專利名稱：靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：
酪氨酸激酶在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中占據(jù)了十分重要的地位，調(diào)節(jié)著細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)、分化、死亡等一系列生理過(guò)程，其異常表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。此外，酪氨酸激酶的異常表達(dá)還與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移、腫瘤新生血管的生成、腫瘤的化療抗性密切相關(guān)，以酪氨酸激酶為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物研發(fā)已成為國(guó)際上抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)。
酪氨酸激酶包括受體型和非受體型兩種，受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)是最大的一類酶聯(lián)受體，它既是受體，又是酶，能夠與配體結(jié)合，并將靶蛋白的酪氨酸殘基磷酸化。已發(fā)現(xiàn)50多種不同的RTKs，主要類型包括①表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)受體，包括EGFR、HER2、ErbB4等成員；②血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growthfactor，PDGF)受體，包括PDGFRα、PDGFRβ、集落刺激因子1受體、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(Stem cell factor receptor，SCFR/KIT)、FLK2/FLT3等成員；③胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin and insulin-like growth factor-1，IGF-1)受體，包括胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor I receptor，IGF-1R)等成員；④神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)受體；⑤成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)受體；⑥血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)受體，包括VEGFR1(FLT-1)、VEGFR2(KDR/Flk-1)、VEGFR3(Flt-4)等成員。
目前，腫瘤治療的靶向治療藥物主要有兩類，一類是受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物(Tyrosine Kinase Inhibitor，TKI)，主要包括吉非替尼(Gefitinib，Ireasa)、厄洛替尼(Erlotinib，Taceva)等；另一類是單克隆抗體類靶向藥物，包括西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(Vectibix)等。受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，與受體胞內(nèi)段激酶結(jié)合區(qū)結(jié)合，從而抑制受體的磷酸化，阻斷受體下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)，發(fā)揮抗腫瘤作用。
TKI類靶向藥物的療效雖得到廣泛認(rèn)可，但患者用藥后藥效的個(gè)體差異很大。大量的臨床研究已經(jīng)證實(shí)，TKI的療效/毒副作用與患者體內(nèi)某些受體酪氨酸激酶相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平直接相關(guān)，它們分別是 (1)靶向治療與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR) 表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是靶向治療的主要靶標(biāo)，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)的作用于EGFR的靶向藥物包括EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)以及抗EGFR抗體藥.但臨床運(yùn)用表明這些靶向藥物僅對(duì)部分病人有效.臨床研究已經(jīng)證實(shí)以EGFR通路為靶標(biāo)的靶向藥物療效與腫瘤組織中EGFR基因mRNA表達(dá)水平密切相關(guān)，即EGFR基因表達(dá)水平高的患者對(duì)靶向藥物敏感，反之表達(dá)水平低的患者表現(xiàn)藥效較低.因此，美國(guó)國(guó)家癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)2009年臨床指南中推薦患者在接受靶向藥物治療之前，進(jìn)行EGFR基因表達(dá)水平檢測(cè)，確定是否接受靶向治療，降低治療費(fèi)用，節(jié)省寶貴的醫(yī)治時(shí)間. (2)伊馬替尼與干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(Stem cell factor receptor，SCFR/KIT) 干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(Stem cell factor receptor，SCFR/KIT)是血小板源性生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)家族成員之一，c-KIT原癌基因編碼的KIT蛋白是一種跨膜糖蛋白，屬于受體酪氨酸激酶家族。研究表明，KIT基因表達(dá)產(chǎn)物及其配體是人類多種組織細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)控因素，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate，STI571，格列衛(wèi))，屬2-苯基-氨基嘧啶的衍生物，是一種小分子口服受體酪氨酸激酶抑制劑。2002年經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于臨床，已成功應(yīng)用于胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)和慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)，臨床療效令人振奮。其作用機(jī)理在于藥物結(jié)合于KIT蛋白胞漿內(nèi)酪氨酸激酶功能區(qū)的ATP結(jié)合位點(diǎn)，阻斷磷酸基團(tuán)由ATP向底物酪氨酸殘基的轉(zhuǎn)移，從而抑制細(xì)胞增殖并恢復(fù)細(xì)胞凋亡程序。
大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中都有KIT蛋白表達(dá)，而且表達(dá)水平差異很大。臨床研究已證實(shí)KIT表達(dá)水平與胃腸道間質(zhì)瘤伊馬替尼療效和生存期呈正相關(guān)，即表達(dá)水平高的患者對(duì)伊馬替尼藥物敏感，反之表達(dá)水平低的患者表現(xiàn)部分耐藥。因此，ASCO報(bào)道特別提醒胃腸道間質(zhì)瘤應(yīng)用伊馬替尼前必須檢測(cè)證實(shí)KIT陽(yáng)性。
(3)靶向治療與胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor I receptor，IGF-1R) 胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF-1R)是靶向治療的重要靶標(biāo)，IGF-1R的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。抑制IGF-1R的活性，可以有效控制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)腫瘤對(duì)化療、放療的敏感性。以IGF-1R為靶標(biāo)的治療主要有IGF-1R單克隆抗體、反義寡核苷酸、IGF-1R單克隆抗體、小分子激酶抑制劑等。IGF-1R的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)還可引起細(xì)胞的惡性化以及細(xì)胞粘附性的改變。目前IGF-1R已經(jīng)成為特異性治療腫瘤的熱點(diǎn)靶標(biāo)。大量臨床研究表明IGF-IR在結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、食管癌、胃癌等惡性腫瘤組織中都呈現(xiàn)高表達(dá)。臨床研究顯示IGF-1R與經(jīng)吉非替尼治療的NSCLC患者較長(zhǎng)存活顯著相關(guān)。腫瘤患者檢測(cè)IGF-1R mRNA表達(dá)水平，對(duì)臨床上靶向藥物的選擇、用藥量、靶向藥物敏感性的確定及預(yù)后的判斷有著重要的意義，同時(shí)提高靶向治療的有效性，為患者爭(zhēng)取更多寶貴的醫(yī)治時(shí)間，大幅節(jié)省醫(yī)治費(fèi)用。
(4)靶向藥物與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(VEGFR) 血管生成是人體腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的必要條件，抑制腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成已成為近年來(lái)尋找新型抗腫瘤藥物的重要研究方向。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)及其受體(VEGFR)是血管生成抑制劑靶向治療的主要靶標(biāo)。血管生成抑制劑的藥物作用機(jī)理主要是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成來(lái)達(dá)到阻止腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的目的。目前FDA批準(zhǔn)的此類藥物包括舒尼替尼、索拉非尼和貝伐單抗等。
VEGFR家族的成員主要包括VEGFR1(FLT-1)、VEGFR2(KDR/Flk-1)、VEGFR3(Flt-4)，VEGFR1在血細(xì)胞生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而VEGFR2在促有絲分裂、血管生成和VEGF滲透性效果的提高中起著主要調(diào)節(jié)作用。
臨床研究已證實(shí)，VEGFR2可作為結(jié)腸癌病人使用5-FU或卡培他濱和奧沙利鉑或貝伐單抗(FOLFOX/BV或XELOX/BV)聯(lián)合治療方案臨床療效獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子，其治療療效與VEGFR2基因表達(dá)水平密切相關(guān)，即VEGFR2基因表達(dá)水平高的患者的中位無(wú)進(jìn)展生存期較長(zhǎng)，而VEGFR2基因表達(dá)水平低的患者中位無(wú)進(jìn)展生存期較低。因此患者在接受靶向藥物治療之前，進(jìn)行VEGFR基因表達(dá)水平檢測(cè)，從而確定是否接受靶向治療，可以降低治療費(fèi)用，節(jié)省寶貴的醫(yī)治時(shí)間。
(5)靶向治療與血小板源性生長(zhǎng)因子受體(PDGFRB) 受體酪氨酸激酶抑制劑類藥物是對(duì)具有抑制受體酪氨酸激酶活性的藥物的總稱，目前，靶向PDGFRB的常用受體酪氨酸激酶抑制劑有舒尼替尼和索拉替尼、伊馬替尼，是目前臨床上最常用的腫瘤化療藥物。其藥理作用主要是一方面通過(guò)抑制RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，直接抑制腫瘤生長(zhǎng)；另一方面通過(guò)抑制PDGFR和VEGFR而阻斷腫瘤新生血管的形成，間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
PDGFRB是PDGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要成員，包括PDGFRα和PDGFRβ兩種，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及新生血管形成等方面起重要作用。PDGFRB在惡性腫瘤中均有表達(dá)，但是在不同的癌細(xì)胞中的表達(dá)量不同。臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，PDGFR低表達(dá)患者較高表達(dá)者有更好的3年無(wú)進(jìn)展生存率和3年總生存率。因此，患者在接受靶向PDGFRB的酪氨酸激酶抑制劑治療前進(jìn)行PDGFRB mRNA表達(dá)水平檢測(cè)是非常必要的。
