專利名稱：：一種苯丙氨酸羥化酶基因突變的檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種苯丙氨酸羥化酶基因突變的檢測方法，屬于分子生物學
技術領域：
。
背景技術：
：苯丙氨酸羥化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)基因定位于染色體12q22-24.2，全長約90kb，包括13個外顯子和12個內含子。外顯子長為1353bp的單鏈，mRNA翻譯成含451個氨基酸的酶單體，單體聚合成有功能的PAH酶。PAH基因突變可導致肝臟苯丙氨酸羥化酶缺乏，苯丙氨酸不能正常轉化為酪氨酸，從而在肝臟中代謝紊亂，導致患兒出現(xiàn)苯丙酮尿癥(phenylketo皿ria，PKU)。苯丙酮尿癥是一種氨基酸代謝異常的常染色體隱性遺傳病。在歐美地區(qū)的發(fā)病率為1/10000，在我國是1/16000，雜合子頻率為1/50。迄今已經發(fā)現(xiàn)PKU有440多種致病突變，國內僅發(fā)現(xiàn)30余種突變。PAH基因的突變大部分是錯義突變，致病突變大多位于外顯子或內含子與外顯子的交接區(qū)，嚴重影響苯丙氨酸羥化酶基因轉錄和翻譯及蛋白質的異常折疊、聚合，以及加速降解，從而影響苯丙氨酸羥化酶的催化活性。在不同種族和地區(qū)人群之間苯丙氨酸羥化酶基因座突變部位及分布具有較大差異。1996年，Guldberg等研究美國PKU患者時發(fā)現(xiàn)高頻突變等位基因為R408W(18.7%)，IVS12+1G>A(7.8%)。Johannes等檢測546例PKU，其中411例德國人，65例土耳其人，發(fā)現(xiàn)91種突變，最常見的突變是R408W(22X)和IVS12+1G>A(12%)，并指出歐洲苯丙氨酸羥化酶基因突變有明顯地區(qū)差異，如南歐常見突變?yōu)镮VS10-1G>A(10%20%)、東歐為R408W-H2(巴厘島80%以上)、北歐為IVS12+1G>A(丹麥37%)或R408W-H1。在亞洲人的苯丙酮尿癥的突變基因的研究中，Yoshiyuki等研究41例日本PKU，發(fā)現(xiàn)高頻突變位點為R413P(30.5%)和R243Q(7.3%)，并發(fā)現(xiàn)外顯子5和6的大片缺失。而韓國常見的幾種突變是R243Q(12%)、IVS4-1G>A(IO.1%)、EX6-96A>G(IO.1%)。中國人的PKU發(fā)生率和基因突變存在地區(qū)差異，中國北方人群PAH最常見的突變是R243Q(22.1%)，其次是EX6-96A>G、R111X、R413P和Y356X。而臺灣PKU的發(fā)病率和突變圖譜與大陸存在很大的差異，臺灣中以輕型PKU為主，突變以R241C和R408Q最常見，發(fā)生率分別為32%和14%;其次是R243Q，且發(fā)病率低于大陸人群的發(fā)病率?，F(xiàn)有檢測PAH基因突變的方法主要是限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)和單鏈構象多態(tài)性(PCR-SSCP)。PCR-RFLP是利用多種限制性內切酶對基因擴增產物進行酶切，不同的片斷將產生不同的電泳圖譜，但這種方法只能用于檢測單一位點，且這個位點必須恰好是可以酶切的，存在一定局限性。PCR-SSCP是根據(jù)單鏈DNA分子在中性聚丙酰胺凝膠中電泳時由于不同的立體構象造成不同的泳動速率，產生不同的條帶來判斷突變的存在，但此法只能檢測基因變異的存在，而不能確定突變的部位和內容。我們應用的直接測序方法可以對PCR產物直接進行DNA序列分析，明確突變位點，是現(xiàn)有基因突變檢測方法中最直接最準確的方法，且可以實現(xiàn)機械化自動化，使測序工作更加簡便快捷。綜上所述，苯丙氨酸羥化酶的基因突變位點和形式多種多樣，具有明顯人種和地域的差異，中國人PKU患者的總的突變發(fā)現(xiàn)約30多種，常見的突變位于外顯7和12，分別為R413P(25%)和R243Q(18%)。應用直接測序方法檢測苯丙氨酸羥化酶基因常見突變位點的研究，有利于建立PKU的基因診斷，以便于實現(xiàn)PKU的早期診斷和產前篩查。