專利名稱：一種電化學(xué)受體生物傳感器及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的電化學(xué)受體生物傳感器及其應(yīng)用，特別是一種以重組EGFP- 0 2-AR細(xì)
胞膜作為生物傳感器識別元件的電化學(xué)生物受體傳感器及其在檢測e 2-激動劑中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
P2-腎上腺素能激動劑(簡稱P2-激動劑、02-興奮劑、{32-配體)是一類激素類藥物，其成員為數(shù)眾多，包括Clenbuterol (克倫特羅，俗稱瘦肉精)、Salbutamol (沙丁胺醇)、Ract叩amine (萊克多巴胺)等數(shù)十種(俗稱瘦肉精)，其作用機(jī)制是P廠配體首先結(jié)合于32-腎上腺素能受體(簡稱02-受體)，通過G蛋白偶聯(lián)的cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮生理效應(yīng)，臨床上用于治療哮喘和支氣管痙攣等相關(guān)疾病。遵循同樣的作用機(jī)制，e2-激動劑還具有增強(qiáng)肌肉，減少脂肪的副效應(yīng)，已被濫用作生長促進(jìn)劑以提高家畜瘦肉率，肉類食品中的該類藥物殘留嚴(yán)重危害人民身體健康。
以電化學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的受體生物傳感器技術(shù)如今受到/極大的關(guān)注。電化學(xué)受體生物傳感器是以固定在表面的材料所具有的離體的或整合的膜受體蛋白作為分子識別元件與待測定的配體分析物發(fā)生親合性結(jié)合，再將這種結(jié)合作用轉(zhuǎn)換成可檢測的電化學(xué)信號的配體小分子檢測技術(shù)。這種技術(shù)靈敏度高、操作方便、價格便宜、結(jié)構(gòu)輕巧、能滿足裝置微型化的要求、能與現(xiàn)在微電子技術(shù)很好地兼容、對樣品的混濁度要求很低。這些巨大的優(yōu)勢使它最有希望成為未來的違禁藥物等檢測技術(shù)。
受體生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，F(xiàn)l前研究較深入的是日本科研小組，主耍相關(guān)工作有
2001年n本科學(xué)家Masaharu Murata等人利用受體-配體系統(tǒng)建立的親和型受體生物傳感器技術(shù)快速檢測雌激素配體17- (3雌二醇，整個受體牛物傳感器系統(tǒng)主要基于雌激素配體17 P雌二醇與修飾于電極表面的雌激素受體發(fā)生特異性結(jié)合，以此達(dá)到檢測配體小分子的目的。
2003年日本科學(xué)家Masaharu Murata等利用甲狀腺激素受體-配體系統(tǒng)，構(gòu)建甲狀腺激素受體蛋白修飾電極快速、方便檢測三碘甲腺原氨酸(T3)配體配休。
2003年H木科學(xué)家Masaharu Murata等利用甲狀腺激素受體-配體相互作用，構(gòu)建甲狀腺激素受休蛋白修飾電極快速、方便檢測三碘甲腺原氨酸(T3)配體配體。
2005年Hwi Jin Ko等研究者利用重組表達(dá)于人胚腎細(xì)胞(HEK-293細(xì)胞)中的鼠源嗅覺受體蛋白17進(jìn)行壓電受體生物傳感器技術(shù)研究，以此達(dá)到檢測配體小分了的目的。
2006年Jong llwan Sung等研究者利用重組表達(dá)于大腸桿菌宿主中的C. elegans嗅覺受體蛋白ODR-10進(jìn)行壓電受體生物傳感器技術(shù)研究，以此達(dá)到檢測配體小分子的目的。
