專利名稱：一種乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的金標試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測乳制品中(3-內(nèi)酰胺酶的金標試劑盒及制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
"解抗劑"學(xué)名P-內(nèi)酰胺酶，它是針對P-內(nèi)酰胺類抗生素提煉出來的一種化學(xué)品，是一 種抗生素分解劑，它能有效分解牛奶中殘留的抗生素。 一些不法生產(chǎn)廠家用來降解牛乳中殘 留的抗生素，生產(chǎn)所謂的"人造無抗奶"，致使抗生素酶解后的殘留物進入乳制品，對人體健 康造成傷害，同時也可能造成病菌的耐藥性。因此，迫切需要快速的檢測方法，從而能快速 準確的檢測乳制品中(3-內(nèi)酰胺酶。
金標法又叫"膠體金法"，是以膠體金作為示蹤標志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免 疫標記技術(shù)，有其獨特的優(yōu)點。免疫金標記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標志物或顯色劑，應(yīng)用 于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標記技術(shù)。由于它不存在內(nèi)源酶干擾及放射性同位素污染等 問題，且利用不同顆粒大小的膠體金還可以作雙重甚至多重標記，使定位更加精確。因此己 成為繼熒光素、酶、同位素及乳膠標記技術(shù)之后的一種新型標記技術(shù)。
關(guān)于乳制品中P-內(nèi)酰胺酶的檢測報道較少，本發(fā)明利用免疫金標記技術(shù)建立了檢測(3-內(nèi)酰胺酶的膠體金試紙條方法，能夠真正實現(xiàn)乳品中P-內(nèi)酰胺酶的一步法快速檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種p-內(nèi)酰胺酶的膠體金免疫層析試紙條及其制備工藝，能夠簡易、 快速地檢測乳品中非法添加的p-內(nèi)酰胺酶。
本發(fā)明根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)基本原理，將抗(3-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體用膠體 金標記，包被在玻璃纖維膜上作為金標墊，P-內(nèi)酰胺酶抗原和羊抗鼠IgG分別包被在硝酸纖 維素膜(NC膜)上作為檢測線和質(zhì)控線，當(dāng)被檢樣品中含有(3-內(nèi)酰胺酶時，可在檢測線上 形成抗原抗體結(jié)合物，并在NC膜上呈現(xiàn)紫紅色條帶，通過肉眼能夠簡易、快捷地對液態(tài)牛 奶、奶粉、固體樣品等乳制品中含有的P-內(nèi)酰胺酶進行檢測。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種檢測乳制品中p-內(nèi)酰胺酶的金標試劑盒的制 備方法，主要涉及以下幾方面內(nèi)容
1、 抗(3-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體的制備
以卩-內(nèi)酰胺酶作為免疫原，選用8周齡雌性BABL/C小鼠作為免疫動物，免疫劑量300嗎/ 只，采取腹腔注射，每次免疫間隔為2周，免疫5次。最后一次不加佐劑，免疫原劑量減半， 3 4天后取小鼠脾細胞與SP-2/o骨髓瘤細胞雜交融合，制備雜交瘤細胞。采取有限稀釋法篩 選雜交瘤細胞，篩選能夠穩(wěn)定分泌卩-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
2、 膠體金溶液及金標抗體的制備