(6)靶向治療與原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2) HER-2即CerbB2基因，是EGFR家族成員之一。HER-2蛋白是原癌基因CerbB2(HER-2/neu)編碼的具有受體酪氨酸激酶(RTK)活性的跨膜糖蛋白，分子量185kDa，簡(jiǎn)稱p185，屬表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶家族，能啟動(dòng)酪氨酸激酶調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。赫賽汀(Herceptin，也稱為曲妥珠單抗，trastuzumab，羅氏制藥)是一種針對(duì)HER-2/neu原癌基因產(chǎn)物的人源化單克隆抗體，能特異結(jié)合于HER2受體胞外段干擾HER-2與其它ErbB家族成員形成異源二聚體，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。赫賽汀1998年獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市用于治療HER-2過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌。作為與乳腺癌的轉(zhuǎn)移預(yù)后密切相關(guān)的基因之一，HER2受體的過(guò)表達(dá)是乳腺癌的發(fā)病機(jī)制的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，成為目前研究的熱點(diǎn)之一。
研究表明，HER-2mRNA水平與乳腺癌的浸潤(rùn)性有關(guān)，HER-2RNA過(guò)表達(dá)的乳腺癌浸潤(rùn)性強(qiáng)，無(wú)病生存期短，預(yù)后差。北美乳腺癌協(xié)作組的一項(xiàng)研究指出確定可手術(shù)乳腺癌患者的HER-2表達(dá)水平時(shí)，可以檢測(cè)該基因RNA表達(dá)量，并且可以代替標(biāo)準(zhǔn)的IHC蛋白表達(dá)檢測(cè)法。多項(xiàng)研究表明赫賽汀的療效與HER2mRNA和蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。在第44屆美國(guó)臨床腫瘤學(xué)年會(huì)(ASCO)上報(bào)告的最新數(shù)據(jù)顯示在晚期(轉(zhuǎn)移性)乳腺癌的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，HER2RNA過(guò)表達(dá)的患者在接受赫賽汀治療時(shí)有較長(zhǎng)的無(wú)疾病進(jìn)展生存時(shí)間，且在用赫賽汀治療中出現(xiàn)疾病進(jìn)展而需要進(jìn)一步治療的婦女中，使用赫賽汀治療仍然有效。(7)持家基因β2-微球蛋白(B2M)、鐵傳遞蛋白受體(TFRC)和TATA框結(jié)合蛋白(TBP) 持家基因一般在體內(nèi)可穩(wěn)定表達(dá)，但由于這種穩(wěn)定表達(dá)是相對(duì)的，在一定的病理狀態(tài)或用藥情況下，某些常用的持家基因的表達(dá)也會(huì)發(fā)生變化.選擇在我們所研究對(duì)象中穩(wěn)定表達(dá)的基因作持家基因，對(duì)保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要.因此，本發(fā)明從一定數(shù)量的常用持家基因中進(jìn)行篩選，確定3個(gè)合適的持家基因，分別是β2-微球蛋白(B2M)、鐵傳遞蛋白受體(TFRC)、TATA框結(jié)合蛋白(TBP). 基于以上基因的表達(dá)水平與受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效的相關(guān)性，專家推薦患者在接受靶向藥物之前，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行相關(guān)的基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)，幫助臨床醫(yī)生根據(jù)患者的個(gè)體差異制定個(gè)體化用藥方案，以提高藥物療效，減少藥物毒副作用的發(fā)生。
目前，對(duì)基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)主要有逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、RNA原位核酸雜交(RISH)等。其中，RISH主要用于分析組織或細(xì)胞內(nèi)RNA分布以了解特定基因的表達(dá)情況，且其過(guò)程較長(zhǎng)、操作繁瑣，不適合用于臨床應(yīng)用；而逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，首先，這兩種方法均需要進(jìn)行RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄，檢測(cè)的結(jié)果受RNA降解影響大；其次，這兩種方法只通過(guò)一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，容易產(chǎn)生非特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性高；再次，這兩種方法一般只有一個(gè)持家基因作對(duì)照，其準(zhǔn)確性容易受到病理狀態(tài)的影響；因此，逆轉(zhuǎn)錄定量PCR法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法作為臨床應(yīng)用均存在著難以克服的技術(shù)缺陷。
液相芯片技術(shù)利用聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，在微球的制造過(guò)程中，摻入不同比例的染色劑，從而形成100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價(jià)結(jié)合了針對(duì)不同待檢測(cè)物的探針?lè)肿訌亩鴮?shí)現(xiàn)對(duì)多達(dá)100中待檢物質(zhì)的同步并行檢測(cè)。因此，我們采用液相芯片技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的高通量，大大提高了檢測(cè)效率。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平液相檢測(cè)芯片，該液相芯片可用于檢測(cè)以下10種目標(biāo)基因的表達(dá)水平EGFR、KIT、IGF-1R、VEGFR1(FLT1)、VEGFR2(KDR)、PDGFRB、HER-2、B2M、TFRC、TBP。
實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下 一種受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，主要包括有 (1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5’端的間隔臂序列和3’端的與支持延伸探針互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P1，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.10，每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼； (2)連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針主要包括5’端能與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3’端能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對(duì)EGFR基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.16中的2條或2條以上、針對(duì)KIT基因的選自SEQ.NO.17-SEQ.NO.22中的2條或2條以上、針對(duì)IGF-1R基因的選自SEQ.NO.23-SEQ.NO.28中的2條或2條以上、針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ.NO.29-SEQ.NO.33中的2條或2條以上、針對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ.NO.34-SEQ.NO.38中的2條或2條以上、針對(duì)PDGFRB基因的選自SEQ.NO.39-SEQ.NO.43中的2條或2條以上、和/或針對(duì)HER-2基因的選自SEQ.NO.44-SEQ.NO.48中的2條或2條以上；以及所述支持延伸探針的特異性序列P2還包括有針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.49-SEQ.NO.53中的2條或2條以上、針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.54-SEQ.NO.58中的2條或2條以上、和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.59-SEQ.NO.63中的2條或2條以上； (3)擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針包括有5’端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3’端序列P5，3’端還修飾有生物素；所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4包括有針對(duì)EGFR基因的選自SEQ.NO.64-SEQ.NO.76中的5條或5條以上、針對(duì)KIT基因的選自SEQ.NO.77-SEQ.NO.86中的5條或5條以上、針對(duì)IGF-1R基因的選自SEQ.NO.87-SEQ.NO.97中的5條或5條以上、針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ.NO.98-SEQ.NO.107中的5條或5條以上、針對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ.NO.108-SEQ.NO.117中的5條或5條以上、針對(duì)PDGFRB基因的選自SEQ.NO.118-SEQ.NO.127中的5條或5條以上、針對(duì)HER-2基因的選自SEQ.NO.128-SEQ.NO.137中的5條或5條以上；以及所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4還包括有針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.138-SEQ.NO.147中的5條或5條以上、針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.148-SEQ.NO.157中的5條或5條以上、和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.158-SEQ.NO.167中的5條或5條以上；所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)、探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列。
或者，主要包括 (1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5’端的間隔臂序列和3’端的與支持延伸探針互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P1，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.10，每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼； (2)連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針主要包括5’端能與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3’端能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對(duì)EGFR基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.16中的2條或2條以上、針對(duì)KIT基因的選自SEQ.NO.17-SEQ.NO.22中的2條或2條以上、針對(duì)IGF-1R基因的選自SEQ.NO.23-SEQ.NO.28中的2條或2條以上、針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ.NO.29-SEQ.NO.33中的2條或2條以上、針對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ.NO.34-SEQ.NO.38中的2條或2條以上、針對(duì)PDGFRB基因的選自SEQ.NO.39-SEQ.NO.43中的2條或2條以上、和/或針對(duì)HER-2基因的選自SEQ.NO.44-SEQ.NO.48中的2條或2條以上；以及所述支持延伸探針的特異性序列P2還包括有針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.49-SEQ.NO.53中的2條或2條以上、針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.54-SEQ.NO.58中的2條或2條以上、和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.59-SEQ.NO.63中的2條或2條以上； (3)擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針包括有5’端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3’端序列P5；所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4包括有針對(duì)EGFR基因的選自SEQ.NO.64-SEQ.NO.76中的5條或5條以上、針對(duì)KIT基因的選自SEQ.NO.77-SEQ.NO.86中的5條或5條以上、針對(duì)IGF-1R基因的選自SEQ.NO.87-SEQ.NO.97中的5條或5條以上、針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ.NO.98-SEQ.NO.107中的5條或5條以上、針對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ.NO.108-SEQ.NO.117中的5條或5條以上、針對(duì)PDGFRB基因的選自SEQ.NO.118-SEQ.NO.127中的5條或5條以上、針對(duì)HER-2基因的選自SEQ.NO.128-SEQ.NO.137中的5條或5條以上；以及所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4還包括有針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.138-SEQ.NO.147中的5條或5條以上、針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.148-SEQ.NO.157中的5條或5條以上、和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.158-SEQ.NO.167中的5條或5條以上；所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)、探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列；和 (4)標(biāo)記探針，所述標(biāo)記探針具有與擴(kuò)增延伸探針P5互補(bǔ)配對(duì)的序列，且末端具有生物素修飾。
