專利名稱：一種乙肝病毒感染者血清標(biāo)志物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。涉及一種新的乙肝病毒感染者血清標(biāo)志物。 具體地說，本發(fā)明涉及可反映乙肝患者臟器炎癥反應(yīng)的血清標(biāo)志物親環(huán)素A(CyClophilin A, CypA)，其血清含量的測定方法，及其在慢性乙肝診斷和治療中的用途。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一種常見的傳染性疾病。據(jù)世界
衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球約有3.5億人口由于無法清除病毒而發(fā)展為慢性攜帶者。隨著病情的 發(fā)展，在這些持續(xù)性感染患者中，每年有超過100萬人死于包括慢性活動性肝炎(chronic active hepatitis)、肝硬化(liver cirrhosis)及原發(fā)性肝癌(primary liver cancer)等在內(nèi)的各類 由乙肝病毒感染引起的肝臟疾病。中國是乙肝病毒最為流行的地區(qū)之一，全國有6.9億人 曾感染過乙肝病毒，其中1.2億人長期攜帶乙肝病毒，據(jù)估計(jì)，目前全國有慢性乙肝病人 2000萬人。乙肝病毒感染嚴(yán)重危害了人類的健康，同時(shí)也引發(fā)一系列社會問題，是我國 現(xiàn)階段最為突出的公共衛(wèi)生問題之一。目前國內(nèi)外對乙肝病毒感染者診斷所采用的血清標(biāo)志物均為乙肝病毒的蛋白抗 原及抗體(表面抗原及抗體，E抗原及抗體，核心抗體)，以及病毒的DNA。對于患者 的疾病是否活動則采用谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平作為指標(biāo)。此外還根據(jù)病情需要可作肝組織活檢 及超聲波或其他儀器輔助的檢測。乙肝病毒感染者血清中，除完整的成熟病毒顆粒外，能檢測到大量由乙肝病毒 表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)組成的球形或管狀亞病毒顆粒。在多數(shù)病 人血清中，HBsAg顆粒含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過成熟病毒顆粒，HBsAg顆粒與病毒顆粒之比能高達(dá) 1000 1以上，甚至在檢測不到病毒復(fù)制的情況下，HBsAg仍能持續(xù)大量存在。如此大 量且持續(xù)性表達(dá)病毒包膜蛋白是乙肝病毒獨(dú)有的特性，因此目前已被公認(rèn)為是感染乙肝 病毒的重要診斷指標(biāo)。病人血清HBsAg持續(xù)陽性超過6個(gè)月仍未被清除即被認(rèn)為罹患慢 性肝炎。此外，由于已知HBsAg誘生機(jī)體產(chǎn)生的抗體具有保護(hù)作用，因此HBsAg又是 制作預(yù)防性疫苗的主要組分。親環(huán)素A(cyclophilinA，CypA)是免疫抑制劑環(huán)孢菌素(cyclosporing A，CsA)
的受體，是免疫親和素家族(immunophilin，即PPIase酶)中的一員，也是細(xì)胞內(nèi)的一種 伴侶蛋白，可影響細(xì)胞蛋白的折疊。研究發(fā)現(xiàn)，CypA是一個(gè)多功能的細(xì)胞蛋白，參與了 多個(gè)重要的細(xì)胞生理活動，并在腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)、HIV病毒感染以及心 血管疾病等諸多方面都起到了重要的作用。近年來發(fā)現(xiàn)免疫親和素家族中的CypB可作 用于丙型肝炎病毒NS5B亞基因片段，利用該基因片段作為藥靶，已開發(fā)研制抗丙型肝炎 藥物。HBsAg在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)具有多種效應(yīng)。近來有研究發(fā)現(xiàn)HBsAg在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和 分泌能顯著促進(jìn)CypA的分泌。迄今，國內(nèi)外尚無以CypA作為一種乙肝病毒感染者的血 清標(biāo)志物。
與本發(fā)明有關(guān)的文獻(xiàn)Braaten, D.