專利名稱：：鹿流行性出血病競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒及其制備方法和用途的制作方法鹿流行性出血病竟爭酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒及其制備方法和用途
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物
技術領域：
，特別是涉及一種鹿流行性出血病病毒抗體竟爭酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒及其制備方法和用途。背景4支術鹿流行性出血病(epizootichaemorrhagicdiseaseofdeer,EHD)是一種季節(jié)性、非接觸性的病毒性傳染病。鹿流行性出血病病毒(EHDV)為呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)的成員，是通過節(jié)肢動物(主要是庫蠓)傳播的雙股RNA病毒，在形態(tài)結構上與藍舌病病毒(BTV)極為相似，血清學上與藍舌病有明顯交叉。在自然條件下，鹿流行性出血病病毒可引起牛、綿羊等家畜及白尾鹿(Wi^/';7"/7^)、糜、大角羚羊等多種馴養(yǎng)和野生反芻動物感染。美國已從白尾鹿、黑尾鹿、綿羊、山羊、牛、野牛及庫蠓體內(nèi)分離到了病毒。以白尾鹿最為嚴重，臨床特征為體溫短暫升高，呈休克癥狀，粘膜和漿膜出血，于昏迷狀態(tài)下死亡。病變呈廣泛性充血、出血、嚴重水腫和血管壞死，有時出現(xiàn)腹膜水腫。綿羊EHD與藍舌病(bluetonguevirus,BTV)相似，死亡率2~30%,牛感染后可以檢測到抗體，但不表現(xiàn)癥狀，美國牛群中EHD病毒的血清陽性相當普遍。該病在日本、中國臺灣、朝鮮都有報道，臨床以發(fā)熱、精神沉郁、吞咽困難、消瘦等為特征，有時還導致懷孕牛流產(chǎn)、死產(chǎn)。目前EHD共發(fā)現(xiàn)8個血清型，美國大多為EHDV-2、EHDV-1，澳大利亞有EHDV-l、EHDV-2、EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8等6個血清型。尼曰利亞]分離到EHDV-3、E隨-4。另外，印度尼西亞、中國臺灣省、馬來西亞、菲律賓、圭亞等地都分離到EHDV。本病目前尚無有效疫苗和治療措施，控制和消滅EHD必須花費大量的人力物力，給EHDV流行的國家?guī)砗艽蟮慕?jīng)濟損失。建立基于單克隆抗體的鹿流行性出血病竟爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(c-ELISA)方法，是動物檢疫中急需解決的關鍵技術問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在解決上述問題，而提供一種特異性強，敏感性高，適用于鹿流行性出血病的快速診斷、檢測、檢疫和流行病學調(diào)查的鹿流行性出血病竟爭酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒。本發(fā)明的目的還在于提供該鹿流行性出血病竟爭酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供該鹿流行性出血病竟爭酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種鹿流行性出血病竟爭酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒，該試劑盒包括EHDV抗原包被ELISA板單克隆抗體IgG-HRP酶結合物陽性血清陰性血清20倍濃縮洗滌液IO倍濃縮稀釋液底物I底物n底物m終止液8其中，所述單克隆抗體IgG-HRP酶結合物為辣才艮過氧化酶(HRP)標記的鼠抗鹿流行性出血病病毒的特異性單克隆抗體(McAb)(IgG);20倍濃縮洗滌液為20倍濃縮的含0.05%Tween-20的0.Olmol/LpH7.4的PBST(石舞酸緩沖液)，10倍濃縮稀釋液為10倍濃縮的含1%明膠的PBST;底物I為pH6.0的乙酸一檸檬酸緩沖液；底物II為3.3，-5.5，-四曱基聯(lián)苯胺(TMB)溶液；底物m為雙氧水(H202)溶液；終止液為lmo1/L1^0^危酸溶液。