優(yōu)選地，所述的受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，還包括有填充序列，包括針對(duì)EGFR基因的SEQ.NO.168、針對(duì)KIT基因的SEQ.NO.169、針對(duì)IGF-1R基因的選自SEQ.NO.170-SEQ.NO.175中的1條或1條以上、針對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ.NO.176-SEQ.NO.181中的1條或1條以上、針對(duì)PDGFRB基因的選自SEQ.NO.182-SEQ.NO.187中的1條或1條以上、針對(duì)HER-2基因的選自SEQ.NO.188-SEQ.NO.191中的1條或1條以上；針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.192-SEQ.NO.199中的1條或多條、和/或針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.200-SEQ.NO.203中的1條或多條。
優(yōu)選地，所述間隔臂序列為5-10個(gè)T；所述P5的組成為CCTATGCCTCCCGTGTCTA。
本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測(cè)受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的方法。
具體技術(shù)方案如下 一種檢測(cè)受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的方法，使用上述液相芯片，主要包括以下步驟 (一)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液； (二)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴(kuò)增延伸探針密封于雜交板中，54℃±1℃，600rpm震蕩孵育過(guò)夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的P1互補(bǔ)結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合，從而將目標(biāo)mRNA結(jié)合到微球上；擴(kuò)增延伸探針帶有生物素標(biāo)記，擴(kuò)增延伸探針的P4與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大； (三)步驟(二)的產(chǎn)物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)； (四)通過(guò)熒光檢測(cè)儀檢測(cè)。
或者，主要包括以下步驟 (一)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液； (二)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴(kuò)增延伸探針密封于雜交板中，54℃±1℃，600rpm震蕩孵育過(guò)夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的P1結(jié)合互補(bǔ)結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合，從而將目標(biāo)mRNA結(jié)合到微球上；擴(kuò)增延伸探針的P4與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合； (三)再加入標(biāo)記探針，標(biāo)記探針帶有生物素標(biāo)記，50℃±1℃，600rpm震蕩孵育1小時(shí)，標(biāo)記探針與擴(kuò)增延伸探針的序列P5互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大； (四)步驟(三)的產(chǎn)物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)； (五)通過(guò)熒光檢測(cè)儀檢測(cè)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于 (1)本發(fā)明所設(shè)計(jì)的各種探針，能夠在均一的反應(yīng)條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)，且各種探針之間基本不存在非特異性結(jié)合；所設(shè)計(jì)的探針在檢測(cè)中特異性好、信噪比高.同時(shí)，多種探針的組合使用使液相芯片和檢測(cè)方法形成一個(gè)檢測(cè)效果完好的系統(tǒng).運(yùn)用本發(fā)明所述的液相芯片和檢測(cè)方法，對(duì)mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)的，無(wú)需RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR等步驟，檢測(cè)結(jié)果受樣本中RNA的質(zhì)量影響較小，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；另一方面，以多個(gè)持家基因作對(duì)照(n≥3)，檢測(cè)結(jié)果不易受病理狀態(tài)的影響，準(zhǔn)確性高使檢測(cè)結(jié)果更為可靠. (2)本發(fā)明使用的是探針的多位點(diǎn)特異配對(duì)、級(jí)聯(lián)放大的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大，而不是PCR擴(kuò)增的方法，提高了檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的特異性，避免了逆轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的假陽(yáng)性。
(3)本發(fā)明所述的液相芯片和檢測(cè)方法適用于新鮮組織、石蠟包埋固定組織、組織切片、穿刺組織等樣本類型，對(duì)比起其他的mRNA檢測(cè)方法，有著操作簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確性高、特異性高的特點(diǎn)。
(4)本發(fā)明可在一次反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)多種基因mRNA表達(dá)的同步并行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)真正的高通量高內(nèi)涵檢測(cè)。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片試劑盒，主要包括有 一、偶聯(lián)有支持探針(SP)的微球 支持探針由三部分組成，5’端是與微球結(jié)合的胺基端，3’端是與支持延伸探針結(jié)合的特異序列P1，長(zhǎng)度為16nt，中間是間隔序，所述間隔臂為用于將支持探針與微球表面間隔開(kāi)來(lái)，在支持延伸探針與擴(kuò)增延伸探針內(nèi)部也存在間隔臂序列，通過(guò)在探針序列與氨基之間、探針內(nèi)部設(shè)置適當(dāng)長(zhǎng)度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。本發(fā)明支持探針的間隔臂優(yōu)選為5-10個(gè)T，更為優(yōu)選的是8個(gè)T。每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，并選用一條支持探針，每種微球具有不同的熒光編碼。每個(gè)目標(biāo)基因的支持探針如表1所示 表1不同的目標(biāo)基因及其選用微球的編號(hào)、支持探針(SP) 所有探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成的支持探針用滅菌ddH2O配成100nmol/ml的貯存液。微球包被的過(guò)程如下 分別取5×106個(gè)上述編號(hào)的羧基化的微球(購(gòu)自Luminex公司)懸浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的捕獲探針(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(購(gòu)自Pierce Chemical公司)工作液。往微球懸液中加入2.5ul的EDC工作液，恒溫孵育30分鐘，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒溫孵育30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用0.02％的Tween-20洗滌一次，再用0.1％的SDS液洗滌一次。將洗滌后的包被有支持探針的微球重懸于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/LEDTA]中，2-8℃避光保存。
二、與目標(biāo)基因mRNA特異結(jié)合的支持延伸探針(SE)、擴(kuò)增延伸探針(AE) 1)支持延伸探針(SE)是連接支持探針(SP)與目標(biāo)基因mRNA之間的序列，SE由三部分組成，5’端是能與目標(biāo)基因結(jié)合的特異序列P2，長(zhǎng)度介于17nt至27nt，3’端是能與支持探針5’端通過(guò)堿基互補(bǔ)結(jié)合的特異序列P3，中間是間隔序列，本發(fā)明的支持延伸探針間隔臂優(yōu)選為5-10個(gè)T，更為優(yōu)選的是5個(gè)T。每個(gè)目標(biāo)基因分別設(shè)計(jì)5至6條支持延伸探針，以提高檢測(cè)的特異性。使用時(shí)，針對(duì)每種目標(biāo)基因，選擇2條或2條以上支持延伸探針即可完成檢測(cè)，特異性和穩(wěn)定性都很好(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)省略)，優(yōu)選于使用5條或6條支持延伸探針，以使特異性達(dá)到最好。合成后的每條探針?lè)謩e用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的貯存液。目標(biāo)基因的支持延伸探針(SE)見(jiàn)表2。
表2目標(biāo)基因的支持延伸探針(SE)


2)擴(kuò)增延伸探針(AE)是連接目標(biāo)基因mRNA與信號(hào)檢測(cè)組分之間的序列，AE由三部分組成，5’端是能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4，3’端是能與標(biāo)記探針互補(bǔ)配對(duì)的序列P5，(如不運(yùn)用標(biāo)記探針檢測(cè)時(shí)，則3’端還修飾有生物素)，中間是5個(gè)寡聚核苷酸T的間隔臂序列(本發(fā)明的擴(kuò)增延伸探針間隔臂優(yōu)選為5-10個(gè)T，更為優(yōu)選的是5個(gè)T)。目標(biāo)基因的擴(kuò)增延伸探針(AE)見(jiàn)表3。所述P5的設(shè)計(jì)按照本領(lǐng)域的探針設(shè)計(jì)的公知常識(shí)，其為不存在內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間都不形成二聚體、不存在錯(cuò)配，與P1、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列，本發(fā)明優(yōu)選為堿基組成為CCTATGCCTCCCGTGTCTA。
每個(gè)目標(biāo)基因分別設(shè)計(jì)10至13條擴(kuò)增延伸探針，從而將檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行級(jí)聯(lián)放大。合成后的每條探針?lè)謩e用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的貯存液。使用時(shí)，針對(duì)每種目標(biāo)基因，選擇5條或5條以上擴(kuò)增延伸探針即可完成檢測(cè)，特異性和穩(wěn)定性都很好(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)省略)，優(yōu)選于使用10條或12條擴(kuò)增延伸探針，以使特異性達(dá)到最好。