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種簡單易行的苯丙氨酸羥化酶基因突變的檢測方法。為了達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是提供一種苯丙氨酸羥化酶基因突變的檢測方法，其特征在于，具體步驟為步驟1.采集被測者口腔粘膜樣本；步驟2.基因組DNA的抽提方法采用硅膠吸附法抽提步驟1中的被測者口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，抽提時間為2-3小時，采用電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，肉眼見清晰白色條帶即進入下一步檢測；步驟3.基因分型將每一個被測者樣本分別放入2個反應孔，2個反應孔分別檢測PAH基因7號以及12號外顯子突變情況，采用PGR技術進行擴增、凝膠電泳技術檢測純度以及測序技術對這些位點基因型進行確定；步驟3-1，反應體系配置在每一個反應孔中加入PCR標準反應體系，標準反應體系的引物濃度為10uM，反應體系總體積為20ul，由PCR試劑5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/iU的步驟2得到的PAHDNA模板3ii1和去離子水11.2ul組成；PAH基因第7外顯子正向和反向引物正向弓l物tctttcttcttttcatccbtcc反向弓l物aacctcattcttcaaatctccaPAH基因第12外顯子正向和反向引物正向弓l物ctcagttcgctacgacccatac反向弓l物ttgtccaagacctcaatcaata步驟3-2，PCR反應條件將反應孔在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為95。C預熱15分鐘；再進行35個循環(huán)的95°C、45秒；60。C、45秒；72。C、60秒；72。C、7分鐘后，降溫至4°C;步驟3-3，將反應孔在PCR擴增儀反應后的產物進行電泳檢測，肉眼見清晰白色條帶即進入下一步a.1%瓊脂糖凝膠插小號孔梳子；b.2000bpDNA標記物6ul;c.步驟3-2的PCR產物4ul加入電泳緩沖液lul;d.電泳電壓:120v;e.電泳時間20min拍攝一張電泳圖；30min拍攝一張電泳圖；PAH基因第7外顯子目的條帶在330bp左右；PAH基因第12外顯子目的條帶在400bp左右；步驟3-4，純化在每一個反應孔中加入反應體系，反應體系總體積為7ul，由去離子水ddH203.825ul、PCR產物純化試劑SAP0.05ul、PCR產物純化試劑EX0N10.125ul和步驟3-3的PCR產物3ul組成；終濃度PCR產物純化試劑SAP0.2U/7ul、PCR產物純化試劑EX0N12.5U/7ul;反應條件為37。C、60min;80。C、15min;4。C恒溫保存；步驟3-5，將純化后的每一個反應孔用ABI3730測序儀進行測序；步驟3-5-1，從-20度冰箱中取出步驟3-4的PCR純化產物、測序試劑BigDye、四種dNTP、luM測序引物，7號以及12號外顯子測序引物分別為tctttcttcttttcatccbtcc和ctcagttcgctacgacccatac;步驟3-5-2，記錄日期、所作反應的PCR純化產物名、所用引物、反應體系、測序試劑用量和PCR反應條件；步驟3-5-3，取一塊反應板，標上模板名、測序引物名和日期；步驟3-5-4，在每一個反應孔中加入反應體系，反應體系由0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的測序引物、3ul的PCR純化產物和0.lul的去離子水ddH20組成；體系分裝好后，上離心機，達900轉/分即停；步驟3-5-5，將反應板放在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為預熱96°C、10秒；再進行25個循環(huán)的96°C、10秒；5(TC、5秒；6(TC、4分鐘；6(TC、4分鐘后，降溫至4t:恒溫保存；步驟3-5-6，擴增結束后，在每孔加入lul125mM乙二胺四乙酸EDTA;步驟3-5-7，再在每孔加入無水乙醇15ul于室溫進行沉淀，不得超過24小時；步驟3-5-8，將96孔板放入冰凍離心機，3650轉/分，4。