該試劑盒的優(yōu)選方案包括EHDV抗原包被ELISA板2板96孔酶標板單克隆抗體IgG-HRP酶結合物0.5ml陽性血清1ml陰性血清1ml20倍濃縮洗滌液50mlIO倍濃縮稀釋液30ml底物I20ml底物II2ml底物ni1ml終止液20ml其中，所述單克隆抗體IgG-HRP酶結合物為辣根過氧化酶(HRP)標記的鼠抗鹿流行性出血病病毒的特異性單克隆抗體(McAb)(IgG);20倍濃縮洗滌液為20倍濃縮的含0.05%Tween-20的0.Olmol/LpH7.4的PBST(磷酸鹽緩沖液)；10倍濃縮稀釋液為10倍濃縮的含1%明膠的PBST;底物I為pH6.O的乙酸一檸檬酸緩沖液；底物II為3.3，-5.5，-四曱基聯(lián)苯胺(TMB)溶液；底物III為雙氧水(H202)溶液；終止液為lrao1/LH2S04碌u酸溶液。本發(fā)明還提供了所述鹿流行性出血病竟爭酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒的制備方法，該方法包4舌a、制備鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原，并檢定鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原的安全性；b、制備抗鹿流行性出血病病毒的單克隆抗體，并對抗鹿流行性出血病病毒單克隆抗體辣根過氧化酶(HRP)酶結合物進行制備與鑒定；c、制備陽性血清和陰性血清；d、制備鹿流行性出血病病毒抗原包被的ELISA板；e、制備20倍濃縮洗滌液和10倍濃縮稀釋液，并制備底物I、底物II、底物III及終止液；f、將上述制備好的ELISA抗原包被板、酶結合物、IO倍濃縮稀釋液、20倍濃縮洗滌液、底物液I、底物液II、底物液III、終止液、陽性血清、陰性血清定量分裝，分別貼上標簽與說明，并裝入專用的試劑盒外殼內(nèi)，外殼上貼上試劑盒標簽。步驟a中，鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原的制備方法為將BHK-21細胞長成單層后接種EHDV,無血清的基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞病變達75%以上時，收獲病毒，反復凍融3次，以8000轉/分離心30分鐘，取上清液，加入終濃度為1/3000的曱醛滅活病毒；采用20%、60%(w/v)不連續(xù)蔗糖密度梯度20000r/分鐘4'C超速離心3小時，收獲提純的病毒條帶作為抗原；鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原的安全性檢定方法為將純化的病毒抗原用維持液作適當稀釋接種到已長成單層的BHK21細胞上，同時作正常細胞對照，傳二代，無CPE出現(xiàn)，表明作為包被抗原用的病毒已滅活徹底，純化的抗原是安全的。步驟b中，抗鹿流行性出血病病毒單克隆抗體的制備方法為用提純的鹿流行性出血病抗原分別加等體積弗氏完全佐劑乳化和弗氏不完全佐劑乳化，先后免疫BALB/c小鼠三次；取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在50%聚乙二醇(匿4000)融合劑下融合，HAT篩選培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞，用間接ELISA方法檢測分泌抗EHDV的陽性孔，獲得能穩(wěn)定傳代并分泌抗EHDV的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞，利用BALB/c小鼠制備抗鹿流行性出血病病毒單克隆抗體腹水；抗鹿流行性出血病病毒單克隆抗體辣根過氧化酶(HRP)酶結合物的制備與鑒定方法為將抗鹿流行性出血病病毒BALB/c小鼠腹水McAb，分別經(jīng)1次50%和2次33%飽和疏酸銨沉淀提純，透析除鹽；用改良過的過碘酸氧化法將辣根過氧化物酶(HRP)標記于單克隆抗體，lmL/管分裝，-8(TC溫度保存。步驟c中，陽性血清的制備方法為挑選體才各健壯的18個月以上的山羊23只，將純化后EHDV與等體積弗氏完全佐劑乳化，充分混勻后經(jīng)背部皮下注射，2mL/只，首免后第2周和第4周分別用EHDV相同劑量加等體積弗氏不完全佐劑(FIA)進行二免和三免后，無菌采血分離血清，lmL/管分裝，-8(TC溫度保存；陰性血清的制備方法為選擇體格健壯的18個月以上的山羊，采血用血清中和試驗或酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清中是否有鹿流行性出血病的抗體，證實無鹿流行性出血病抗體的山羊，無菌采血分離血清，lmL/管分裝，-80。C溫度保存。步驟d中，鹿流行性出血病病毒抗原包被ELISA板的制備方法將純化后的鹿流行性出血病病毒用優(yōu)化好的上述包被緩沖液稀釋成4.0)Lig/mL，以50inL/孔加入ELISA板，置4。