，and J.Luban.2001.Cyclophilin A regulates HIV—1 infectivity, asdemonstrated by gene targeting in human T cells.Embo J 20 1300—9.Castro, A.P., T.M.Carvalho, N.Moussatche, and C.R.Damaso.2003.Redistribution of cyclophilin A to viral factories during vaccinia virusinfection and its incorporation into mature particles.J Virol 77 9052-68.Jin, Z.G., M.G.Melaragno, D.F.Liao，C.Yan, J.Haendeler, Y.A.Suh, J.D.Lambeth, and B.C.Berk.2000.Cyclophilin A is a secreted growth factorinduced by oxidative stress.Circ Res 87 789-96Sokolskaja, E., D.M.Sayah, and J.Luban.2004.Target cell cyclophilin Amodulates human immunodeficiency virus type 1 infectivity.J Virol78 12800—8.Watashi, K., and K.Shimotohno.2007.Chemical genetics approach tohepatitis C virus replication cyclophilin as a target for anti-hepatitis C virusstrategy.Rev Med Virol 17 245—52Zhao, C., C.Y.Fang, X.C.Tian, L.Wang, P.Y.Yang, and Y.M.Wen.2007. Proteomic analysis of hepatitis B surface antigen positive transgenic mouseliver and decrease of cyclophilin A.J Med Virol 79 1478-8
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的乙型肝炎病毒感染者血清標(biāo)志物。尤其涉及可反 映乙肝患者臟器炎癥反應(yīng)的血清標(biāo)志物親環(huán)素A(CyClophilinA，CypA)，其血清含量的測
定方法。由于CypA蛋白在乙肝病毒表面抗原的作用下可自細(xì)胞內(nèi)分泌至細(xì)胞外，進(jìn)入血 液，從而可以在感染者血清中檢測CypA蛋白；鑒于細(xì)胞外的CypA蛋白具有吸引炎癥細(xì) 胞的作用，因此血清中的CypA蛋白可反映感染者肝臟內(nèi)炎癥的嚴(yán)重程度。本發(fā)明建立 了在乙肝病毒感染機(jī)體的血清中檢測CypA的方法，并進(jìn)一步采用以CypA為血清標(biāo)志物 為判斷乙肝病情發(fā)展嚴(yán)重程度提供參考標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供CypA在研制慢性乙肝診斷制劑和治療藥物中的用途。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供一種慢性乙肝診斷試劑盒，該試劑盒包含針對抗親 環(huán)素A的抗體和應(yīng)用酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbant assay, ELISA)檢測血清
蛋白水平的試劑盒所含的常規(guī)組份。本發(fā)明所述的CypA蛋白，其對應(yīng)的核苷酸序列以及氨基酸序列均可從公開發(fā)布的GenBank數(shù)據(jù)庫中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得，其核苷酸序列的收錄號為 NM_021130.3，其氨基酸序列的收錄號為NP_066953.1。本發(fā)明通過Western Blot或ELISA方法檢測血清CypA蛋白的含量變化，其包括
下述步驟1)采集標(biāo)本采集慢性乙肝病人血液或者實(shí)驗(yàn)動物(小鼠)血液；2)分離血清室溫8000轉(zhuǎn)/分鐘條件下，離心10分鐘分離血清；3)檢測血清CypA含量其中，
Western Blot的方法用SDS-PAGE凝膠電泳方法將標(biāo)本血清蛋白分離后，用轉(zhuǎn) 膜儀以200mA恒流1小時(shí)的條件將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉溶液室溫 封閉2小時(shí)后，用抗CypA抗體4°C孵育過夜，然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵 育2小時(shí)后，用市售的通用型電化學(xué)發(fā)光液(electrochemiluminescence，ECL)檢測膜上血 清CypA的含量；ELISA法用不帶標(biāo)記物的抗CypA抗體包板，加入病人血清或者小鼠血清， 37°C孵育1小時(shí)后，洗板，再加入另一種帶有標(biāo)記物(如辣根過氧化物酶)的CypA抗體 37°C孵育30分鐘，洗板后加入顯色液反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在波長450nm處讀取OD值后計(jì)算