表3目標(biāo)基因的擴(kuò)增延伸探針(AE)



3)填充序列(FS)，將目標(biāo)基因mRNA中沒(méi)有與SE、AE特異結(jié)合的區(qū)域封閉，以減少后續(xù)反應(yīng)中生物素或標(biāo)記探針的非特異性結(jié)合，從而減少檢測(cè)背景。填充序列的Tm值應(yīng)與SE、AE接近，如表4所示。
表4目標(biāo)基因的填充序列(FS)


三、標(biāo)記探針(LP) 標(biāo)記探針(LP)由兩部分組成，其3’端是能與擴(kuò)增延伸探針序列P5互補(bǔ)結(jié)合的序列，5’端帶有生物素標(biāo)記，通過(guò)與擴(kuò)增延伸探針結(jié)合實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大。
表5標(biāo)記探針
實(shí)施例2運(yùn)用受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片對(duì)臨床樣本的檢測(cè) 所述各種溶液的配方如下
一、裂解樣本釋放總RNA 1.將FFPE腫瘤組織切片從載玻片上刮下，放入1.5ml離心管中，加入300ul勻漿緩沖液和3ul蛋白酶K(50ug/ul)，混合均勻，65℃消化2h。
2.消化2h后的樣品，室溫下13,000rpm離心5分鐘，吸取中間澄清的溶液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中備用.(如溶液仍不澄清，則重復(fù)本步驟1～2次.) 二、目標(biāo)mRNA通過(guò)與探針特異性結(jié)合固定在微球上 1.取出探針工作液于室溫融解，然后在95℃變性5分鐘，馬上置于冰上。
2.按下表配制工作液，混合均勻
3.將上述配制好的工作液分裝至雜交板上，60ul/孔。然后將上述處理好的樣品以40ul/孔分別加入雜交板中；空白對(duì)照加入勻漿緩沖液40ul/孔。密封雜交板，54℃±1℃，600rpm震蕩孵育過(guò)夜(16-22h)。
4.用洗滌緩沖液潤(rùn)濕濾板1分鐘，除去洗滌緩沖液。
5.將雜交板取出，500×g離心1分鐘，將反應(yīng)液全部轉(zhuǎn)移至濾板中。
6.除去溶液，用200ul洗滌緩沖液洗滌3次。
三、通過(guò)雜交反應(yīng)將目標(biāo)RNA信號(hào)放大 1.加入標(biāo)記探針工作液100ul/孔。50℃±1℃，600rpm震蕩孵育1小時(shí)。
2.除去溶液，用200ul洗滌液洗滌2次。
四、與SA-PE結(jié)合，并在液相芯片閱讀儀上檢測(cè) 1.加入SA-PE工作液100ul/孔，600rpm震蕩室溫孵育30min。
2.除去溶液，用200ul SA-PE洗滌液洗滌2次。
3.加入SA-PE洗滌液130ul/孔。室溫，600rpm震蕩孵育2至5分鐘。
4.在液相芯片儀上讀取數(shù)據(jù)。
五、數(shù)據(jù)分析 在10個(gè)目標(biāo)基因中，標(biāo)志基因7個(gè)，分別是EGFR、KIT、IGF-1R、VEGFR1、VEGFR2、PDGFRB、HER-2； 持家基因3個(gè)，分別是B2M、TFRC、TBP； 將讀取的熒光值按照以下方法進(jìn)行均一化處理 步驟1獲得原始數(shù)據(jù)(MFI值) 步驟2樣品的MFI減去空白孔N的MFI＝net MFI 步驟3每個(gè)樣品的三個(gè)持家基因的net MFI值分別取幾何平均值，得到相應(yīng)的G1、G2、G3......Gn 步驟4每個(gè)樣品目標(biāo)基因mRNA的net MFI除以對(duì)應(yīng)的Gn得到相應(yīng)的Nn.Nn即為已排除上樣量差異，可在樣品間進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量比較的數(shù)值. 本實(shí)施例中對(duì)10例樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下所示 表6空白孔N與10例樣品原始數(shù)據(jù)(MFI值) 表7 10例樣品各基因的相對(duì)表達(dá)量 實(shí)施例3不同間隔臂的液相芯片對(duì)受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 一、液相芯片制備的設(shè)計(jì)(間隔臂的選擇)以B2M、EGFR、IGF-1R檢測(cè)液相芯片的支持探針為例，分別選用不同的間隔臂，具體設(shè)計(jì)如表8所示。探針SP、SE與AE的合成、SP序列包被微球、檢測(cè)方法等如實(shí)施例1和實(shí)施例2所述。
表8間隔臂及其長(zhǎng)度 二、樣品檢測(cè) 采用上述設(shè)計(jì)制備的液相芯片，按實(shí)施例2所述檢測(cè)過(guò)程和方法對(duì)樣品11-15進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下(表中數(shù)據(jù)為檢測(cè)熒光值) 表9a樣品B2M檢測(cè)結(jié)果(檢測(cè)熒光值<MFI值>)
表9b樣品EGFR檢測(cè)結(jié)果(檢測(cè)熒光值<MFI值>)
表9c樣品IGF-1R檢測(cè)結(jié)果(檢測(cè)熒光值<MFI值>)

將4組設(shè)計(jì)的檢測(cè)熒光值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，證明4組設(shè)計(jì)的檢測(cè)效果沒(méi)有差異。因此，這4種間隔臂的設(shè)計(jì)是等效的。
其它針對(duì)支持延伸探針、擴(kuò)增延伸探針內(nèi)部不同的間隔序列的液相芯片，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。
實(shí)施例4標(biāo)記探針的運(yùn)用 液相芯片制備的設(shè)計(jì)(信號(hào)檢測(cè)組分) 所述信號(hào)檢測(cè)組分有兩種選擇，1)擴(kuò)增延伸探針3’端序列P5的3’端帶有生物素標(biāo)記；2)擴(kuò)增延伸探針3’端序列P5與標(biāo)記探針(LP)通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，同時(shí)標(biāo)記探針的5’端帶有生物素標(biāo)記。這兩種信號(hào)檢測(cè)組分均能實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，檢測(cè)到正常信號(hào)。其中，使用標(biāo)記探針的生物素活性更加穩(wěn)定，效果較優(yōu)。
以所述液相芯片的檢測(cè)B2M、EGFR、IGF-1R基因的兩種信號(hào)檢測(cè)組分為例，具體設(shè)計(jì)如表10所示。即所述液相芯片的組成為 實(shí)驗(yàn)組1支持探針偶聯(lián)的微球、支持延伸探針、填充序列同實(shí)施例1，擴(kuò)增延伸探針具有生物素標(biāo)記；沒(méi)有標(biāo)記探針； 實(shí)驗(yàn)組2支持探針偶聯(lián)的微球、支持延伸探針、填充序列、標(biāo)記探針同實(shí)施例1，擴(kuò)增延伸探針不具有生物素標(biāo)記。
表10信號(hào)檢測(cè)組分
二、樣品檢測(cè) 采用上述設(shè)計(jì)制備的液相芯片，按實(shí)施例2所述檢測(cè)過(guò)程和方法對(duì)樣品16-20進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下(表中數(shù)據(jù)為檢測(cè)熒光值) 表11樣品檢測(cè)結(jié)果(檢測(cè)熒光值<MFI值>)
將兩組設(shè)計(jì)的檢測(cè)熒光值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，證明兩組設(shè)計(jì)的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有差異，因此，這兩種信號(hào)檢測(cè)組分對(duì)信號(hào)的檢測(cè)是等效的。其中，使用標(biāo)記探針的信號(hào)檢測(cè)組分，由于其生物素的活性更為穩(wěn)定，效果較優(yōu)。
以上是針對(duì)本發(fā)明的可行實(shí)施例的具體說(shuō)明，但該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的專利范圍中。
序列表
<110>廣州益善生物技術(shù)有限公司
<120>靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片和檢測(cè)方法
<160>204
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
caaatcacaa taatca16
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<213>人工序列
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tcaatcaatc atcaac16
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caatttactc atatac16
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<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cataatctca taatcc16
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ctcaacaatc tttctt16
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
tctaacttca ctatta16
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<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
catattacat tcacat16
<210>8
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ctttctttaa tctcaa16
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cattcaaatc tcaact16
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<212>DNA
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caattacttc aaatct16
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<211>23
<212>DNA
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ccatcgacat gttgctgaga aag23
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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cagttctcct ctcctgcacc c 21
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<212>DNA
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ggcagcagtc actggggga19
<210>14
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<212>DNA
<213>人工序列
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gcacgtggct tcgtctcgg19
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
ccctcggggt tcacatccat 20
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
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cacaggctcg gacgcacg18
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<211>26
<212>DNA
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aaggaagttg tgttgggtct atgtaa26
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<212>DNA
<213>人工序列
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aacaaccttc ccgaaagctc c21
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<212>DNA
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cactcggctt gagcatcttt aca23
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<212>DNA
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gcaggctcca agtagattca caa23