綜上所述采用重組EGFP-e2-AR細(xì)胞膜作為生物識別元件是首次，而且以EGFP-P廠AR受體-配體系統(tǒng)建立的受體生物傳感器技術(shù)也是首次，并將該技術(shù)初步應(yīng)用于P 2-激動劑殘留檢測中的工作也屬首次。目前，國內(nèi)外仍沒有任何科研團(tuán)隊進(jìn)行過e2-AR受體生物傳感器技術(shù)的相關(guān)研究工作，

發(fā)明內(nèi)容
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本發(fā)明的目的之二在于提供該傳感器的制備方法。
本發(fā)明的H的之三在于提供該傳感器在檢測P 2-激動劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明以嵌合有EGFP- e廠AK受體蛋白的重組EGFP- P 2-AR細(xì)胞膜為生物識別元件，建立基
于循環(huán)伏安法的親和型電化學(xué)受體生物傳感器技術(shù)并初歩應(yīng)用到e 2-激動劑殘留的快速檢測
中，研究表明，重組EGFP-!3 2-AR細(xì)胞膜能夠與e2-激動劑發(fā)生特異性受體-配體結(jié)合作用，迅
速引起鐵氰化鉀峰值電流下降，而且隨e 2-激動劑濃度遞增，鐵氰化鉀峰值電流下降程度越大，峰值電流變化大小與e 2-激動劑濃度呈劑量依賴關(guān)系。
結(jié)果表明基于循環(huán)伏安法構(gòu)建的電化學(xué)受體生物傳感器技術(shù)對0 2-激動劑克倫特羅響
應(yīng)迅速，濃度在l .Ox 10-1() M至1 .Ox 10-4M7個數(shù)量級范闈內(nèi)與鐵氰化鉀峰值電流變化值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為R2《.9762，檢測濃度下限可以達(dá)到0.03ppb。
對于重組KGFP- 13 2-AK細(xì)胞膜能與與13 2-激動劑發(fā)生特異性受體-配體結(jié)合作用后，引起[Fc (CN)B]:'—'峰值電流下降的具體實驗機(jī)制，査閱相關(guān)文獻(xiàn)工作主要有兩點(diǎn)
1. 受體-配體作用形成受體-配體復(fù)合物后，改變了工作電極表面修飾重組EGFP-e fAR細(xì)胞膜蛋白層的靜電性質(zhì)，阻礙鐵氰化鉀探針與工作電極表面接觸而導(dǎo)致峰值電流下降。
2. 受體-配體作用形成受體-配體復(fù)合物后，重組受體自身構(gòu)象改變阻礙鐵氰化鉀探針與工作電極表面接觸而導(dǎo)致峰值電流下降。
根據(jù)上述理論，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種電化學(xué)受體牛物傳感器，包括工作電極、對電極和參比電極，其特征在于所述的工作電極采用重組EGFP-P2-AR細(xì)胞膜修飾的金電極；所述的對電極采用鉑絲電極；所述的參比電極采用飽和甘汞電極。
一種根劇上述的電化學(xué)受體生物傳感器的制備方法，其特征在于該方法的具體歩驟為
a. 在尸ic力/a Alton's C5775宿主菌中構(gòu)建表達(dá)EGFP-P廠AR酵母菌株；
b. 搖瓶發(fā)酵法獲得重組表達(dá)EGFP- P 2-AR受體蛋白酵母菌體；c. 采用玻璃珠法破碎提取獲得重組EGFP- {3 2-AR細(xì)胞膜；
d. 取50uL1.0mg/mL重組EGFP-P 2-AR細(xì)胞膜與50uLl. 0mg/mL卵磷脂重懸緩沖液于印pndorf管中充分混合后，得到細(xì)胞膜重懸緩沖液；將該細(xì)胞膜重懸緩沖液倒扣于已拋光的裸金電極表面，置于4'C冰箱過夜后取出金電極，用細(xì)胞膜重懸緩沖液淋洗該金電極；
e. 將步驟d得到的金電極作為工作電極，鉑絲電極作為對電極，飽和甘汞電極作為參比電極，即得到電化學(xué)受體生物傳感器。