血清CypA含量。 4)分析CypA含量結(jié)果比較實(shí)驗(yàn)組與對照組小鼠血清CypA含量或正常人與乙肝病人血清CypA含量的 不同，并分析CypA含量與血清HBsAg含量以及肝臟炎癥反應(yīng)程度的相關(guān)性。本發(fā)明通過高壓尾靜脈注射技術(shù)在動物實(shí)驗(yàn)中證明，HBsAg表達(dá)與CypA分泌 及肝內(nèi)炎癥反應(yīng)具有相關(guān)性，而且使用藥物環(huán)孢菌素AfcyclosporineA，CsA)處理小鼠阻 斷CypA功能后即可降低炎癥反應(yīng)。并且這一現(xiàn)象也已在乙肝患者的血清標(biāo)本中得到證 實(shí)。本發(fā)明利用血清CypA蛋白的檢測技術(shù)，通過檢測乙肝患者血清CypA的含量， 觀察感染者肝臟中的炎癥程度，對乙肝病人病程發(fā)展及預(yù)后可進(jìn)行輔助診斷和監(jiān)測。所 述的CypA蛋白可作為藥靶，研發(fā)與之作用的抗乙肝藥物。在藥物研發(fā)中可采用CypA作 為標(biāo)志物篩選抗乙肝的藥物，并以此作為判斷治療效果和評價(jià)藥物療效的標(biāo)志物。由于 每個(gè)個(gè)體CypA蛋白表達(dá)水平可有差異，還可采用CypA作為個(gè)體化治療的參考，以及作 為判斷病人對藥物敏感性以及有效性的標(biāo)志物。本發(fā)明的特點(diǎn)為不用肝穿刺等損傷性技術(shù)，通過檢測血清CypA水平的變化，了 解乙肝感染者肝內(nèi)的炎癥反應(yīng)變化，可簡便快捷的診斷慢性乙肝病人的病情發(fā)展過程， 是一種新的對現(xiàn)有乙肝患者血清標(biāo)志物的重要補(bǔ)充。


圖1是.HBsAg陽性小鼠血清CypA含量及其與肝臟炎癥反應(yīng)的相關(guān)性，其中，用高壓尾靜脈注射技術(shù)將HBsAg表達(dá)質(zhì)粒注入小鼠肝臟后，檢測血清 HBsAg和CypA含量，以及肝臟組織的免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色的結(jié)果；(A)血 清HBsAg含量；(B)血清CypA含量；(OD)注射HBsAg的小鼠肝臟組織免疫組化染色 和蘇木精-伊紅染色結(jié)果，C中箭頭所示為HBsAg陽性肝細(xì)胞，D中箭頭所示為炎癥浸 潤灶；(E-F)注射空載體質(zhì)粒的對照組小鼠肝臟組織免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色結(jié)^ ο圖2.是CsA處理后HBsAg陽性小鼠血清CypA含量及其與肝臟炎癥反應(yīng)的相關(guān) 性，其中，用藥物CsA(CypA的抑制劑)先腹腔注射小鼠再如圖1處理小鼠，檢測小 鼠血清HBsAg和CypA含量，以及肝臟組織的免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色的結(jié)果； (A)血清HBsAg含量；(B)血清CypA含量；(OD) CsA處理組HBsAg陽性小鼠肝臟組織免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色結(jié)果；(E-F)未經(jīng)CsA處理組HBsAg陽性小鼠肝臟 組織免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色結(jié)果；(G-H)注射空載體質(zhì)粒的對照組小鼠肝臟 組織免疫組化染色和蘇木精_伊紅染色結(jié)果。圖3是慢性乙肝病人和健康正常人血清CyPA含量比較，其中，可見慢性乙肝患者的血清CypA含量高于正常健康成人。圖4是肝移植病人手術(shù)前后血清CyPA含量比較，其中，可見同一個(gè)體在肝移植前血清CyPA含量高，而移植后多數(shù)血清CyPA下降；同時(shí)顯示個(gè)體間血清CyPA變化有所不同。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1動物實(shí)驗(yàn)研究(1)構(gòu)建HBsAg真核表達(dá)質(zhì)粒根據(jù)GenBank 中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開發(fā)表的 HBV 全基因組序 列C8(GenBank收錄號為AF461363)為模板，用已知技術(shù)設(shè)計(jì)PCR引物(上游引物為 ctaggatccatggagagcacaacatcag，下游引物為 gccgaattctcaaatgtatacccaaagac),應(yīng)用 PCR 技 術(shù)擴(kuò)增完整的HBsAg編碼序列。將擴(kuò)增的HBsAg基因片段插入至Invitrogen公司的 pcDNA3.1質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域的BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間，HBsAg基因表 達(dá)受CMV啟動子控制，可在真核細(xì)胞中表達(dá)。(2)利用已知的高壓尾靜脈注射技術(shù)使HBsAg在小鼠肝臟中表達(dá)將10 μ g HBsAg真核表達(dá)質(zhì)粒稀釋于Ringer，s等滲緩沖液(154mM NaCl, 5.63mM KCl, 2.25mM CaCl2)后在5秒內(nèi)由尾靜脈快速注入C57BL/6J小鼠體內(nèi)。