)性克隆后的雜交瘤細(xì)胞，所得細(xì)胞株繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。將陽(yáng)性細(xì)胞株注入BALBPC小鼠腹腔，誘生腹水，用兔抗鼠免疫球蛋白及瓊脂雙擴(kuò)散法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶抗體。(2)包被抗體的制備用包被液將β-內(nèi)酰胺酶抗體稀釋至一定濃度并裝入毛細(xì)管中，將光纖插入，4℃孵育12～16h，4℃保存?zhèn)溆谩?3)標(biāo)記抗體的制備將所測(cè)標(biāo)本的抗體用稀釋液稀釋到一定濃度，在堿性環(huán)境下與熒光素染料Cy5結(jié)合后，通過(guò)凝膠過(guò)濾分離到標(biāo)記了Cy5的單克隆抗體。(4)固定抗體的制備將通過(guò)三氨基丙基三乙基硅烷等硅烷類物質(zhì)將光纖表面硅烷化，然后借助雙功能交聯(lián)劑戊二醛將標(biāo)記了Cy5的β-內(nèi)酰胺酶單抗進(jìn)行固定。(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將標(biāo)記了Cy5的β-內(nèi)酰胺酶單抗固定到活化器上，放入光纖生物傳感器，取一定量的不同濃度的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加到傳感器敏感膜上，再將傳感器插入到系統(tǒng)接口中，按下測(cè)試鍵，響應(yīng)一段時(shí)間，約300s后，將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行顯示和保存。記錄不同濃度的β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液所對(duì)應(yīng)的光信號(hào)值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。(6)樣品的檢測(cè)取一定量的待測(cè)樣品滴加到傳感器敏感膜上，再將傳感器插入到系統(tǒng)接口中，按下測(cè)試鍵，響應(yīng)一段時(shí)間，待數(shù)據(jù)穩(wěn)定后，記錄并保存測(cè)得信號(hào)值，對(duì)照β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出樣品中β-內(nèi)酰胺酶的含量。
2. 如權(quán)利要求3所述的一種利用光纖生物傳感器快速檢測(cè)乳制品中P-內(nèi)酰胺酶的方法，其 中所述的包被液為0.02 mol/L的Na2C03和0.04 mol/L的NaHC03, pH值為9.6。
3. 如權(quán)利要求3所述的一種利用光纖生物傳感器快速檢測(cè)乳制品中p-內(nèi)酰胺酶的方法，其 中所述的稀釋液為0.5%的干酪素和0.01 mol/L的PBS， pH值為9.6。
4. 如權(quán)利要求3所述的一種利用光纖生物傳感器快速檢測(cè)乳制品中p-內(nèi)酰胺酶的方法，其中所述的清洗液為0.02 mol/L磷酸鹽，0.05%的TntonX-100和0.1 g/L的NaN3， pH值為7.2。
5. —種利用光纖生物傳感器快速檢測(cè)乳制品中(3-內(nèi)酰胺酶的方法，其特征在于其包括光學(xué) 系統(tǒng)、電子學(xué)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)釆集系統(tǒng)及控制與處理系統(tǒng)，其特征在于其還包括光纖和傳感器。
6. 根據(jù)權(quán)利要求書5所述的光纖材料為聚苯乙烯。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用光纖生物傳感器快速檢測(cè)乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的方法，涉及一種光纖生物傳感器，其包括光學(xué)系統(tǒng)、電子學(xué)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)及控制與處理系統(tǒng)，其還包括光纖和傳感器，其中光纖材料為聚苯乙烯，傳感器上設(shè)有敏感膜，敏感膜上含有利用戊二醛固定的Cy5標(biāo)記的β-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體。該單克隆抗體通過(guò)以β-內(nèi)酰胺酶為抗原免疫小鼠，細(xì)胞融合等過(guò)程制備。本發(fā)明具有高靈敏度、抗電磁輻射、抗電子頻率干擾、抗腐蝕性，且儀器體積小，方便攜帶，所需檢測(cè)樣品少，響應(yīng)時(shí)間快，易于操作和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)?？蓮V泛用于液態(tài)牛奶、奶粉、固體樣品等乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101625365SQ200910184029
公開(kāi)日2010年1月13日 申請(qǐng)日期2009年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月11日
發(fā)明者張建中, 徐祖奇, 楊婷婷, 蔡建榮, 趙春城, 趙曉聯(lián), 馬禎婉 申請(qǐng)人:無(wú)錫益達(dá)生物技術(shù)有限公司