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<212>DNA
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gctttgaaca aataaatgaa tcacg25
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<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
cataagaaac tccaggtttc atgtcc26
<210>23
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<212>DNA
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<400>23
ccggaccacg ctctgctg18
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
tgttctggtt ccaaagacag gtca24
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<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
agccctgagg gtgccgc17
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<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
gcaaaggggc tcttgggc 18
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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caaggacctg gattcctggc20
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
ctgaccagca aaaaagccgt a 21
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
accccggtgt cccagtagct20
<210>30
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
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gccttttaaa ctcagttcag gatctt26
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<212>DNA
<213>人工序列
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atttatgggc tgcttccccc20
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<213>人工序列
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cagaattgtt tgccatttct tccac25
<210>33
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
ccttcttctt tgaagtaggt acagcta27
<210>34
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
gctccaaggt caggaagtcc tt 22
<210>35
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
aggtccctgt ggatacactt tcg 23
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
gatctttata aatatcccgg gcca 24
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<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
gacgtcactc tggattgtgt acactc26
<210>38
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
agttccttct ttcaatcgcc tacaa 25
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<212>DNA
<213>人工序列
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accacctcat tcccgatcac aa22
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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caagaggaag tcagtcaccg gc22
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
attgcaggtg taggtccccg a21
<210>42
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
cgcacgtagc cgctctcaa19
<210>43
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
ttcgccagcg ctggagtc18
<210>44
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
acacagctgg cgccgaat18
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
tcttggttgt gcagggggc19
<210>46
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
agaccatagc acactcgggc a21
<210>47
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
agaaatgcca ggctcccaaa ga 22
<210>48
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
agagtctcaa acacttggag ctgc24
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
aaggccacgg agcgagacat20
<210>50
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
ccattctctg ctggatgacg tg 22
<210>51
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>51
gctgaaagac aagtctgaat gctc24
<210>52
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
ttaactatct tgggctgtga caaag25
<210>53
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
ggagacagca ctcaaagtag aatta 25
<210>54
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>54
acaatagccc aagtagccaa tcat24
<210>55
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>55
tcggttcctg ccagtctctc ac22
<210>56
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>56
tctccgacaa ctttctcttc aggt 24
<210>57
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>57
ccagcctcac gagggacata t 21
<210>58
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>58
acgccagact ttgctgagtt taa23
<210>59
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>59
cgaagtgcaa tggtctttag gtca24
<210>60
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>60
cgtggttcgt ggctctctta tcc 23
<210>61
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>61
tattttcttg ctgccagtct gg 22
<210>62
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>62
catcacagct ccccaccata ttct 24
<210>63
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>63
caattctggg tttgatcatt ctgtag26
<210>64
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>64
gcagctgccc aggtggtt18
<210>65
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>65
tgggacagct tggatcacac ttt 23
<210>66
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>66
ggcacagatg attttggtca gtttc25
<210>67
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>67
gcagcgcccg gagcact17
<210>68
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>68
agcctgcagc acactggttg 20
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<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>69
ctctcccggg ggcctgt17
<210>70
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>70
gcggcagacc aggcagt17
<210>71
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>71
agtggggggc aggtgtcc18
<210>72
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>72
ggtacgtggt ggggttgtag agc23
<210>73
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>73
gcaggtggca ccaaagctgt att23
<210>74
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>74
tcaccacata attacgggga cact24
<210>75
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>75
ttcctccatc tcatagctgt cgg23
<210>76
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>76
gcccttcgca cttcttacac ttg23
<210>77
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>77
gcctgtttct gggaaactcc c21
<210>78
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>78
cacccagggt tttcccaaaa c21
<210>79
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>79
aattaagcca taagcagttg cct 23
<210>80
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>80
cagtcatggc cgcatctgac20
<210>81
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>81
ggcttcccgt tctgtcaaat g21
<210>82
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>82
ccaaggtaac tcaggacttt gagttc26
<210>83
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>83
cagggtgggc cctccaat18
<210>84
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>84
aattcaaaag atcaccatag caaca25
<210>85
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>85