C溫度的水箱中過夜包被，拍干ELISA板；以200jiL/孔加入優(yōu)化好的封閉液，置4。C溫度的水箱中封閉過夜；徹底拍干ELISA板。將已包被好的ELISA板置于鋁簿或簿錫紙中，內(nèi)置2g硅膠干燥劑，封口，置4。C溫度保存。步驟e中，20倍濃縮洗滌液制備方法為NaCL160g,KH2P044g，Na2HP04.12H2058g，KCL4g,Tween-2010mL，蒸餾水1000mL，充分溶解，另加0.01°/的硫柳汞作防腐劑，過濾除菌后分裝；10倍濃縮稀釋液制備方法為NaCL80g,KH2P042g,Na2HP04.12H2029g,KCL2g，Tween-205mL,明膠100g，蒸餾水1000mL，充分溶解，另加0.01%的硫柳汞作防腐劑，過濾除菌后分裝；所述底物I為pH6.0的乙酸一檸檬酸緩沖液，底物II為3.3，-5.5，-四曱基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，底物III為雙氧水(H202)溶液，終止液為lmo1/LH2S0^石危酸溶液。本發(fā)明的試劑盒的檢測操作流程為用稀釋液以1:IO稀釋陽性、陰性對照血清和所有被檢血清，加入ELISA板，每份被檢血清樣品做兩孔，每孔加50|uL;37。C濕盒感作45分鐘，每孔加50|uLHRP標記的McAb酶結合物，酶標板置37。C溫度濕盒感作4G分鐘；洗板四次，每孔加1GG|uL底物液，酶標板置濕盒暗盒15分鐘；加入5(VL/孔終止液；用酶標儀在波長450nm下測定光密度值(OD值)，計算抑制百分率(PI)。本發(fā)明還進一步提供了該鹿流行性出血病病毒抗體竟爭酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒的用途，該試劑盒用于鹿流行性出血病的診斷、檢疫、檢測和流行病學調(diào)查。本發(fā)明的貢獻在于，它解決了鹿流行性出血病病毒的快速檢測及診斷問題。本發(fā)明的鹿流行性出血病病毒抗體竟爭酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒具有特異性強，敏感性高等特點，可適用于鹿流行性出血病的快速診斷、檢測、檢疫和流行病學調(diào)查。具體實施方式本發(fā)明的鹿流行性出血病病毒抗體竟爭酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒的制備方法包括但不限于下述實施例。該方法的具體步驟為1、鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原的制備BHK-21細胞長成單層后接種鹿流行性出血病病毒EHDV,于37。C溫度反應1小時。加入無血清的基礎培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，34d后細胞病變(CPE)達75°/。以上時，收獲病毒。將收獲的病毒液反復凍融3次，以8000轉/分離心30分鐘，取上清液，加入終濃度為1/3000的曱醛滅活病毒。以28000轉/分及4。C溫度超速離心3小時。沉淀用1/100原體積的PBS(磷酸緩沖液)溶解，然后采用20%、60%(w/v)不連續(xù)蔗糖密度梯度20000轉/分及4。C溫度超速離心3小時，收獲提純的病毒條帶作為抗原，用DU800核酸蛋白分析儀測定蛋白含量，-2(TC溫度保存?zhèn)溆谩?、鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原安全性;險定將純化的病毒抗原用維持液作適當稀釋(1:10-1:100)接種到已長成單層的BHK21細胞上，同時作正常細胞對照。在37。C溫度培養(yǎng)6d，接種細^^與正常細胞相同，無CPE出現(xiàn)；取培養(yǎng)液上清(包括正常細胞培養(yǎng)液上清)包被酶標板，用陽性血清進行檢測，病毒培養(yǎng)液和正常細胞培養(yǎng)液顯色情況一致，均為無色，表明作為包被抗原用的病毒已滅活徹底，不具感染性，ELISA包被抗原是安全的。3、抗鹿流行性出血病病毒單克隆抗體的制備首先進行鹿流行性出血病病毒的培養(yǎng)和純化，用EHDV病毒接種BHK-21細胞長成單層，收獲的細胞培養(yǎng)病毒液反復凍融3次，以8000轉/分離心30分鐘，取上清液，超速離心和不連續(xù)蔗糖密度梯度離心，收獲提純的病毒條帶，用核酸蛋白分析儀測定蛋白含量為2.85g/L，于-20。