專利名稱：一種均相多指標熒光/化學發(fā)光測定方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬血液檢驗領域，涉及熒光/化學發(fā)光同時檢測新技術，具體涉及一種均 相多指標熒光/化學發(fā)光測定方法及其用途。尤其涉及一種腫瘤等重大疾病多種血清標志 物熒光/化學發(fā)光同時檢測技術。
背景技術：
流行病學研究提示，我國不僅腫瘤死亡率呈明顯上升趨勢，而且兼有發(fā)展中國家 和發(fā)達國家高發(fā)并存的特點，主要原因有四點(1)人口老年化。50年前我國人均壽命49 歲左右，而現在為70多歲，非常接近發(fā)達國家水平，老齡化導致老年性疾病自然增多；(2) 工業(yè)化發(fā)展。隨著工業(yè)化的進展，環(huán)境污染等影響加劇，癌癥發(fā)病率增高；(3)農村的城市 化隨著農村向城鎮(zhèn)化發(fā)展，生活節(jié)奏越來越緊張，飲食結構明顯改變，不健康飲食增多，導 致癌癥發(fā)病率增高；(4)不良的生活習慣如吸煙和不良飲食等。統(tǒng)計表明中國每年癌癥新 發(fā)病例約為220萬人，因癌癥死亡人數為160萬人。近20年來，每4-5個死亡者中就有一 個死于癌癥，居死亡原因之首。衛(wèi)生部腫瘤防治辦公室提供的2006年我國腫瘤發(fā)病率和十 大惡性腫瘤發(fā)病率排序顯示肺癌、乳腺癌分別位居男、女性惡性腫瘤發(fā)病首位，男女惡性 腫瘤死亡率最高的均為肺癌。據預測，到2020年，中國也將有550萬新發(fā)癌癥病例，其中死 亡人數將達400萬。目前，肺癌等重大疾病的臨床診斷方法主要有X線檢查、活檢、纖維支氣管鏡檢 查、CT、MRI以及痰細胞學檢查等。實踐顯示，活檢，纖維支氣管鏡檢查均為創(chuàng)傷性診斷方 式，對患者身體及組織有一定程度的損傷，且有人群局限性。CT和MRI檢測費用相對昂貴， 且地方性醫(yī)院不具備該類設施。痰細胞學檢查為非常規(guī)類檢查，患者往往在出現明顯的癥 狀后才進行該類檢查，容易貽誤早期診斷時機。因此，發(fā)展快速、費用低、靈敏度高、特異性 好的無創(chuàng)性早期診斷新技術，特別是血清學的診斷技術，近年來已成為臨床上頗為關注的 熱點研究領域?，F代醫(yī)學的研究成果表明血清中包含的多種腫瘤標志物如癌胚抗原(CEA)、 細胞角質素片斷19(Cyfra21-l)為早期非小細胞肺癌診斷的主要標志物，其中患者血清 Cyfra21-1值與肺癌的進展程度和組織學分型相關，其廣泛存在于內胚葉起源的消化系統(tǒng) 癌，也存在于正常胚胎的消化管組織中，在正常人血清中也可有微量存在。癌胚抗原(CEA) 是一個廣譜性腫瘤標志物，能反映出多種腫瘤的存在，實踐顯示，對大腸癌、乳腺癌和肺癌 的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測和預后估計是一個較好的腫瘤標志物，但其特異性不強，靈敏 度不高，對腫瘤早期診斷作用不明顯。神經元特異性烯醇化酶(NSE)為早期小細胞肺癌 (SCLC)診斷的主要標志物，血清NSE是神經原和神經內分泌細胞所特有的一種酸性蛋白 酶，神經內分泌腫瘤的特異性標志物，如神經母細胞瘤、甲狀腺髓質癌和小細胞肺癌(70% 升高)，可用于鑒別診斷、病情監(jiān)測、療效評價和復發(fā)預報。上述腫瘤標志物主要存在于肺癌 患者血清中，已分別應用于肺癌等重大疾病診斷。但大量的臨床數據表明單一腫瘤標志物 存在著特異性不強的弊端，特別是對早期腫瘤的檢測率不高，臨床實踐中常不得不采用多個標志物分別檢測、聯合分析的方法來提高腫瘤檢測的敏感性。但是，每種標志物都需要一 種放射或酶聯免疫試劑盒，直接導致這些多指標檢測方法普遍存在所需血清用量大、檢測 時間長、診斷費用高、操作復雜等不足，從而限制了它們在臨床上的應用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為了克服現有技術檢測標志物單一，實驗周期長，血清用量大，診 斷費用高的不足，提供一種均相多指標熒光/化學發(fā)光測定方法，尤其涉及一種腫瘤等重 大疾病多種血清標志物熒光/化學發(fā)光同時檢測技術。