等滲 液體積為小鼠體重的10%。實(shí)驗(yàn)用小鼠為6-8周，體重在18-20g左右。在注射后第4 天，摘眼球采血法收集小鼠血液并分離血清，隨后以脫頸椎法處死小鼠。取小鼠肝臟組 織，置于10%福爾馬林溶液中固定，用于免疫組化及HE染色實(shí)驗(yàn)。(3)環(huán)孢菌素A或其衍生物藥物抑制實(shí)驗(yàn)所述的CypA抑制實(shí)驗(yàn)可用環(huán)孢菌素A或由環(huán)孢菌素A改造的各類衍生物藥物 進(jìn)行，本發(fā)明中，選用藥物環(huán)孢菌素AfcyclosporineA，CsA)為CypA的抑制劑(目前作 為免疫抑制劑廣泛用于臨床)，可與CypA結(jié)合并抑制其功能。將CsA用生理鹽水稀釋 至1.5mg/ml的濃度后以15mg/kg的劑量通過腹腔注射打入注射過HBsAg表達(dá)質(zhì)粒的實(shí)
驗(yàn)小鼠中。(4)血清HBsAg以及CypA含量檢測用上海科華生物工程有限公司的乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒以ELISA的 方法檢測血清HBsAg的含量。取Iul血清用SDS-PAGE凝膠電泳的方法分離血清蛋白后，以200mA恒流轉(zhuǎn)膜 1小時(shí)的條件將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2小時(shí)后，用 抗CypA抗體4°C孵育過夜，然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2小時(shí)后，用市 售的通用型ECL電化學(xué)發(fā)光液檢測膜上血清蛋白CypA的含量。分析HBsAg血清含量與CypA血清含量的相關(guān)性。(5)蘇木精-伊紅(Hematoxylin and Eosin，HE)染色染色和免疫組化染色
將經(jīng)福爾馬林固定過夜的肝臟組織用石蠟包埋，切片，隨后經(jīng)脫蠟和抗原修復(fù) 后用10%正常羊血清室溫封閉15分鐘。切片中加入1 100稀釋的抗HBsAg單克隆抗 體，4°C濕盒孵育過夜。隨后用生物素標(biāo)記的二抗，濕盒37°C孵育1小時(shí)。最后加入 DAB-H2O2顯色15分鐘左右，水洗終止顯色。用蘇木精復(fù)染后，封片，鏡檢觀察。觀 察小鼠肝臟細(xì)胞HBsAg的表達(dá)水平和炎癥浸潤情況。(6)結(jié)果分析對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，研究HBsAg表達(dá)、CypA分泌以及炎性細(xì)胞浸潤三者的 相關(guān)性。結(jié)果表明，HBsAg能促進(jìn)CypA的分泌，與對照組小鼠相比，HBsAg陽性的實(shí) 驗(yàn)組小鼠血清CypA含量明顯上升。胞外CypA蛋白具有趨化因子的功能，能吸引炎癥細(xì) 胞至HBsAg陽性的肝細(xì)胞周圍，造成局部的炎癥浸潤現(xiàn)象。免疫組化和HE染色實(shí)驗(yàn)結(jié) 果顯示，在HBsAg陽性的肝細(xì)胞常伴隨有炎癥細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象(圖1)。此外，CsA抑 制實(shí)驗(yàn)顯示，用CsA處理小鼠后，CypA的趨化功能受到抑制，肝臟炎癥浸潤現(xiàn)象明顯減 少(圖2)。結(jié)果表明CypA血清含量與HBsAg表達(dá)以及肝臟炎癥反應(yīng)具有相關(guān)性。CypA 可作為反映肝臟炎癥反應(yīng)和病毒蛋白表達(dá)情況的血清標(biāo)志物。CsA抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明 細(xì)胞蛋白CypA是潛在的HBV治療的靶點(diǎn)，可利用CypA作為篩選抗乙肝藥物的標(biāo)志物， 以此判斷治療效果和評價(jià)藥物療效。實(shí)施例2慢性乙肝病人血清CypA含量研究1.收集慢性乙型肝炎病人和健康正常人的血清慢性乙肝診斷的標(biāo)準(zhǔn)為血清HBsAg持續(xù)陽性至少6個(gè)月，血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高 至少2倍以上，同時(shí)伴有其他相應(yīng)的癥狀。相應(yīng)的對照組為沒有乙肝病毒感染且血清轉(zhuǎn) 氨酶水平正常的將抗人群。所有樣品均排除了丙型肝炎(hepatitis Cviras，HCV)、丁型 肝炎(hepatitis D virus, HDV)以及人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus 1， HIV-1)共感染的可能性。取Iul血清用SDS-PAGE凝膠電泳的方法進(jìn)行分離后，以 200mA恒流轉(zhuǎn)膜1小時(shí)，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 小時(shí)后，用抗CypA抗體4°C孵育過夜，然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2小 時(shí)后，用ECL化學(xué)發(fā)光液檢測膜上血清蛋白CypA的含量。