-種應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求i所述的電化學(xué)受體生物傳感器檢測e 2-激動劑的方法，其特征在
于該方法的具體歩驟為
a.建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線將根據(jù)權(quán)利要求l所述的傳感器中的工作電極，置于含標(biāo)準(zhǔn)梯度濃度P f激動劑的反應(yīng)體系中，使工作電極分別與各反應(yīng)體系中的P f激動劑充分結(jié)合-，再將工作電極轉(zhuǎn)移到濃度為0. 4mol/L、 pH為7. 40的[K;iFe (CN)J磷酸鹽緩沖液中，用循環(huán)伏安法掃描，建立受體-配體相互作用前后[Fe (CN) e]:'—4—峰值電流變化值大小，建立峰值電流變化值與P r激動劑濃度關(guān)系曲線，即為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；
h.檢測未知P 2-激動劑濃度的反應(yīng)體系中0 2-激動劑的濃度將根據(jù)權(quán)利要求l所述的傳感器中的工作電極至于待檢測溶液中，使其與檢測溶液中的132-激動劑充分結(jié)合，再將工作電極置于濃度為0.4mol/L、 pH為7.40的「K.,Fe (CN) J磷酸鹽緩沖液中，用循環(huán)伏安法掃描，得到[Fe(CN)JH—峰值電流變化值，對照歩驟a建立的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，
得到未知樣品中e 2-激動劑的濃度。
本發(fā)明在朽c力is pas&ris "W縮主菌中成功構(gòu)建表達(dá)EGFP-|32-AR酵母菌株，搖瓶發(fā)酵獲得重組表達(dá)EGFP- 13廣AR受體蛋白酵母菌體，采用經(jīng)典的玻璃珠法破碎提取獲得重組EGFP-02-AR細(xì)胞膜；同時，選取不同時間點(diǎn)的重組表達(dá)了EGFP-AR酵母細(xì)胞、破碎后嵌合有EGFP- 0 2-AR受體蛋白的細(xì)胞膜，對比綠色熒光蛋白(EGFP)熒光強(qiáng)弱來確定重組表達(dá)EGFP-(3 2-AR受體蛋白量最大的時間點(diǎn)，理論上，單位量熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，表明重組表達(dá)EGFP- {3 2-AK受體蚩白量越大，以此確定重組表達(dá)EGFP f32 AR受體蛋白量最佳時間點(diǎn)；更為重要的是，重組EGFP- P 2-AR細(xì)胞的功能鑒定事關(guān)整個檢測系統(tǒng)的成敗。放射配體結(jié)合分析實驗結(jié)果表明，嵌合有EGFP-P廠AR受體蛋白的重組細(xì)胞膜，Kd為O. 44nM; Alprenolol的Ki為7. 22X10 9，與文獻(xiàn)(Biochem. J. (1998) 330, 1丄37)報道((-)-[3H]CGP-12177的Kd為0. 5 nM， Alprcnolol的Ki為2.6XlO")基本一致，表明生物活性良好。
重組酵母工程菌細(xì)胞膜EGFP-f^-AR受休，與所檢査的所有{32-激動劑(包括抑制劑)都
5有結(jié)合能力，證明重組EGFP-e2-AR細(xì)胞膜不僅具有生物活性，而且生物功能完整。
根據(jù)形態(tài)、生化、免疫學(xué)以及功能等鑒定結(jié)果，充分表明本發(fā)明建立的表達(dá)系統(tǒng)是成功
的，不僅為我們P2受體一配體檢測系統(tǒng)奠定了堅實的技術(shù)基礎(chǔ)，同時也強(qiáng)烈提示，利用該e
2受體一配體檢測系統(tǒng)結(jié)合電化學(xué)生物傳感器探索建立日2-激動劑的快速、靈敏、廣譜檢測提
供了可行性。