本發(fā)明采用聚苯乙烯微球上固定多種特異性識別單克隆抗體，用來與癌胚抗原 CEA、細胞角質素片斷19Cyfra21-l、神經元特異性烯醇化酶NSE和其它多種癌癥標志物結 合，然后與多種不同半抗原修飾的標記抗體進行夾心反應；隨后與對應半抗原抗體修飾的 辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶和量子點反應，結合化學發(fā)光和熒光等檢測手段在同一臺 儀器上進行多種標志物同時測定。具體而言，本發(fā)明方法一種多種血清標志物熒光/化學發(fā)光同時檢測方法，可以 同時檢測多種腫瘤標志物。其特征在于，使用聚苯乙烯微球作為載體結合多種腫瘤標志物 的包被抗體，與標準溶液或者血清樣品中的相應多種標志物結合后，與分別制備的標記抗 體結合，然后與抗地高辛ALP，抗FITC HRP和鏈酶親和素量子點等標記物或者其他多種標 記物結合，最后進行化學發(fā)光測定或者直接進行熒光測定。本發(fā)明方法具有血清用量小、檢測時間快、診斷費用低、操作簡單、適合推廣的多 指標同時檢測的優(yōu)點，尤其能為臨床腫瘤等重大疾病早期診斷，提供多種血清標志物輔助 判斷依據。本發(fā)明方法包括下述步驟1)將包被抗體結合到聚苯乙烯微球上制備載體抗體復合物；2)制備標記抗體；3)制備FITC標記的Cyfra21_l標記抗體；4)制備生物素化的NSE標記抗體；5)在同一臺儀器上同時進行熒光/化學發(fā)光測定。本發(fā)明中，所述的腫瘤標志物包括癌胚抗原(CEA)、細胞角質素片斷 19(Cyfra21-l)神經元特異性烯醇化酶(NSE)。本發(fā)明中，制備的標記抗體包括生物素化NSE標記抗體，地高辛標記的CEA標記抗 體和FITC標記的Cyfra21-1標記抗體或者其他標記抗體。本發(fā)明中，利用EDC反應在聚苯乙烯微球上結合腫瘤標記物抗體，其形成的聚苯 乙烯微球抗體復合物作為載體用于腫瘤標志物檢測；將上述抗體復合物混合后，加入含有腫瘤標志物的標準溶液或者血清樣品，于 37。C 反應 Ih;經洗滌將結合有腫瘤標志物的載體抗體復合物中加入到制備的標記抗體，于37°C 反應Ih ；經洗滌加入ALP修飾抗地高辛、HRP修飾抗FITC和量子點修飾鏈酶親和素，于 37°C 反應 Ih;
經洗滌將反應產物平均分為3組，各組加入HRP化學發(fā)光底物、ALP化學發(fā)光底物 進行化學發(fā)光測定或者直接進行熒光測定。本發(fā)明中，測定步驟在同一臺儀器上進行。本發(fā)明中，同時進行化學發(fā)光與熒光測定。本發(fā)明中，同時檢測三種標志物，經方法的適當調整，同樣適合于同時檢測2種甚 至3種以上標志物。本發(fā)明中，使用2種酶標記物和1種熒光量子點，但該方法并不局限于使用2種以 上或少于2種酶標記物和1種或1種以上熒光量子點，適合于同時檢測2種甚至3種以上 標志物。本發(fā)明的另一目的是制備同時檢測腫瘤等重大疾病多種血清標志物的檢測試劑
品.ο所述的檢測試劑盒包括腫瘤標志物標記抗體和聚苯乙烯微球抗體復合物；本發(fā)明優(yōu)選腫瘤標志物標記抗體為生物素化NSE標記抗體，地高辛標記的CEA標 記抗體和FITC標記的Cyfra21-1標記抗體。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明的進行詳細地描述。需 要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領域的普通技術人員可以根據本 文說明，在本發(fā)明的范圍內對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入 本發(fā)明的范圍內。下面結合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明進一步說明。