用新制雙蒸水配制lOOmL 0.01%氯金酸溶液，置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸，在100r/min磁力攪拌下，迅速加入預(yù)先在37。C保溫的1%檸檬酸三鈉溶液4.5mL，保持 溫度和轉(zhuǎn)速不變，繼續(xù)攪拌加熱15min左右，直至溶液呈現(xiàn)清亮的酒紅色，膠體金的大小為 20 30nm。。室溫冷卻，4'C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 取30mL膠體金溶液加于50mL離心管中，用0.1M K2C03或0.1M HC1調(diào)節(jié)pH至7.0 7.5， 用鋁箔紙包住離心管，輕輕振蕩；邊振蕩邊逐滴加入3mL含250嗎(3-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體溶 液，繼續(xù)振蕩20min左右；逐滴加入1.5mL P/。BSA溶液以飽和游離的膠體金，然后于4'C， 9000rpm，離心45min;離心后取出離心管，將上清液輕輕吸掉一部分后，用移液槍將管底沉 淀小心吸至1.5mL離心管中，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 3、 金標墊制備
將上述標記好的膠體金用膠體金稀釋液(20mM PB， 150mM NaCl， 1%BSA， 0.1% TritonX-lOO， 2% Sucrose, 0.01% Proclin 300) 10倍稀釋后浸泡或噴點玻璃纖維，37。C真空干 燥，即制成金標墊。
4、 硝酸纖維素膜的處理
用金標點樣儀噴涂兩條平行線于硝酸纖維素膜上，NC膜上的檢測線為卩-內(nèi)酰胺酶抗原， 質(zhì)控線為羊抗鼠IgG，置37'C真空干燥后備用。
5、 膠體金試紙條的組裝
取制作試紙條專用的底板，先將干燥好的硝酸纖維素膜粘貼在相應(yīng)位置，再將吸水紙和 干燥好的金標墊粘貼在相應(yīng)位置并稍微壓住硝酸纖維素膜，最后將樣品墊粘好并壓住金標墊， 用切條機切割成3mm寬的試紙條裝入檢測卡中，此時，樣品墊的位置正對檢測卡的加樣孔、 硝酸纖維素膜位置正對檢測卡的觀測孔，與干燥劑一起裝入鋁箔袋中，密封包裝。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的積極效果
(1) 本發(fā)明首次公開了一種檢測乳制品中p-內(nèi)酰胺酶的金標試劑盒及制備方法，可檢測 樣品中的(3-內(nèi)酰胺酶。
(2) 反應(yīng)時間短。該試劑盒只有2歩檢測步驟，即加樣、反應(yīng)，均通過滲濾完成，檢測 全過程僅需數(shù)分鐘。
(3) 檢測結(jié)果不受儀器的影響；不受反應(yīng)環(huán)境的影響。
(4) 操作歩驟簡單，而且試劑可在室溫長期保存。 具體實施例
本發(fā)明的內(nèi)容可通過以下實施例作進一步詳細闡述，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例1
卩-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體的制備
將含lmg/mL的(3-內(nèi)酰胺酶溶液0.5mL與等體積完全弗氏佐劑混勻，充分乳化，供首次 免疫用，選用8周齡雌性BABL/C小鼠作為免疫動物，免疫劑量300pg/只，采取腹腔注射， 以后每隔2周加強免疫一次，加強免疫采用尾靜脈注射，免疫劑量250pg/只，最后一次免疫 采用脾內(nèi)注射，3 4天后取脾融合，將分離的免疫小鼠脾細胞與處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞SP-2/o以10:1比例混合，離心，去除上清，在50S 90S內(nèi)將1mL 50%聚乙二醇(分子量為 1500)加至細胞中，充分混勻，使其融合，lmin后加入20mLDMEM培養(yǎng)液(Dulbecco Modified Eagle Medium),終止融合，水浴靜止10 min后離心，去除上清；將融合細胞用含20%小牛 血清的HAT選擇性培養(yǎng)基(在培養(yǎng)液中加入次黃嘌嶺(hypoxanthine)，氨基碟呤(Aminopterin) 和胸腺嘧啶(thymidine)制成選擇培養(yǎng)液，簡稱HAT培養(yǎng)液)懸浮后，以最后濃度為bio4 飼養(yǎng)細胞/0.1mL接種于以小鼠腹腔巨噬細胞作詞養(yǎng)層的96孔培養(yǎng)板中，于5%002， 37'C條 件下培養(yǎng)，7~8天后，每培養(yǎng)孔更換2/3 HT培養(yǎng)液(在培養(yǎng)液中加入次黃嘌嶺(hypoxanthine) 和胸腺嘧啶(thymidine)制成選擇培養(yǎng)液，簡稱HT培養(yǎng)液)。10 20天后，開始對鏡檢有雜 交瘤克隆生長的培養(yǎng)孔，取上清液進行篩選，對檢測結(jié)果呈陽性的細胞立即用有限稀釋法進 行克隆，雜交瘤篩選采用固相抗原間接非競爭ELISA法進行，以(3-內(nèi)酰胺酶為包被抗原，以 免疫小鼠的血清為陽性對照，以SP-2/o骨髓瘤細胞培養(yǎng)的上清液為陰性對照。