本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)
1) 高特異性受體-配體檢測系統(tǒng)中受體與配體的結(jié)合具有嚴(yán)格的立體構(gòu)象互補(bǔ)性，保
證了屯化學(xué)受體生物傳感器技術(shù)檢測e 2-激動劑克倫特羅殘留的高度特異性。
2) 高靈敏度電化學(xué)受體生物傳感器技術(shù)檢測P 2-激動劑克倫特羅靈敏度可與放射配基結(jié)合實驗相媲美。
3) 操作簡單 一旦重組EGFP- P 2-AR細(xì)胞膜自組裝修飾成功，只要取微量檢測樣品(配體)加入到電化學(xué)檢測體系，冰水浴環(huán)境，就可以判斷檢測樣品是否含有Pf激動劑并作出定量。
4) 快速、高效檢測冰水浴環(huán)境整個檢測反應(yīng)需30min即可完成，若在室溫環(huán)境下5min即可以完成樣品檢測。
5) 樣品用量少每個檢測樣品只需4.0-5.0微升。
本發(fā)明的檢測體系可以在冰水浴條件下，快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到er激動劑，不需要復(fù)雜儀器，為食品安全檢測提供了新的技術(shù)平臺，能較好滿足目前對h,激動劑現(xiàn)場檢測的迫切需要，用于進(jìn)出U檢疫、食品衛(wèi)生部門、畜牧飼養(yǎng)場等的現(xiàn)場檢測，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會效益。


圖l為本發(fā)明的傳感器的修飾工作電極在[K:,Fe(CN)J溶液的電化學(xué)表征。其中(A)為裸金電極(RJ)與重組細(xì)胞膜受體修飾電極(XS)在[K:,Fe(CN)。]溶液中的電化學(xué)行為；(B)為裸金電極(RJ)與GS115細(xì)胞膜修飾電極(XS)在[K.,「e(CN)6]溶液中的電化學(xué)行為。
圖2為修飾工作電極在含10nM克倫特羅(CLB)的K3[Fe(CN)6]-tUFe(CN)J的循環(huán)伏安掃描圖。其中(A)為Au/EGFP- 0 2-AR細(xì)胞膜受體修飾丁作電極的循環(huán)伏安掃描圖；(B)為Az/(^725酵母細(xì)胞膜修飾工作電極的循環(huán)伏安掃描圖。
圖3為電化學(xué)受體生物傳感器技術(shù)檢測克倫特羅靈敏度。其中(A)為重組EGFP-日2-AK細(xì)胞膜修飾金工作電極循環(huán)伏安掃描(R.]:裸金電極XS:修飾電極)；(B)為G57J5酵母細(xì)胞膜修飾工作電極循環(huán)伏安掃描(RJ:裸金電極XS:修飾電極)。
圖4[Fe(CN)J:i 1—峰值電流變化大小與克倫特羅濃度負(fù)對數(shù)值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。系列1:重組EGFP- {3 2-AR細(xì)胞膜系列2:陰性對照GSW5酵母細(xì)胞膜系列3:(系列1) 一 (系列2)圖5為電化學(xué)受體生物傳感器技術(shù)應(yīng)用于克倫特羅添加回收實驗。其中(A)為重組EGFP-0 2-AR細(xì)胞膜修飾金工作電極循環(huán)伏安掃描(RJ:裸金電極XS:修飾電極)；(B)為C5725酵母細(xì)胞膜修飾工作電極循環(huán)伏安掃描(RJ:裸金電極XS:修飾電極)。
具體實施例方式
1. 重組EGFP-P 2-AR細(xì)胞膜的制備本發(fā)明選用誘導(dǎo)表達(dá)階段培養(yǎng)30h的重組EGFP-P 2-AR酵母細(xì)胞，采用經(jīng)典的玻璃珠法破碎提取獲得重組EGFP-HR細(xì)胞膜，并對重組EGPP-P2--AR細(xì)胞膜進(jìn)行形態(tài)電鏡鑒定、熒光鑒定以及放射配基結(jié)合分析實驗鑒定，結(jié)果表明重組EGFP-P2-AR細(xì)胞膜不僅具有生物活性，而且生物功能完整。陰性對照系統(tǒng)，未重組"775酵母細(xì)胞膜的制備采用與上述相同的方法獲得。