gcagaagatt cttataaagt gcagct26
<210>86
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>86
actcattagt actatcgctg caggaa26
<210>87
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>87
agggccacaa caggccct18
<210>88
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>88
cgccagtgcg aaggagttcc 20
<210>89
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>89
atcccggggt cccactca18
<210>90
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>90
cacctagcac tccagcggg19
<210>91
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>91
ccgtggcgtc tgtgctgc18
<210>92
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>92
ccctggtccc ccagcaag18
<210>93
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>93
agggaaagtg ggccagca18
<210>94
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>94
aacaagacaa gacccctggg c21
<210>95
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>95
tgctgtcatc tctctggtga gaagt25
<210>96
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>96
cgtatcccag ctttgttctt actcct 26
<210>97
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>97
ttaaagggaa cacgctatgg gat23
<210>98
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>98
gagcagcgcg cacagca 17
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>99
ctagatcctg tgagaagcag acagc25
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>100
tgcttgcatg atgtgctggg 20
<210>101
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>101
gcattggaga tgcagtgtct gg 22
<210>102
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>102
ctttccttac tcaccatttc aggc24
<210>103
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>103
gcagatttag ttatgctcag ccttt25
<210>104
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>104
gcttgagctg tgttcaaggt taaag25
<210>105
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>105
gcagctgtag aagccagtgt ggt23
<210>106
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>106
tcggggattt cactgtacat ctcta25
<210>107
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>107
cgagctccct tccttcagtc atg23
<210>108
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>108
ccacttggaa gctgtaacag atgag 25
<210>109
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>109
gatgccaaga actccatgcc ct22
<210>110
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>110
cgataagagg atatttcgtg ccg23
<210>111
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>111
gccaaagtca cagattttaa ccacg25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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cgagcatctc cttttctgac ataat25
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<212>DNA
<213>人工序列
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gggccatcca tttcaaaggg 20
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>114
cccacagcaa aacaccaaaa gac 23
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<212>DNA
<213>人工序列
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ggatatggag aagcacctaa ggaaa25
<210>116
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>116
ggtgtagtat aatcaggggc cctc 24
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<212>DNA
<213>人工序列
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tcccaaatgt tccaccaact ctg 23
<210>118
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<212>DNA
<213>人工序列
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cgggggtatg tccactcgaa g21
<210>119
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
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accagccgcc cactttctt 19
<210>120
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>120
tggagcggat gtggtaaggc a21
<210>121
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>121
tctaactcgg cactggggat g21
<210>122
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>122
tgatggtcat tcacactctc cgtc24
<210>123
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>123
cggtgatgtt gatggccttt tc22
<210>124
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>124
tagtgtgccc acctctccca 20
<210>125
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>125
gcggttgtct ttgaaccaca gg22
<210>126
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>126
tcagctctga cacataccgg gt22
<210>127
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>127
tagctggaag gagagctgga cc22
<210>128
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>128
gaaaggtagt tgtagggaca ggcag25
<210>129
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>129
agggtgcagg atcccacgt 19
<210>130
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>130
ctgtgttcca tcctctgctg tca23
<210>131
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>131
gggcttgctg cacttctcac a21
<210>132
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>132
cacctctcgc aagtgctcca t21
<210>133
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>133
cctggatatt ggcactggta actg24
<210>134
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>134
gtccccatca aagctctccg20
<210>135
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>135
gagcggggca gtgttgga 18
<210>136
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>136
cggccatgct gagatgtata ggt23
<210>137
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>137
cagcgagtag gcgccattgt20
<210>138
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>138
ttcaggaatg cccgcca 17
<210>139
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>139
ccaggccaga aagagagagt agc23
<210>140
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>140
cctgaatctt tggagtacgc tgg23
<210>141
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>141
ggatgaaacc cagacacata gcaa24
<210>142
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>142
agtgggggtg aattcagtgt agta24
<210>143
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>143
tcacacggca ggcatactca tct23
<210>144
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>144
gctgcttaca tgtctcgatc cc22
<210>145
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>145
tgcggcatct tcaaacctcc 20
<210>146
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>146
gcaacctgct cagatacatc aaaca25
<210>147
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>147
cctctaagtt gccagccctc cta 23
<210>148
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>148
atagtcccat agcagatact tccac25
<210>149
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>149
caatcaagaa aaagacgatc acagc25
<210>150
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>150
ctcagttttt ggttctaccc ctt23
<210>151