結(jié)果顯示，與正常人相比， 慢性乙肝患者的血清CypA含量顯著升高(圖3)。2.收集因乙型肝炎而進(jìn)行肝移植手術(shù)病人移植前后的血清 所有病人在肝移植手術(shù)前均為HBsAg陽性，手術(shù)后至少6個(gè)月內(nèi)為HBsAg陰性 并且檢測不出HBV病毒DNA。所有樣品均排除了 HCV、HDV以及HIV共感染的可能 性。取Iul血清用western blot的方法用抗CypA抗體檢測血清蛋白CypA的含量。結(jié)果顯 示，與移植前相比，絕大多數(shù)病人在肝移植手術(shù)后HBV被清除的情況下，其血清CyPA 含量發(fā)生了明顯下降(圖4)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明血清CypA的含量與乙肝病毒感染緊密相關(guān)，可以采用血清 CypA含量作為慢性乙肝病情診斷的標(biāo)志物。
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎感染者血清標(biāo)志物，其特征在于，其具有親環(huán)素A蛋白的氨基酸序 列；其對應(yīng)的核苷酸序列以及氨基酸序列為GenBank數(shù)據(jù)庫登錄，其核苷酸序列的收錄 號為NM_021130.3，其氨基酸序列的收錄號為NP_066953.1。
2.—種檢測權(quán)利要求1所述的乙型肝炎感染者血清標(biāo)志物的方法，其特征在于，通過 下述步驟1)采集標(biāo)本采集慢性乙肝病人血液或者實(shí)驗(yàn)動物小鼠血液；2)分離血清室溫8000轉(zhuǎn)/分鐘條件下，離心10分鐘分離血清；3)血清CypA蛋白的含量測定采用Western Blot的方法用SDS-PAGE凝膠電泳方法將標(biāo)本血清蛋白分離后，用轉(zhuǎn) 膜儀以200mA恒流1小時(shí)的條件將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉溶液室溫 封閉2小時(shí)后，用特異性的抗CypA抗體4°C孵育過夜，然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二 抗室溫孵育2小時(shí)后，用ECL化學(xué)發(fā)光液檢測膜上血清CypA的含量；或，采用ELISA法用一種不帶標(biāo)記物的抗CypA抗體包板，加入乙型肝炎感染者血清 或者小鼠血清，37°C孵育1小時(shí)后，洗板，再加入另一種帶有標(biāo)記物辣根過氧化物酶的 CypA抗體37°C孵育30分鐘，洗板后加入顯色液反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取波長在450nm處的 OD值后計(jì)算血清CypA含量；4)分析CypA含量結(jié)果比較實(shí)驗(yàn)組與對照組小鼠血清CypA含量或正常人與乙型肝炎感染者血清CypA含量 的不同，并分析血清CypA含量與血清HBsAg含量以及肝臟炎癥反應(yīng)程度的相關(guān)性。
3.親環(huán)素A在制備治療慢性乙肝藥物中的用途。
4.按權(quán)利要求3所述的用途，其中所述的藥物是環(huán)孢菌素A或其衍生物。
5.親環(huán)素A在制備慢性乙肝診斷制劑中的用途。
6.按權(quán)利要求5所述的用途，其中所述的診斷試劑是用于診斷慢性乙肝患者肝臟炎癥 情況的診斷試劑盒，該試劑盒包含針對抗親環(huán)素A的抗體和應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測血清蛋 白水平的試劑盒所含的常規(guī)組份。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。涉及一種新的乙肝病毒感染者血清標(biāo)志物。具體涉及可反映乙肝患者臟器炎癥反應(yīng)的血清標(biāo)志物親環(huán)素A，其血清含量的測定方法，及其在慢性乙肝診斷和治療中的用途。本發(fā)明通過Western Blot或ELISA方法檢測血清CypA蛋白的含量變化，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，所述的CypA蛋白在慢性乙肝病人血清中顯著升高，并與肝臟炎癥反應(yīng)相關(guān)，可作為一種無創(chuàng)傷性、簡便、迅速的乙肝病程發(fā)展的血清標(biāo)志物，進(jìn)一步制備乙肝診斷試劑盒和抗病毒藥物。建立的檢測技術(shù)可用于乙肝感染者病程與預(yù)后的判斷、療效考核以及開發(fā)新型抗乙肝病毒藥物。
文檔編號G01N21/76GK102023218SQ20091019575
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月16日
發(fā)明者田曉晨, 聞玉梅 申請人:復(fù)旦大學(xué)