2. 重組EGFP- P廠AR細(xì)胞膜修飾工作電極制備取50uU. 0mg/mL重組EGFP- (3廠AR細(xì)胞膜與50uLl. 0mg/mL卵磷脂重懸緩沖液于印pndorf管中充分混合后，倒扣于己拋光的裸金電極表面，置于4'C冰箱過夜后取出金電極，用適量細(xì)胞膜重懸緩沖液淋洗工作電極，再放入到5mL0. 4mol/L的[K:,Fe(CN)J磷酸鹽緩沖液(pH7. 40)屮，進(jìn)行循環(huán)伏安法(CV)掃描。陰性對照系統(tǒng)，未重組^S775酵母細(xì)胞膜采用上述相同方法制備修飾金電極。
將重組EGFP-(3廠AR細(xì)胞膜修飾工作電極置于5mL0. 4mo)/L的[K:iFo (CN) fi]磷酸鹽緩沖液
(pH7.40)中，進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描獲得掃描圖，參見圖1 (A);陰性對照系統(tǒng)，朱重組"7/5酵母細(xì)胞膜修飾工作電極采用上述相同方法獲得循環(huán)伏安法掃描圖，參見圖l (B)。
結(jié)果表明，重組K;FP- f5 2-AR細(xì)胞膜成功在電極表面形成了 層自組裝膜，抑制了[Fe (CN) 6]'— 4—向金電極表面的擴(kuò)散，對[Fe (CN) 6]M—電子轉(zhuǎn)移起到了明顯的阻礙作用，可以應(yīng)用于后續(xù)1-激動劑殘留檢測。陰性對照系統(tǒng)，未重組C57/5酵母細(xì)胞膜也成功修飾于電極表面。
3. 電化學(xué)循環(huán)伏安法直接檢測13 f激動劑配體-受體親和作用
自組裝修飾到工作電極表面重組EGFP- f3 2 AR細(xì)胞膜探針保持了特異性識別e 2-激動劑的
能力，能與濃度為l. 0X 10—^的克倫特羅結(jié)合生成受體-配體復(fù)合物，進(jìn)一歩阻礙[Fe(CN),J' 1—探針到達(dá)工作電極表面進(jìn)行電子交換，明顯降低[Fe (CN) (;] 3—1氧化還原峰值電流，參見圖2(A);陰性對照系統(tǒng)，未重組/5"酵母細(xì)胞膜修飾工作電極對克倫特羅沒有識別能力，對[Fe(CN)JH氧化還原峰值電流影響甚微，參見圖2 (B)。
結(jié)果表明基于循環(huán)伏安技術(shù)構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器結(jié)合重組EGFP- {3 2-AR受體-配體檢測系統(tǒng)檢測克倫特羅殘留具有實際可行性。4.電化學(xué)受體生物傳感器檢測體系靈敏性、特異性分析
以克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測體系的特異性分析。電化學(xué)受體生物傳感器檢測體系的特異
性測試良好，可以檢測到e2-激動劑克倫特羅。
以10—3、 10—4……10—'"稀釋度的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行電化學(xué)受體生物傳感器檢測方法的靈敏度分析。電化學(xué)受體生物傳感器檢測方法靈敏度比普通免疫學(xué)檢測法至少高10倍。其檢測程序為(1)反應(yīng)體系
① 重組EGFP {3 2 AR細(xì)胞膜修飾工作電極
② 克倫特羅結(jié)合反應(yīng)體系(5ml)配置
phosphate buffer (pH7. 4)10—7M CLB母 液10_6M CLB母 液l(TM CLB母 液IO"M CLB母 液10, CLB母 液10—2M CLB母 液10—'M CLB母 液IO"M CLB母 液
5. 0mL5. O^L4. 5(iL4. 5nL4. 5nL4. 5(iL4. 5nL4. 5|_iL4. 5^xL