陽性細胞孔的 判定標準為(A趨-A加)/ (Aw-A站)〉2.1;對分泌陽性抗體的細胞進行克隆。采用有限稀 釋法，將陽性克隆細胞吹勻，取一微滴至培養(yǎng)瓶內(nèi)，倒置顯微鏡下準確計數(shù)細胞個數(shù)，稀釋 為70個/mL再取lmL稀釋20倍，接種入96孔培養(yǎng)板中進行亞克隆。直至所有細胞孔的培 養(yǎng)上清均呈陽性為止；對10 13周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.3mL/只 0.5mL/只，8 10 天后，腹腔注射培養(yǎng)至對數(shù)期的雜交瘤細胞，5><105細胞/只，3 5天后注意觀察，收集腹水， 離心去除沉淀，加甘油于-20'C保存。
實施例2
試紙條的生產(chǎn)工藝流程
1、 膠體金溶液及金標抗體的制備
用新制雙蒸水配制100mL 0.01%氯金酸溶液，置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至 沸，在100r/min磁力攪拌下，迅速加入預(yù)先在37。C保溫的1%檸檬酸三鈉溶液4.5mL，保持 溫度和轉(zhuǎn)速不變，繼續(xù)攪拌加熱15min左右，直至溶液呈現(xiàn)清亮的酒紅色，膠體金的大小為 20~30nm。。室溫冷卻，4'C冰箱保存?zhèn)溆?br> 取30mL膠體金溶液加于50mL離心管中，用0.1M K2C03或0.1M HC1調(diào)節(jié)pH至7.0-7.5， 用鋁箔紙包住離心管，輕輕振蕩；邊振蕩邊逐滴加入3mL含25(VgP-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體溶 液，繼續(xù)振蕩20min左右；逐滴加入1.5mLP/t)BSA.溶液以飽和游離的膠體金，然后于4'C， 9000rpm，離心45min;離心后取出離心管，將上清液輕輕吸掉一部分后，用移液槍將管底沉 淀小心吸至1.5mL離心管中，4"C保存?zhèn)溆谩?br> 2、 金標墊制備
將上述標記好的抗體用稀釋液(20mMPB， 150mMNaCl， 1%BSA， 0.1%TritonX-lOO， 2% Sucrose, 0.01% Proclin 300) 10倍稀釋后浸泡或噴點玻璃纖維，37'C真空千燥，即制成金 標墊。
3、 硝酸纖維素膜的處理
用金標點樣儀噴涂兩條平行線于硝酸纖維素膜上，NC膜上的檢測線為p-內(nèi)酰胺酶抗原， 質(zhì)控線為羊抗鼠IgG，置37'C真空干燥后備用。
具體實施方式
見圖l、圖2， 一種快速檢測P-內(nèi)酰胺酶的膠體余檢測卡，其包括檢測卡殼體1和試紙 條2，試紙條2封裝于檢測卡殼體1中，檢測卡殼體1上丌有加樣孔3和觀測孔4，試紙條2 包括底板5，試紙條2的底板5上依次粘貼有吸水紙6、硝酸纖維素膜7、金標墊8、樣品墊 9，吸水紙6和金標墊8分別粘貼在硝酸纖維素膜7兩側(cè)，在硝酸纖維素膜7的兩端結(jié)合處， 吸水紙6和金標墊8的一小段重疊壓在硝酸纖維素膜7上，樣品墊9粘貼在金標墊8的另一 頂U，樣品墊9的一小段重疊在金標墊8上；余標墊8上噴涂有金標抗P-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體； 硝酸纖維素膜7上依次噴涂有材質(zhì)為P-內(nèi)酰胺酶的檢測線10、材質(zhì)為羊抗鼠IgG的質(zhì)控線11 。
實施例3
卩-內(nèi)酰胺酶試劑盒的檢測方法 1、樣品的預(yù)處理
取10ml樣品，12000rpm離心10分鐘。用塑料吸管小心吸取上層液體，準確吸取lml 上清于具塞試管中，加入4ml20mMPBS溶液，蓋上蓋子，充分混勻。此稀釋的樣品為待測 樣品，可直接用于試驗。 2、試劑盒檢測
(1) 從鋁箔袋中取出測試卡，將其置于干凈的水平桌面；
(2) .加入待測樣品lOOpl于加樣孔內(nèi)；
(3) 3~15分鐘內(nèi)即可判斷結(jié)果。
結(jié)果判斷陽性(+ ):僅質(zhì)控線出現(xiàn)一條紫紅色條帶，檢測線上無紫紅色條帶出現(xiàn)，此 時結(jié)果為表明P-內(nèi)酰胺酶含量在50ppm以上；陰性(-)質(zhì)控線和檢測線均出現(xiàn)紫紅色條 帶。如果結(jié)果表明，P-內(nèi)酰胺酶含量在50ppm以下；無效質(zhì)控線未出現(xiàn)紫紅色條帶，表明 操作過程不正確或試劑盒已損壞變質(zhì)。