圖1是本發(fā)明的原理圖。
具體實施例方式(1)聚苯乙烯微球上結合不同標志物對應的包被抗體、封閉備用；(2)加入含有多 種標志物標準品的標準溶液或血清真實樣品；(3)洗滌后加入含有生物素化NSE標記抗體， 地高辛標記的CEA標記抗體以及FITC標記的Cyfra21-1標記抗體或者多種其它半抗原標 記的標記抗體混合溶液；(4)加入ALP修飾抗地高辛、HRP修飾抗FITC和量子點修飾鏈酶親 和素或其它半抗原標記的腫瘤標志物；(5)平均分為三次后，加入各自的化學發(fā)光底物進 行化學發(fā)光測定或者直接進行熒光測定。實施例11)將包被抗體結合到聚苯乙烯微球上制備載體抗體復合物首先將羧基聚苯乙烯微球移入一個1. 5mL的離心管中，利用pH = 6. 0的咪唑溶液 (0. 1M)離心12000印111洗滌三次后加入10(^1^溶有111^ EDC的咪唑溶液于37°C活化30min。 隨后用咪唑溶液離心洗滌活化后的聚苯乙烯微球三次，最后分散于100μ L咪唑溶液后。隨 后加入CEA、NSE和Cyfra21-1包被抗體，37°C下反應lh。PBSTW洗液洗滌三次后，加入含有 2% BSA的PBS溶液200 μ L，37°C封閉Ih。聚苯乙烯微球抗體復合物洗滌后，保存在200 μ L 含有2% BSA的PBS溶液待用。2)制備地高辛抗CEA標記抗體Img地高辛首先分散在400 μ L無水乙醇中，再加入20 μ L水，緩慢加入45 μ L的0. IM高碘酸鈉溶液，至地高辛完全溶解后反應30mi n，隨后加入35yL IM的乙二醇溶液反 應5分鐘，保存?zhèn)溆谩?00 μ L抗CEA標記抗體加入200 μ L水，用5%的碳酸鉀溶液調ρΗ至9.5，加入上 述氧化后的地高辛溶液20 μ L反應lh，隨后加入6mg硼氫化鈉反應4h，用IM甲酸調節(jié)ρΗ 至6. 5，反應Ih后用氨水調節(jié)ρΗ至9. 5，透析過夜后，濃縮至150 μ L待用，用紫外分光光度 法測得蛋白濃度為1. 63mg/mL。3)制備FITC標記的Cyfra21_l標記抗體。濃縮150 μ LCyfra21-1抗體至90 μ L，pH9. 2的0. IM碳酸鈉/碳酸氫鈉溶液中，隨 后加入IOyL的異硫氰酸熒光素(FITC)的0. IM碳酸鈉碳酸氫鈉溶液，在0. IM碳酸鈉/碳 酸氫鈉溶液中透析12h，再利用PBS溶液透析12h，隨后濃縮溶液至150 μ L待用，用紫外分 光光度法測得蛋白濃度為3. 45mg/mL。4)制備生物素化的NSE標記抗體將100 μ L NSE標記抗體去除雜質后，溶于100 μ LPBS中，加入5 μ L0. IM溶于DMF 的NHS化生物素(N-羥基琥珀酰亞胺生物素)于4°C反應2. 5h，然后利用PBS透析過夜，濃 縮至100 μ L待用，用紫外分光光度法測得蛋白濃度為1. 39mg/mL。5)化學發(fā)光和熒光檢測步驟50 μ L封閉好并結合有CEA、NSE和Cyfra21_l包被抗體的聚苯乙烯微球混合后，離 心或過膜去除上清液。隨后加入100 μ L含有CEA、NSE和Cyfra21_l的標準品溶液或真實 血清樣品，37°C下反應Ih。200 μ LPBSTW溶液洗滌三次后，加入100 μ L含有生物素化NSE標 記抗體(0. 5ug/孔)、地高辛標記的CEA標記抗體(0. 815ug/孔)和FITC標記的Cyfra21_l 標記抗體(3. 45ug/孔)的2% BSA-PBS溶液，37°C反應lh。洗滌三次后，加入100 μ L含 有抗地高辛修飾ALP(1 1000)、抗FITCMfWHRPd 1000)和鏈酶親合素修飾量子點 (1 200)，于37°C反應lh。洗滌后，均分為三份，加入50 μ LPBS熒光測定，或IOOyLHRP 化學發(fā)光底物或ALP化學發(fā)光底物，在同一臺儀器上同時進行熒光/化學發(fā)光測定。
權利要求