③電化學(xué)受體生物傳感器檢測體系溶液(5mL)配置
5mL0. 4mol/L的LK,Fe (CN) J磷酸鹽緩沖液(pH7. 40)(2)電化學(xué)受體生物傳感器檢測克倫特羅
重組EGFP-e 2-AR細(xì)胞膜修飾工作電極，置于克倫特羅結(jié)合反應(yīng)體系中，電極表面修飾的重組EGFP- e 2-AR細(xì)胞膜探針與克倫特羅充分結(jié)合后，將修飾工作電極轉(zhuǎn)移到檢測體系溶液中，循環(huán)伏安法掃描獲得掃描圖，參見圖3 (A),陰性對照系統(tǒng)，未重組"7h—酵母細(xì)胞膜采用相同方法獲得循環(huán)伏安掃描圖，參見圖3 (B)，觀察鐵氰化鉀峰值電流大小的變化與克倫特羅濃度的關(guān)系
結(jié)果表明重組EGFP- e 2-AR細(xì)胞膜修飾丁作電極對克倫特羅響應(yīng)迅速，而且克倫特羅濃度在1.0"0, M至1.0W(r4 M7個數(shù)量級范圍內(nèi)與鐵氰化鉀峰值電流變化值均呈良好的線件關(guān)系，檢測卜限可以達(dá)到0.03ppb;陰性對照系統(tǒng)，未重組6'67/5酵母細(xì)胞膜修飾工作電極對克倫特羅基本沒有響應(yīng)，[Fc(CN)J'—+氧化還原電流峰值基本上沒有變化，即使克倫特羅的濃度達(dá)到l. OmM時，氧化還原電流峰值也沒有很明顯變化，進(jìn)--歩證實受體-配體結(jié)合在-一定程度上抑制了 [Fe (CN)e]'"向金電極表面的擴(kuò)散，對[Fe (CN) 6]:'—/4—電子轉(zhuǎn)移起到了- -定的阻礙作用。
對于受休-配休結(jié)合能夠在一定程度上抑制了 [Fe(CN)fi]:i'卜向工作電極表面擴(kuò)散的機(jī)理，通過相關(guān)文獻(xiàn)工作，我們推測是由于重組EGFP- P HVR細(xì)胞膜與克倫特羅作用形成復(fù)合物后，改變了修飾于電極表面蛋白層的靜電性質(zhì)。
[Fe (CN) J峰值屯流變化大小與克倫特羅濃度負(fù)對數(shù)值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，參見圖4:
8我們已成功應(yīng)用該技術(shù)于尿樣中62-激動劑克倫特羅添加回收測定實驗，基于循環(huán)伏安
法構(gòu)建的電化學(xué)受體生物傳感器技術(shù)檢測尿樣基質(zhì)中e 2-激動劑克倫特羅殘留時，響應(yīng)迅速，
添加濃度分別為1.0nM 、 10nM 、 100nM時其檢測回收率高達(dá)為63. 1% 、 79.4%、 125%，檢測結(jié)果見圖5，重組EGFP-e2-AR細(xì)胞膜修飾工作電極循環(huán)伏安掃描圖，參見圖5 (A),陰性對照系統(tǒng)，未重組6^775酵母細(xì)胞膜修飾工作電極循環(huán)伏安掃描圖，參見圖5 (B)。
上述結(jié)果表明運(yùn)用循環(huán)伏安技術(shù)構(gòu)建的基于重組EGFP-f3 2-AR細(xì)胞膜受體-配體相互作用的新型電化學(xué)受體生物傳感器技術(shù)是成功的，我們相信經(jīng)過實驗條件進(jìn)一步優(yōu)化后，該技術(shù)在02-激動劑殘留檢測中的應(yīng)用是完全能夠達(dá)到快速、靈敏、廣譜等檢測指標(biāo)，具有-^定應(yīng)用性和創(chuàng)新性。本發(fā)明充分說明了新型電化學(xué)受體生物傳感器技術(shù)的應(yīng)用研究前景，并為親和型電化學(xué)受體生物傳感器的進(jìn)一步研究提供實驗技術(shù)基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種電化學(xué)受體生物傳感器，包括工作電極、對電極和參比電極，其特征在于所述的工作電極采用重組EGFP-β2-AR細(xì)胞膜修飾的金電極；所述的對電極采用鉑絲電極；所述的參比電極采用飽和甘汞電極。