C溫度保存?zhèn)溆茫挥锰峒兊穆沽餍行猿鲅〔《究乖謩e加等體積弗氏完全佐劑(FCA)乳化和弗氏不完全佐劑(FIA)乳化，先后免疫BALB/c小鼠三次；取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在50%聚乙二醇(MW4000)融合劑下融合，HAT篩選培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞，用間接ELISA方法;險測分泌抗EHDV的陽性孔；用有限稀釋法進行細胞克隆，經(jīng)間接ELISA篩選陽性克隆，獲得能穩(wěn)定傳代并分泌抗EHDV的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞；將獲得的分泌抗EHDV的特異性單克隆抗體雜交瘤細胞注射入BALB/c小鼠腹腔制備單抗腹水；采集單克隆抗體腹水，測定抗體效價、蛋白含量和親和力，腹水ELISA效價高達為1:512000，用核酸蛋白分析儀測定純化腹水IgG的含量為1.56g/L。親和力分常數(shù)高達6.12x107mol/L。用間接ELISA方法鑒定制備的單克隆抗體僅與鹿流行性出血病病毒有特異性免疫反應，而與其它相關病毒(如BTV、VSV、AKV、PPRV、BVDV等)沒有任何免疫反應。4、抗鹿流行性出血病病毒單克隆抗體辣根過氧化酶(HRP)酶結合物的制備與鑒定將抗鹿流行性出血病病毒BALB/c小鼠腹水McAb,分別經(jīng)1次50°/。和2次33°/。飽和硫酸銨沉淀提純，透析除鹽；用改良過的過;典酸氧化法將辣^^艮過氧化物酶(HRP)標記于單克隆抗體。標"i己程序如下將5mgHRP溶于0.5mL0.lmol/LNaHC03溶液中；加0.5mL10mmol/L化104溶液，混勻，蓋緊并瓦塞，室溫避光作用2小時。力。0.75mL0.lmol/L^20)3混勻。加入0.75mL純化單抗(15mg/mL)，混勻。稱取SephadexG25干粉0.3g,加入一支下口墊玻璃棉的5mL注射器外筒內(nèi)；隨后將上述交聯(lián)物移入注射器外套，蓋緊，于4。C溫度過夜。用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加1/20體積的新鮮配制的5mg/mLNaBlU容液，混勻，室溫作用30分鐘；再加入3/20體積的NaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時(或于4。C溫度過夜)。將交fl關物過SephadexG200或Sepharose6B(2.6x50cm)層析純化，分管收集第一峰。測定克分子比值和標記率，鑒定酶結合物質量，用ELISA法測定酶活性和抗體活性。HRP抗體酶結合物的保存時，加入等量甘油(或1%BSA和50。/o甘油)后，小量分裝于-2(TC溫度存;^文。5、陽性血清的制備挑選體格健壯的18個月以上的山羊2~3只，將純化后的鹿流行性出血病病毒EHDV與等體積弗氏完全佐劑(FCA)乳化，充分混勻后經(jīng)背部皮下注射，2mL/只；首免后第2周和第4周分別用EHDV相同劑量加等體積弗氏不完全佐劑(FIA)進行二免和三免；待山羊血清中抗鹿流行性出血病病毒IgG抗體酶聯(lián)免疫吸附試—驗效價達1:500以上，無菌采血分離血清，離心或過濾除去沉淀，進行56。C溫度加熱30分鐘滅活，用血清保存液配方I按1:2稀釋(能用正常的山羊血清稀釋更好，因其成份更接近于檢測標本)，抽濾除菌，lmL/管分裝，貼上標簽，于-8(TC溫度保存。不可反復凍融，解凍后只能在4。C溫度保存一周。6、陰性血清的制備選擇體格健壯的18個月以上的山羊，采血用行業(yè)標準SNT1167-2002《鹿流行性出血病瓊脂免疫擴散試驗操作規(guī)程》檢測方法確認的血清中是否有鹿流行性出血病的抗體，證實無鹿流行性出血病抗體的山羊，無菌采血分離血清。用血清保存液配方I按1:2稀釋，lmL/管分裝，貼上標簽，于-8(TC溫度保存。7、包被緩沖液的優(yōu)化包被抗原時，為了得到最佳的包被效果，用碳酸鹽緩沖液0.05mol/LpH9.6、磷酸鹽緩沖液0.05mol/LpH7.6和Tris鹽酸緩沖液0.05mol/LpH7.6三種緩沖液作為包被液，抗原包被濃度為5ng/ml和2.5iig/ml，酶標抗體工作濃度為1:1000及1:500，用自動酶標儀分析，選擇最佳的包被緩沖液系統(tǒng)。同時為了保證緩沖液能夠長期保存，在包被液中添加了0.01°/。的硫柳汞作為防腐劑。結果獲得以下最佳包被液的配方0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液(NaHC031.465g、Na2C030.795g或Na2C03.10H2O1.2g、水500mL)中含0.01%的硫柳汞、l|ig/ml兩性霉素B、谷氨酸鈉1°/。