本發(fā)明的快速檢測P-內(nèi)酰胺酶的膠體金試紙條，其檢測快速，檢測時間在10min以內(nèi)， 能夠滿足現(xiàn)場快速檢測的需要，且檢測準確率高、特異性強，改變了對卩-內(nèi)酰胺酶的檢測必 須由專業(yè)機構(gòu)的專業(yè)人員才能進行檢測的局限性，攜帶方便，操作簡便，各個牛奶收購站、 各級檢驗檢疫部門及消費者均可即時進行檢驗；檢測試紙條的制備工藝簡單，成本低，且在 常溫下即可保存，無需特殊設(shè)備和儀器，檢測重復(fù)性好。


圖1為本發(fā)明快速檢測P-內(nèi)酰胺酶的膠體金檢測卡示意圖2為本發(fā)明快速檢測P-內(nèi)酰胺酶的膠體金檢測卡中所述試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖3為圖2的側(cè)視圖。
權(quán)利要求
1、一種半定量快速檢測β-內(nèi)酰胺酶的膠體金試紙條及其制備方法，其特征在于它是由底板、樣品墊、結(jié)合墊、吸水板等組成，其特征在于結(jié)合墊中噴有膠體金標記的抗β-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體，硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線和檢測線分別為羊抗鼠IgG和β-內(nèi)酰胺酶抗原。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的P-內(nèi)酰胺酶膠體金試紙條的制備方法，其特征在于其中所述的結(jié)合墊上金標抗體的制備方法包括下述步驟(1) 膠體金溶液制備用新制雙蒸水配制100mL 0.01%氯金酸溶液，置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至 沸，在100r/min磁力攪拌下，迅速加入預(yù)先在37。C保溫的1%檸檬酸三鈉溶液4.5mL，保持 溫度和轉(zhuǎn)速不變，繼續(xù)攪拌加熱15min左右，直至溶液呈現(xiàn)清亮的酒紅色，膠體金的大小為 20 30nm。。室溫冷卻，4'C冰箱保存?zhèn)溆谩?2) 膠體金標記抗體取30mL膠體金溶液加于50mL離心管中，用0.1M K2C03或0.1M HC1調(diào)節(jié)pH至7.0~7.5， 用鋁箔紙包住離心管，輕輕振蕩；邊振蕩邊逐滴加入3mL含25(^g(3-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體溶 液，繼續(xù)振蕩20min左右；逐滴加入1.5mL 1。/。BSA溶液以飽和游離的膠體金，然后于4。C， 9000rpm，離心45min;離心后取出離心管，將上清液輕輕吸掉一部分后，用移液槍將管底沉 淀小心吸至1.5mL離心管中，4。C保存?zhèn)溆谩?3) 金標墊制備將上述標記好的抗體用稀釋液(20mMPB， 150mMNaCl， 1。/。BSA， 0.1% TritonX-lOO， 2% Sucrose,'0.01% Proclin 300) 10倍稀釋后浸泡或噴點玻璃纖維，37'C真空干燥，即制成金 標墊。
3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的P-內(nèi)酰胺酶膠體金試紙條的制備方法，其特征在于NC膜上的檢測 線為(3-內(nèi)酰胺酶抗原，質(zhì)控線為羊抗鼠IgG。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種半定量快速檢測β-內(nèi)酰胺酶的膠體金試紙條及其制備方法。根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)原理，將抗β-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體用膠體金標記，包被在玻璃纖維膜上作為金標墊，β-內(nèi)酰胺酶抗原和羊抗鼠IgG分別包被在硝酸纖維素膜(NC膜)上作為檢測線和質(zhì)控線，當(dāng)被檢樣品中含有β-內(nèi)酰胺酶時，可在檢測線上形成抗原抗體結(jié)合物，并在NC膜上呈現(xiàn)紫紅色條帶，通過肉眼能夠簡易、快捷地對液態(tài)牛奶、奶粉、固體樣品等乳制品中含有的β-內(nèi)酰胺酶進行檢測。
文檔編號G01N33/577GK101620230SQ20091018403
公開日2010年1月6日 申請日期2009年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月11日
發(fā)明者張建中, 徐祖奇, 蔡建榮, 趙春城, 趙曉聯(lián), 馬禎婉 申請人:無錫益達生物技術(shù)有限公司