C離心30分鐘；步驟3-5-9，倒去上清液，將96孔板離心，達800轉即停，再在每孔加30ul70%乙醇，3650轉/分，4t:離心15分鐘，倒去上清液，將96孔板離心，達800轉即停，將殘余酒精風干，室溫放置20分鐘；步驟3-5-10，每孔加入8ul95%甲酰胺與ddH20混合物；步驟3-5-11，在ABI3730上進行結果讀取，用軟件Chromas查閱測序檢測結果第7以及第12外顯子都2類結果，即正常結果和突變結果；步驟4，結果分析1.未檢出突變您的檢測結果中未發(fā)現(xiàn)PAH基因第7以及第12號外顯子上存在突變；2.檢出突變您的檢測結果中發(fā)現(xiàn)PAH基因第7或第12號外顯子上存在突變。本發(fā)明對PAH基因第7以及第12號外顯子上進行檢測，相應位點特異性引物的設計以及用于序列測定的實驗方案、試劑以及報告生成系統(tǒng)，通過同時檢測分析個體的PAH基因第7以及地12號外顯子上是否存在突變來提供一種用于輔助診斷苯丙酮尿病的檢測方。采集樣本的類型為口腔粘膜上皮細胞，采用硅膠吸附法抽提DNA具有所需樣品量少，抽提質量穩(wěn)定，抽提產物純度高，操作簡便的特點。利用本發(fā)明對超過100例以上中國人群樣本的檢測結果顯示，根據(jù)上述方法進行的PAH基因第7以及第12號外顯子上基因型檢測檢出率可達99%以上，結果可重復性達到100%。本發(fā)明的優(yōu)點是簡單易行、可重復性高，適合于早期診斷、產前篩查苯丙酮尿癥。圖1為7個樣本第7外顯子PCR后產物的電泳結果圖；圖2為7個樣本第12外顯子PCR后產物的電泳結果圖；圖3為PAH基因第7號外顯子實驗無突變結果示意圖；圖4為PAH基因第12號外顯子實驗無突變結果示意圖；圖5為PAH基因第7號外顯子實驗有突變結果示意圖；圖6為PAH基因第12號外顯子實驗有突變結果示意圖。具體實施例方式以下結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例—種用于苯丙酮尿癥輔助診斷的細胞分子遺傳學檢測方法，具體步驟為步驟1.采集被測者口腔粘膜樣本；步驟2.基因組DNA的抽提方法采用硅膠吸附法抽提步驟1中的被測者口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，抽提時間為2-3小時，采用電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，肉眼見清晰白色條帶即進入下一步檢測；步驟3.基因分型將每一個被測者樣本分別放入2個反應孔，2個反應孔分別檢測PAH基因7號以及12號外顯子突變情況，采用PCR技術進行擴增、凝膠電泳技術檢測純度以及測序技術對這些位點基因型進行確定；步驟3-1，反應體系配置在每一個反應孔中加入PCR標準反應體系，標準反應體系的引物濃度為10uM，反應體系總體積為20ul，由PCR試劑(天根生化KT202-12)5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/ii1的步驟2得到的PAHDNA模板3y1和去離子水11.2ul組成；PAH基因第7外顯子正向和反向引物正向弓l物tctttcttcttttcatccbtcc反向弓l物aacctcattcttcaaatctccaPAH基因第12外顯子正向和反向引物正向弓l物ctcagttcgctacgacccatac反向弓l物ttgtccaagacctcaatcaata步驟3-2，PCR反應條件將反應孔在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為95"C預熱15分鐘；再進行35個循環(huán)的95°C、45秒；60。C、45秒；72。C、60秒；72。C、7分鐘后，降溫至4°C;步驟3-3，將反應孔在PCR擴增儀反應后的產物進行電泳檢測，肉眼見清晰白色條帶即進入下一步圖1為7個樣本第7外顯子PCR后產物的電泳結果圖；圖2為7個樣本第12外顯子PCR后產物的電泳結果圖；a.1%(重量濃度)瓊脂糖凝膠插小號孔梳子；b.2000bpDNA標記物(天根生化MD114-02)6ul;c.