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>151
ctcctggctc ctccctcact g21
<210>152
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>152
cgacgtgctg cagggaagt 19
<210>153
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>153
gctggtgaag tctgtgctgt cc22
<210>154
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>154
ttttcattca gcagcttgat gg22
<210>155
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>155
cgagttttga gcgctgtctt tg22
<210>156
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>156
caggattctc caccaggtaa acaa24
<210>157
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>157
gttgcagcct tactatacgc cac23
<210>158
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>158
gcagctgcgg tacaatccc 19
<210>159
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>159
tacaaccaag attcactgtg gatac25
<210>160
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>160
gattatattc ggcgtttcgg gc 22
<210>161
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>161
atgattaccg cagcaaaccg c 21
<210>162
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>162
gcacaccatt ttcccagaac tg22
<210>163
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>163
ctgttcttca ctcttggctc ctg23
<210>164
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>164
acccaacttc tgtacaactc tagc24
<210>165
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>165
tcttgaagtc caagaactta gctgg25
<210>166
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>166
gggtgagcac aaggccttct aa22
<210>167
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>167
caggaaataa ctctggctca taacta26
<210>168
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>168
ccgttacaca ctttgcggca 20
<210>169
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>169
cataattgtt tccatttatc tcctc25
<210>170
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>170
ggtccggtga ggggggtg 18
<210>171
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>171
catttctatc ccagaagcaa ctctt25
<210>172
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>172
tttctgtgtt gaatcttcag tcacaa26
<210>173
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>173
agactagaga aagcagtggg acaaac26
<210>174
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>174
cacaaaataa attaaaagaa aactcctaca 30
<210>175
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>175
cttttctaca gtgattgaaa ctggtaa27
<210>176
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>176
attcttcatc aatctttacc cc22
<210>177
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>177
agcagtccag catggtctgg tac 23
<210>178
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>178
tgggtctctg actgggctcc 20
<210>179
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>179
cctgctgagc attagcttgc a 21
<210>180
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>180
aagtctctga tatcggaaga acaatg26
<210>181
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>181
agagagtcca gaatcctctt ccatg25
<210>182
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>182
gtgtccggct ccgatgca18
<210>183
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>183
ggtgggtagg cctcgaacac ta22
<210>184
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>184
acgttgcgcg tggacagg18
<210>185
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>185
tctgccacct tcacgcga18
<210>186
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>186
ggaaggcccg catggtgta 19
<210>187
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>187
agcactcgga cagggacatt g21
<210>188
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>188
ggttctggaa gacgctgagg t21
<210>189
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>189
gaattcgtcc ccggattact tg22
<210>190
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>190
cccagccagc tgatgccc 18
<210>191
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>191
tccactgccc agttccctca 20
<210>192
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>192
cggcccgaat gctgtca 17
<210>193
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>193
cagtaagtca acttcaatgt cg 22
<210>194
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>194
ctttttcaat tctctctcca ttc23
<210>195
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>195
agagatagaa agaccagtcc20
<210>196
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>196
agaatttgga attcatccaa tcc23
<210>197
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>197
catatcaata ttaaaaagca agc23
<210>198
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>198
ctacattttg tgcataaagt gta23
<210>199
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>199
gaagatcatg tccatgttaa cat23
<210>200
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>200
cgcaagattt tcatcttttt gag23
<210>201
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>201
cacgaaattg attttcaaca tac23
<210>202
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>202
ctgaatctta acaaaatgtt ga 22
<210>203
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>203
ctaccgttct tatcaactat gat23
<210>204
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>204
tagacacggg aggcatagg 19
權(quán)利要求
1.一種受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，主要包括有
(1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5’端的間隔臂序列和3’端的與支持延伸探針互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P1，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.10，每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；
(2)連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針主要包括5’端能與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3’端能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對(duì)EGFR基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.16中的2條或2條以上、針對(duì)KIT基因的選自SEQ.NO.17-SEQ.NO.22中的2條或2條以上、針對(duì)IGF-1R基因的選自SEQ.NO.23-SEQ.NO.28中的2條或2條以上、針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ.NO.29-SEQ.NO.33中的2條或2條以上、針對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ.NO.34-SEQ.NO.38中的2條或2條以上、針對(duì)PDGFRB基因的選自SEQ.NO.39-SEQ.NO.43中的2條或2條以上、和/或針對(duì)HER-2基因的選自SEQ.NO.44-SEQ.NO.48中的2條或2條以上；以及所述支持延伸探針的特異性序列P2還包括有針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.49-SEQ.NO.53中的2條或2條以上、針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.54-SEQ.NO.58中的2條或2條以上、和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.59-SEQ.NO.63中的2條或2條以上；