2. —種根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)受體生物傳感器的制備方法，其特征在于該方法的具體 步驟為a. 在A'c/ 2'a pastork tf57M宿主菌中構(gòu)建表達(dá)EGFP-P 2_AR酵母菌株；b. 搖瓶發(fā)酵法獲得重組表達(dá)EGFP-e 2-AR受體蛋白酵母菌體；c. 采用玻璃珠法破碎提取獲得重組EGFP- (3 2-AR細(xì)胞膜；d. 取50uL1.0mg/mL重組EGFP-P 2-AR細(xì)胞膜與50uLl. Omg/mL卵磷脂重懸緩沖液于 印pndorf管中充分混合后，得到細(xì)胞膜重懸緩沖液；將該細(xì)胞膜重懸緩沖液倒扣于已 拋光的裸金電極表面，置于4'C冰箱過夜后取出金電極，用細(xì)胞膜重懸緩沖液淋洗該 金電極；e. 將歩驟d得到的金電極作為工作電極，鉑絲電極作為對電極，飽和甘汞電極作為參比 電極，即得到電化學(xué)受體生物傳感器。
3. —種應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)受體生物傳感器檢測02-激動劑的方法，其特征在 于該方法的具體歩驟為a. 建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線將根據(jù)權(quán)利要求l所述的傳感器中的工作電極，置于含標(biāo)準(zhǔn)梯度濃度i^-激動劑的反應(yīng)體系中，使工作電極分別與各反應(yīng)體系中的02-激動劑充分結(jié)合；再將工作電極轉(zhuǎn)移到濃度為0.4mol/L、 pH為7.40的[K.,Fe (CN)6]磷酸鹽緩沖液 中，用循環(huán)伏安法掃描，建立受體-配體相互作用前后[Fe(CN)J3—'4—峰值電流變化值大 小，建立峰值電流變化值與h-激動劑濃度關(guān)系曲線，即為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；b. 檢測未知f^-激動劑濃度的反應(yīng)體系中!32-激動劑的濃度將根據(jù)權(quán)利要求1所述的 傳感器中的工作電極至于待檢測溶液中，使其與檢測溶液中的0 2-激動劑充分結(jié)合， 再將工作電極置于濃度為0.4mol/L、 pH為7.40的[K:iFe (CN) J磷酸鹽緩沖液中，用 循環(huán)伏安法掃描，得到[Fe(CN)e]3—1—峰值電流變化值，對照歩驟a建立的標(biāo)準(zhǔn)工作曲 線，得到未知樣品中P 2-激動劑的濃度。
全文摘要
一種以重組EGFP-β₂-AR細(xì)胞膜作為生物傳感器識別元件的電化學(xué)生物受體傳感器及其在檢測β₂-激動劑中應(yīng)用。本發(fā)明的電化學(xué)受體生物傳感器，包括工作電極、對電極和參比電極，其特征在于所述的工作電極采用重組EGFP-β₂-AR細(xì)胞膜修飾的金電極；所述的對電極采用鉑絲電極；所述的參比電極采用飽和甘汞電極。本發(fā)明建立的表達(dá)系統(tǒng)是成功的，不僅為我們β₂受體—配體檢測系統(tǒng)奠定了堅實的技術(shù)基礎(chǔ)，同時也強(qiáng)烈提示，利用該β₂受體—配體檢測系統(tǒng)結(jié)合電化學(xué)生物傳感器探索建立β₂-激動劑的快速、靈敏、廣譜檢測提供了可行性。
文檔編號G01N27/26GK101672814SQ200910196550
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月27日
發(fā)明者彭可順, 戴小峰, 毛春鴻, 陳宇光 申請人:上海大學(xué)