、1%BSA、30|ig/mL蛋白酶抑制劑(胰凝乳蛋白酶)等，溶解后過濾除菌，置于4。C溫度冰箱，一周內(nèi)使用。8、最適抗原包被濃度的優(yōu)化抗原純化后要準確測定蛋白質濃度，用優(yōu)化好的上述包被緩沖液，將包被抗原稀釋成0.1jag/mL，1.0mg/mL,2.0jLig/mL,4.0jug/mL,6.Ojug/mL，8.Ojag/mL,10.0jug/mL等6個濃度，包被ELISA板，每孔100iiL,進行ELISA測定。經(jīng)孵育、顯色、終止后，用自動酶標儀分析。顯色的強度在一定范圍內(nèi)與包被的抗原量成正比，但隨著包被抗原濃度的增加，顯色的強度反而降低，選擇濃度最低而OD值最大的包被抗原量作為最適抗原包被濃度，測得蛋白質的最適包被濃度為2.0jig/mL~4jlig/mL。9、酶標抗體稀釋度的優(yōu)化抗原包被濃度為4)ag/mL,將酶標抗體做系列稀釋:1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800，經(jīng)孵育、洗滌及顯色終止后，用自動酶標儀分析，選擇OD值為1~1.5左右的酶標抗體稀釋度為最適工作濃度。結果表明，將酶標抗體做1:1000稀釋時，OD值為l1.5左右。10、抗原抗體反應時間和McAb竟爭反應時間的優(yōu)化以反應時間短、效果最好、背景值最低為原則，反應時間采用20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、"分鐘、M分鐘、6G分鐘等8個點進行比較，結果表明，當抗原抗體反應時間為45分鐘、McAb竟爭反應時間為40分鐘時效果最好，背景值低。11、底物作用時間的優(yōu)化在其它條件相同的情況下，采用5分鐘、IO分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘等7個時間點進行比較，獲得15分鐘為最佳的底物作用時間。12、2Q倍濃縮洗滌液、IO倍濃縮稀釋液、底物液、終止液的優(yōu)選本發(fā)明通過試驗，選定如下最佳的洗滌液、稀釋液、底物液配方(1)20倍濃縮洗滌液配方NaCL160g,KH2P044g,Na2HP04.12H2058g,KCL4g，Tween-2010mL,蒸餾水1000mL，充分溶解，另力口0.01%的硫柳汞作防腐劑，過濾除菌后分裝。用時作20倍稀釋。(2)IO倍濃縮稀釋液配方:NaCL80g,KH2P042g,Na2HP04.12H2029g，KCL2g,Tween-205mL,明膠lOOg，蒸餾水lOOOmL,充分溶解，另加0.01%的疏柳汞作防腐劑，過濾除菌后分裝。用時作10倍稀釋。(3)底物液的優(yōu)選底物液I配方乙酸一檸檬酸緩沖液(pH6.0):乙酸鈉(A液)一一乙酸鈉1.64g、水200mL，溶解后置于4。C溫度冰箱備用；檸檬酸(B液)一一檸檬酸2.1g、水100mL，溶解后置于4。C溫度冰箱備用。配制取B液約2mL至A液中調(diào)pH值至6,0,置于4。C溫度冰箱備用。另加0.01%的硫柳汞作防腐劑，過濾除菌分裝。底物液II配方TMB溶液TMB350mg、曱醇100mL，加溫溶解后保存于不透光的棕色瓶中，保存于室溫或在2°C7。C溫度保存。底物液III配方每個ELISA試劑盒配一管0.5mL的30%H202，臨用時再按每10ml底物液10pL。工作底物液配制臨用前配制。取底物液I(37°C)9.7mL、底物液II300nL、底物液III10|iL混合。(4)終止液的優(yōu)選采用lmol/LH2S04、1.5°/NaF、0.1%疊氮鈉和1%十二烷基石克酸鈉(SDS)作為終止液，進行優(yōu)選，結果以lmol/L1^04的終止液效果最好。13、封閉液和封閉方法的優(yōu)選經(jīng)試驗，選定0.01mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)中含1%牛血清白蛋白(BSA)、2%明膠、0.01%硫柳汞、兩性霉素B(l|ig/ml)、慶大霉素(20pig/ml)，過濾除菌。進行4。C溫度冰箱中封閉過夜與37。C溫度2小時封閉效果比對試驗，封閉和不封閉比對試驗，及封閉后洗板和封閉后不洗板比對試驗。結果顯示，4。C溫度冰箱中封閉過夜、封閉后不洗板的方法獲得了最佳的試驗結果。14、血清、抗體、單克隆抗體保存液的優(yōu)選配方I:0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中含0.01%的硫柳汞、兩性霉素B(l|ig/ml)、20ng/ml慶大霉素、谷氨酸鈉1°/。