(3)擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針包括有5’端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3’端序列P5，3’端還修飾有生物素；所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4包括有針對(duì)EGFR基因的選自SEQ.NO.64-SEQ.NO.76中的5條或5條以上、針對(duì)KIT基因的選自SEQ.NO.77-SEQ.NO.86中的5條或5條以上、針對(duì)IGF-1R基因的選自SEQ.NO.87-SEQ.NO.97中的5條或5條以上、針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ.NO.98-SEQ.NO.107中的5條或5條以上、針對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ.NO.108-SEQ.NO.117中的5條或5條以上、針對(duì)PDGFRB基因的選自SEQ.NO.118-SEQ.NO.127中的5條或5條以上、針對(duì)HER-2基因的選自SEQ.NO.128-SEQ.NO.137中的5條或5條以上；以及所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4還包括有針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.138-SEQ.NO.147中的5條或5條以上、針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.148-SEQ.NO.157中的5條或5條以上、和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.158-SEQ.NO.167中的5條或5條以上；所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)、探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，還包括有填充序列，包括針對(duì)EGFR基因的SEQ.NO.168、針對(duì)KIT基因的SEQ.NO.169、針對(duì)IGF-1R基因的選自SEQ.NO.170-SEQ.NO.175中的1條或1條以上、針對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ.NO.176-SEQ.NO.181中的1條或1條以上、針對(duì)PDGFRB基因的選自SEQ.NO.182-SEQ.NO.187中的1條或1條以上、針對(duì)HER-2基因的選自SEQ.NO.188-SEQ.NO.191中的1條或1條以上；針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.192-SEQ.NO.199中的1條或多條、和/或針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.200-SEQ.NO.203中的1條或多條。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為5-10個(gè)T。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述P5的組成為CCTATGCCTCCCGTGTCTA。
5.一種受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，主要包括有
(1)與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球，每條支持探針主要包括5’端的間隔臂序列和3’端的與支持延伸探針互補(bǔ)配對(duì)的特異性序列P1，所述支持探針選自SEQ.NO.1-SEQ.NO.10，每個(gè)目標(biāo)基因選用一種微球，每種微球具有不同的熒光編碼；
(2)連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針主要包括5’端能與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P2、間隔臂序列、3’端能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列P1互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，所述支持延伸探針的特異性序列P2包括有針對(duì)EGFR基因的選自SEQ.NO.11-SEQ.NO.16中的2條或2條以上、針對(duì)KIT基因的選自SEQ.NO.17-SEQ.NO.22中的2條或2條以上、針對(duì)IGF-1R基因的選自SEQ.NO.23-SEQ.NO.28中的2條或2條以上、針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ.NO.29-SEQ.NO.33中的2條或2條以上、針對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ.NO.34-SEQ.NO.38中的2條或2條以上、針對(duì)PDGFRB基因的選自SEQ.NO.39-SEQ.NO.43中的2條或2條以上、和/或針對(duì)HER-2基因的選自SEQ.NO.44-SEQ.NO.48中的2條或2條以上；以及所述支持延伸探針的特異性序列P2還包括有針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.49-SEQ.NO.53中的2條或2條以上、針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.54-SEQ.NO.58中的2條或2條以上、和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.59-SEQ.NO.63中的2條或2條以上；
(3)擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針包括有5’端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列P4、間隔臂序列、3’端序列P5；所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4包括有針對(duì)EGFR基因的選自SEQ.NO.64-SEQ.NO.76中的5條或5條以上、針對(duì)KIT基因的選自SEQ.NO.77-SEQ.NO.86中的5條或5條以上、針對(duì)IGF-1R基因的選自SEQ.NO.87-SEQ.NO.97中的5條或5條以上、針對(duì)VEGFR1基因的選自SEQ.NO.98-SEQ.NO.107中的5條或5條以上、針對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ.NO.108-SEQ.NO.117中的5條或5條以上、針對(duì)PDGFRB基因的選自SEQ.NO.118-SEQ.NO.127中的5條或5條以上、針對(duì)HER-2基因的選自SEQ.NO.128-SEQ.NO.137中的5條或5條以上；以及所述擴(kuò)增延伸探針的特異性序列P4還包括有針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.138-SEQ.NO.147中的5條或5條以上、針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.148-SEQ.NO.157中的5條或5條以上、和針對(duì)TBP基因的選自SEQ.NO.158-SEQ.NO.167中的5條或5條以上；所述P5為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)、探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3、P4和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列；和
(4)標(biāo)記探針，所述標(biāo)記探針具有與擴(kuò)增延伸探針P5互補(bǔ)配對(duì)的序列，且末端具有生物素修飾。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，還包括有填充序列，包括針對(duì)EGFR基因的SEQ.NO.168、針對(duì)KIT基因的SEQ.NO.169、針對(duì)IGF-1R基因的選自SEQ.NO.170-SEQ.NO.175中的1條或1條以上、針對(duì)VEGFR2基因的選自SEQ.NO.176-SEQ.NO.181中的1條或1條以上、針對(duì)PDGFRB基因的選自SEQ.NO.182-SEQ.NO.187中的1條或1條以上、針對(duì)HER-2基因的選自SEQ.NO.188-SEQ.NO.191中的1條或1條以上；針對(duì)B2M基因的選自SEQ.NO.192-SEQ.NO.199中的1條或多條、和/或針對(duì)TFRC基因的選自SEQ.NO.200-SEQ.NO.203中的1條或多條.
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為5-10個(gè)T。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述P5的組成為CCTATGCCTCCCGTGTCTA。
9.一種檢測(cè)受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的方法，其特征是，使用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述液相芯片，主要包括以下步驟
(一)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液；
(二)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴(kuò)增延伸探針密封于雜交板中，54℃±1℃，600rpm震蕩孵育過(guò)夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的P1互補(bǔ)結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合，從而將目標(biāo)mRNA結(jié)合到微球上；擴(kuò)增延伸探針帶有生物素標(biāo)記，擴(kuò)增延伸探針的P4與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大；
(三)步驟(二)的產(chǎn)物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)；
(四)通過(guò)熒光檢測(cè)儀檢測(cè)。
10.一種檢測(cè)受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的方法，其特征是，使用權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述液相芯片，主要包括以下步驟
(一)裂解樣本釋放總RNA，得裂解混合液；
(二)將裂解混合液、偶聯(lián)有支持探針的微球、支持延伸探針、擴(kuò)增延伸探針密封于雜交板中，54℃±1℃，600rpm震蕩孵育過(guò)夜，支持延伸探針的序列P3與支持探針的P1結(jié)合互補(bǔ)結(jié)合，支持延伸探針的特異性序列P2與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合，從而將目標(biāo)mRNA結(jié)合到微球上；擴(kuò)增延伸探針的P4與目標(biāo)mRNA特異結(jié)合；
(三)再加入標(biāo)記探針，標(biāo)記探針帶有生物素標(biāo)記，50℃±1℃，600rpm震蕩孵育1小時(shí)，標(biāo)記探針與擴(kuò)增延伸探針的序列P5互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大；
(四)步驟(三)的產(chǎn)物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)；
(五)通過(guò)熒光檢測(cè)儀檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液相芯片，所述檢測(cè)液相芯片，主要包括有與胺基修飾的支持探針偶聯(lián)的微球；連接支持探針與目標(biāo)基因mRNA的支持延伸探針，每條支持延伸探針包括5’端能與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列、間隔臂序列、3’端能與對(duì)應(yīng)的支持探針的特異性序列互補(bǔ)配對(duì)的序列；連接目標(biāo)基因mRNA與信號(hào)檢測(cè)組分間的擴(kuò)增延伸探針，每條擴(kuò)增延伸探針包括5’端能與目標(biāo)基因mRNA結(jié)合的特異性序列、間隔臂序列、3’端能與標(biāo)記探針互補(bǔ)配對(duì)的序列。本發(fā)明還公開(kāi)了運(yùn)用該液相芯片對(duì)受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物療效相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)的方法。本發(fā)明檢測(cè)過(guò)程無(wú)需RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR等步驟，檢測(cè)結(jié)果受樣本中RNA的質(zhì)量影響較小，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；另一方面，由于液相芯片技術(shù)使多指標(biāo)并行檢測(cè)成為了現(xiàn)實(shí)，在一次檢測(cè)中可設(shè)置多個(gè)內(nèi)參基因，使檢測(cè)結(jié)果更為可靠。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101705283SQ20091019380
公開(kāi)日2010年5月12日 申請(qǐng)日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者許嘉森, 郭元杰, 羅彩英, 吳詩(shī)揚(yáng), 楊惠夷 申請(qǐng)人:廣州益善生物技術(shù)有限公司