1. 一種均相多指標熒光/化學發(fā)光測定方法，其特征在于，用聚苯乙烯微球作為載體 結合多種腫瘤標志物的包被抗體，與標準溶液或者血清樣品中的相應多種標志物結合后， 與分別制備的標記抗體結合，然后與抗地高辛ALP，抗FITC HRP和鏈酶親和素量子點標記 物結合后，進行化學發(fā)光測定或者直接進行熒光測定血清標志物。
2.按權利要求1所述的均相多指標熒光/化學發(fā)光測定方法，其特征在于，所述的腫瘤 標志物是癌胚抗原CEA、細胞角質素片斷19Cyfra21-l和神經元特異性烯醇化酶NSE。
3.按權利要求1所述的均相多指標熒光/化學發(fā)光測定方法，其特征在于，所述的 制備的標記抗體是生物素化NSE標記抗體，地高辛標記的CEA標記抗體和FITC標記的 Cyfra21-1標記抗體。
4.按權利要求1所述的均相多指標熒光/化學發(fā)光測定方法，其特征在于，其包括下述 步驟1)將包被抗體結合到聚苯乙烯微球上制備載體抗體復合物；2)制備地高辛標記的CEA標記抗體；3)制備FITC標記的Cyfra21-1標記抗體；4)制備生物素化的NSE標記抗體；5)在同一臺儀器上同時進行熒光/化學發(fā)光測定。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，將步驟1)的抗體復合物混合后，加入含有 腫瘤標志物CEA、Cyfra21-1、NSE的標準溶液或者血清樣品，于37°C反應Ih ；將結合有所述腫瘤標志物的載體抗體復合物洗滌，加入到步驟2，3，4)制成的生物素 化NSE標記抗體，地高辛標記的CEA標記抗體和FITC標記的Cyfra21_l標記抗體，于37°C 反應Ih ；反應后，經洗滌，加入ALP修飾抗地高辛、HRP修飾抗FITC和量子點修飾鏈酶親和素， 于37°C反應Ih;經洗滌將反應產物平均分為3組，各組加入HRP化學發(fā)光底物、ALP化學發(fā)光底物進行 化學發(fā)光測定或者直接進行熒光測定。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征是同時進行化學發(fā)光與熒光測定。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征是，該方法同時檢測3種標志物，或同時檢測2 種或3種以上標志物。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征是該方法使用2種酶標記物和1種熒光量子點， 或使用2種以上或少于2種酶標記物或1種或1種以上熒光量子點。
9. 一種檢測腫瘤多種血清標志物的試劑盒，其特征是，其包括腫瘤標志物標記抗體和 聚苯乙烯微球抗體復合物以及酶標記物和熒光量子點。
10.按權利要求9所述的試劑盒，其特征是，所述的腫瘤標志物標記抗體為生物素化 NSE標記抗體，地高辛標記的CEA標記抗體和FITC標記的Cyfra21_l標記抗體。
全文摘要
本發(fā)明屬血液檢驗領域，涉及一種均相多指標熒光/化學發(fā)光分析方法及其用途。采用聚苯乙烯微球上固定多種特異性識別單克隆抗體，與癌胚抗原、細胞角質素片斷19、神經元特異性烯醇化酶和其它多種標志物結合后，與多種不同半抗原修飾的標記抗體夾心反應；與對應半抗原抗體修飾的辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶和量子點反應，結合化學發(fā)光和熒光等檢測在同一臺儀器上進行多種標志物同時測定。本方法具有血清用量小、檢測時間快、診斷費用低、操作簡單、適合推廣的多指標同時檢測的優(yōu)點，能為腫瘤等重大疾病早期診斷，提供輔助判斷依據。
文檔編號G01N21/64GK101995396SQ20091019442
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月21日 優(yōu)先權日2009年8月21日
發(fā)明者劉彩云, 盧建忠, 曹志娟, 李歡 申請人:復旦大學