、1%BSA、1°/。乳糖(或山梨醇甘油)、含蛋白酶抑制劑(如胰凝乳蛋白酶30iig/mL),過濾除菌。配方II:將對乙酰氨基朌1.5g,聚乙二醇(MW20000)10g,小牛血清2g,吐溫(Tween)-20lmL,硫柳汞0.2g和0.02mol/L、pH7.2的鹽酸緩沖鹽水1000mL配制而成，過濾除菌。結果以配方I作為保存液的保存效果最好。15、包被ELISA板制備、保存以及保存期限的測定選擇進口優(yōu)質的可拆96孔ELISA板，將純化后的EHDV，用優(yōu)化好的上述包被緩沖液稀釋成4.0jag/mL，以50pL/孔加入ELISA板，置于4。C溫度水箱中過夜包被，拍干ELISA板；以200)uL/孔加入優(yōu)化好的封閉液，置于4。C溫度冰箱中封閉過夜；徹底拍干ELISA板。將已包被好的ELISA板置于鋁簿或簿錫紙中，內(nèi)置2g硅膠干燥劑，封口，于4。C溫度保存，定期用ELISA測定效果，以測定保存期。結果表明，包被ELISA板于4。C溫度下保存至8個月，與新包被的ELISA板檢測效果完全一致。16、試劑盒一企測操作程序(1)將試劑盒中的EHDV抗原包被ELISA板、20倍濃縮洗滌液、10倍濃縮稀釋液、底物液、終止液取出，置于室溫下至少30分鐘。(2)用雙蒸水配制稀釋液、洗滌液。如工作3希釋液lOmLlO倍稀稀液+901^雙蒸水，工作洗滌液25mL2G倍洗滌液+475mL雙蒸水。(3)配制1:10的陽性、陰性對照血清和所有被檢血清，如方法10pL血清+90^iL稀釋液，混勻。(4)HRP標記的McAb酶結合物的稀釋(均按1:1000稀釋)，如McAb稀釋20jliLMcAb+20mL稀釋液，混勻。(5)加樣——在酶標板上設立稀釋液空白對照、陰性血清對照、陽性血清對照(每孔做兩孔)。——每份被檢血清樣品做兩孔?！OOiaL稀釋液入空白對照孔，取50iiL陰性、陽性血清入相應的對照孔，取50|liL被檢血清樣品入相鄰橫行孔內(nèi)，于37。C溫度濕盒感作45分鐘?！靠准?0|iiLHRP標記的McAb酶結合物(空白對照孔不加)，輕輕混勻。(6)酶標板于37。C溫度濕盒感作40分鐘。(7)配制底物液取出9.7mL底物液I于棕色并瓦中，分別加入底物液11300iuL和底物液m7fiL,充分混勻。(8)先用洗滌液洗酶標板孔4次，每次2分鐘。(9)加底物液所有板孔加1GQ)liL底物液，酶標板置濕盒暗盒15分鐘。(10)加終止液加入5GpL/孔終止液。(11)用酶標儀在波長450nm下測定光密度值(OD值)，按下式計算抑制百分率(PI):被檢血清平均OD值抑制百分率(PI)=(100--)x100陰性血清平均OD值(12)試劑盒陽性判定值的確定按照上述試劑盒的檢測程序，采用行業(yè)標準SNT1167-2002《鹿流行性出血病瓊脂免疫擴散試驗操作規(guī)程》檢測方法確認的50份陰性血清和50份陽性血清，進行c-ELISA試驗后，結果所有陰性血清的百分抑制率>50%，所有陽性血清的百分抑制率<50%。因此，獲得c-ELISA陽性判定值(cut-offvalue)為PI^50%被檢血清EHDV抗體陽性；PI<50%被檢血清EHDV抗體陰性。17、試劑盒的組裝將按上述方法制備好的ELISA抗原包被板(封閉于鋁簿/簿錫紙中，內(nèi)置2g硅膠干燥劑，封口)、酶結合物、單克隆抗體、IO倍濃縮稀釋液、20倍濃縮洗滌液、底物液I、底物液II、底物液III、終止液、陽性血清、陰性血清定量分裝，分別貼上標簽與說明，裝入專用的試劑盒外殼內(nèi)，外殼上貼上試劑盒標簽，并附上一份詳細的試劑盒使用操作說明書。18、試劑盒中各種試液的配制與分裝見表l:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>19、試劑盒的臨床樣品檢測與應用以及試劑盒敏感性、特異性的評價按照上述試劑盒的檢測程序，采用行業(yè)標準SNT1167-2002《鹿流行性出血病瓊脂免疫擴散試驗操作規(guī)程》檢測方法確認的5Q份陰性血清和50份陽性血清，進行c-ELISA試驗。統(tǒng)計獲得試劑盒的特異性為96%(陰性結果數(shù)/陰性樣品總數(shù)=48/50),敏感性為92%(陽性結果數(shù)/陽性樣品總數(shù)=46/50),本試劑盒的特異性、敏感性為良好。權利要求1、一種鹿流行性出血病病毒抗體競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括EHDV抗原包被ELISA板單克隆抗體IgG-HRP酶結合物陽性血清陰性血清20倍濃縮洗滌液10倍濃縮稀釋液底物I底物II底物III終止液其中，所述單克隆抗體IgG-HRP酶結合物為辣根過氧化酶(HRP)標記的鼠抗鹿流行性出血病病毒的特異性單克隆抗體(McAb)(IgG)；20倍濃縮洗滌液為20倍濃縮的含0.05％Tween-20的0.01mol/LpH7.4的PBST；10倍濃縮稀釋液為10倍濃縮的含1％明膠的PBST；底物I為pH6.0的乙酸-檸檬酸緩沖液；底物II為3.3’-5.5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液；底物III為雙氧水(H2O2)溶液；終止液為1mol/LH2SO4硫酸溶液。2、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括EHDV抗原包被ELISA板2板96孔酶標板單克隆抗體IgG-HRP酶結合物Q.5ml陽性血清1ml陰性血清1ml2(H咅濃縮洗滌液50mlIO倍濃縮稀釋液30ml底物I20ml底物II2ml底物III1ml終止液20ml其中，所述單克隆抗體IgG-HRP酶結合物為辣根過氧化酶(HRP)標記的鼠抗鹿流行性出血病病毒的特異性單克隆抗體(McAb)(IgG);20倍濃縮洗滌液為20倍濃縮的含0.05%Tween-20的0.Olmol/LpH7.4的PBST;10倍濃縮稀釋液為10倍濃縮的含1°/。明膠的PBST;底物I為pH6.Q的乙酸一檸檬酸緩沖液；底物II為3.3，-5.5，-四曱基聯(lián)苯胺(TMB)溶液；底物III為雙氧水(H202)溶液；終止液為lmo1/L1^04碌^酸溶液。3、一種如權利要求1所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，該方法包括a、制備鹿流行性出血病病毒ELISA包^皮抗原，并檢定鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原的安全性；b、制備抗鹿流行性出血病病毒的單克隆抗體，并對抗鹿流行性出血病病毒單克隆抗體辣根過氧化酶(HRP)酶結合物進行制備與鑒定；c、制備陽性血清和陰性血清；d、制備鹿流行性出血病病毒抗原包被的ELISA板；e、制備20倍濃縮洗滌液和10倍濃縮稀釋液，并制備底物I、底物II、底物III及終止液；f、將上述制備好的ELISA抗原包被板、酶結合物、IO倍濃縮稀釋液、20倍濃縮洗滌液、底物液I、底物液II、底物液III、終止液、陽性血清、陰性血清定量分裝，分別貼上標簽與說明，并裝入專用的試劑盒外殼內(nèi)，外殼上貼上試劑盒標簽。4、如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(a)中，鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原的制備方法為將BHK-21細胞長成單層后接種EHDV，無血清的基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞病變達75%以上時，收獲病毒，反復凍融3次，以8000轉/分離心30分鐘，取上清液，加入終濃度為1/3000的曱醛滅活病毒；采用20°/。、60%(w/v)不連續(xù)蔗糖密度梯度20000轉/分4。C溫度超速離心3小時，收獲提純的病毒條帶作為抗原；鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原的安全性檢定方法為將純化的病毒抗原用維持液作適當稀釋接種到已長成單層的BHK21細胞上，同時作正常細胞對照，傳二代，無CPE出現(xiàn)，表明作為包被抗原用的病毒已滅活徹底，純化的抗原是安全的。5、如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(b)中，抗鹿流行性出血病病毒單克隆抗體的制備方法為用提純的鹿流行性出血病抗原分別加等體積弗氏完全佐劑乳化和弗氏不完全佐劑乳化，先后免疫BALB/c小鼠三次；取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在50%聚乙二醇(MW4000)融合劑下融合，HAT篩選培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞，用間接ELISA方法檢測分泌抗EHDV的陽性孔，獲得能穩(wěn)定傳代并分泌抗EHDV的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞，利用BALB/c小鼠制備抗鹿流行性出血病病毒單克隆抗體腹水；抗鹿流行性出血病病毒單克隆抗體辣根過氧化酶(HRP)酶結合物的制備與鑒定方法為將抗鹿流行性出血病病毒BALB/c小鼠腹水McAb,分別經(jīng)1次50°/。和2次33%飽和硫酸銨沉淀提純，透析除鹽；用改良過的過碘酸氧化法將辣根過氧化物酶(HRP)標記于單克隆抗體，lmL/管分裝，-8(TC溫度保存。6、如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(c)中，陽性血清的制備方法為挑選體格健壯的18個月以上的山羊2~3只，將純化后EHDV與等體積弗氏完全佐劑乳化，充分混勻后經(jīng)背部皮下注射，2mL/只，首免后第2周和第4周分別用EHDV相同劑量加等體積弗氏不完全佐劑(FIA)進行二免和三免后，無菌采血分離血清，lmL/管分裝，-80匸溫度保存；陰性血清的制備方法為選擇體格健壯的18個月以上的山羊，采血用血清中和試驗或酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清中是否有鹿流行性出血病的抗體，證實無鹿流行性出血病抗體的山羊，無菌采血分離血清，lmL/管分裝，-8(TC溫度保存。7、如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(d)中，鹿流行性出血病病毒抗原包被ELISA板的制備方法將純化后的鹿流行性出血病病毒用優(yōu)化好的上述包被緩沖液稀釋成4.0Mg/mL,以50pL/孔加入ELISA板，置4。C溫度的冰箱中過夜包被，拍干ELISA板；以200jiL/孔加入優(yōu)化好的封閉液，置4t:溫度的冰箱中封閉過夜；徹底拍干ELISA板。將已包被好的ELISA板置于鋁簿或簿錫紙中，內(nèi)置2g硅膠干燥劑，封口，置4。C溫度保存。8、如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(e)中，20倍濃縮洗滌液制備方法為NaCL160g,KH2P044g,Na2HPO"12H2058g,KCL4g,Tween-20lOmL,蒸餾水1000mL，充分溶解，另加0.01%的硫柳汞作防腐劑，過濾除菌后分裝；10倍濃縮稀釋液制備方法為NaCL80g,KH2P042g，Na2HP04.12H2029g,KCL2g，Tween-205mL,明膠lOOg,蒸餾水lOOOmL,充分溶解，另加0.Qiy。的^U印汞作防腐劑，過濾除菌后分裝；所述底物I為pH6.O的乙酸一檸檬酸緩沖液，底物II為3.3，-5.5，-四曱基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，底物III為雙氧水(HA)溶液，終止液為lmo1/LH2S0J危酸溶液。9、如權利要求1所述試劑盒的檢測操作流程為用稀釋液以1:10稀釋陽性、陰性對照血清和所有被檢血清，加入ELISA板，每份被檢血清樣品做兩孔，每孔加50|aL;37。C濕盒感作45分鐘，每孔加50|aLHRP標記的McAb酶結合物，酶標板置37。C溫度濕盒感作40分鐘；洗板四次，每孔加100)^L底物液，酶標板置濕盒暗盒15分鐘；加入50)aL/孔終止液；用酶標儀在波長450nm下測定光密度值(OD值)，計算抑制百分率(PI)。10、權利要求1所述鹿流行性出血病病毒抗體竟爭酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒用于鹿流行性出血病的診斷、檢疫、檢測和流行病學調(diào)查。全文摘要一種鹿流行性出血病競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒及其制備方法和用途，該試劑盒包括EHDV抗原包被ELISA板、單克隆抗體IgG-HRP酶結合物、陽性血清、陰性血清、20倍濃縮洗滌液、10倍濃縮稀釋液、底物I、底物II、底物III、終止液。制備方法包括a、制備鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原，并檢定鹿流行性出血病病毒ELISA包被抗原的安全性；b、制備抗鹿流行性出血病病毒的單克隆抗體，并對抗體辣根過氧化酶(HRP)酶結合物進行制備與鑒定；c、制備陽性血清和陰性血清；d、制備鹿流行性出血病病毒抗原包被的ELISA板；e、制備20倍濃縮洗滌液和10倍濃縮稀釋液，并制備底物I、底物II、底物III及終止液；f、組裝試劑盒。本發(fā)明的試劑盒用于鹿流行性出血病的診斷、檢疫、檢測和流行病學調(diào)查，具有特異性強，敏感性高等特點。文檔編號G01N33/535GK101672849SQ200910190438公開日2010年3月17日申請日期2009年9月16日優(yōu)先權日2009年9月16日發(fā)明者呂建強,曾少靈,楊云慶,楊俊興,林慶燕,秦智鋒,花群義,阮周曦,兵陳,虹陶申請人:花群義