步驟3-2的PCR產物4ul加入電泳緩沖液(天根生化RT201-01)lul;d.電泳電壓:120v;e.電泳時間20min拍攝一張電泳圖；30min拍攝一張電泳圖；PAH基因第7外顯子目的條帶在330bp左右；PAH基因第12外顯子目的條帶在400bp左右；步驟3-4，純化在每一個反應孔中加入反應體系，反應體系總體積為7ul，由去離子水dc^03.825ul、PCR產物純化試劑SAP0.05ul、PCR產物純化試劑EX0N10.125ul和步驟3-3的PCR產物3ul組成；終濃度PCR產物純化試劑SAP0.2U/7ul、PCR產物純化試劑EX0N12.5U/7ul;反應條件為37。C、60min;80。C、15min;4。C恒溫保存；步驟3-5，將純化后的每一個反應孔用ABI3730測序儀進行測序；步驟3-5-1，從-20度冰箱中取出步驟3-4的PCR純化產物、測序試劑BigDye(PEAppliedBiosystems4337574)、四種dNTP、luM測序引物，7號以及12號外顯子測序弓l物分另ll為tctttcttcttttcatccbtcc禾口ctcagttcgctacgacccatac;步驟3-5-2，記錄日期、所作反應的PCR純化產物名、所用引物、反應體系、測序試劑用量和PCR反應條件；步驟3-5-3，取一塊反應板，標上模板名、測序引物名和日期；步驟3-5-4，在每一個反應孔中加入反應體系，反應體系由0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的測序引物、3ul的PCR純化產物和0.lul的去離子水ddH20組成；體系分裝好后，上離心機，達900轉/分即停；步驟3-5-5，將反應板放在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為預熱96°C、10秒；再進行25個循環(huán)的96°C、10秒；5(TC、5秒；6(TC、4分鐘；6(TC、4分鐘后，降溫至4t:恒溫保存；步驟3-5-6，擴增結束后，在每孔加入lul125mM乙二胺四乙酸EDTA;步驟3-5-7，再在每孔加入無水乙醇15ul于室溫進行沉淀，不得超過24小時；步驟3-5-8，將96孔板放入冰凍離心機，3650轉/分，4。C離心30分鐘；步驟3-5-9，倒去上清液，將96孔板離心，達800轉即停，再在每孔加30ul70%(重量濃度)乙醇，3650轉/分，4t:離心15分鐘，倒去上清液，將96孔板離心，達800轉即停，將殘余酒精風干，室溫放置20分鐘；步驟3-5-10，每孔加入8ul95%(重量濃度)甲酰胺與ddH20混合物；步驟3-5-11，在ABI3730上進行結果讀取，用軟件Chromas查閱測序檢測結果第7以及第12外顯子都2類結果，即正常結果和突變結果；第7號外顯子與第12號外顯子都有2類結果，即正常結果和突變結果；圖3為PAH基因第7號外顯子R243Q實驗正常結果示意圖；圖4為PAH基因第12號外顯子R413P實驗正常結果示意圖；圖5為PAH基因第7號外顯子實驗有突變結果示意圖；圖6為PAH基因第12號外顯子實驗有突變結果示意圖；被測者PAH基因第7號外顯子與第12號外顯子的圖片與上述正常結果相同，均有突變。步驟4.最后得出檢測結果，給出結果分析如下表姓名林幸性別:年齡**門診號s*神神*住院號神林神送檢人林*送檢單位******送檢樣本口腔粘膜檢測單位******檢測技術DNA測序檢測項目苯丙酮尿癥診斷的細胞分子遺傳學檢測送檢時間xxxx-xx-xx報告日期XXXX-XX-XX基因檢湖結果:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>檢I8結果分析大量研究表明第7外顯子R243Q與第12外顯子R413P的突變是DNA堿基的錯義突變，導致氨基酸的改變，臨床表現(xiàn)為嚴重的代謝障礙。您的檢測結果中存在第7號以及第12外顯子的突變位點。序列表〈110〉上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司〈120〉一種苯丙氨酸羥化酶基因突變的檢測方法〈160>3〈210>1〈211>500〈212>DNA〈213〉人(Homosapiens)〈220〉〈221>mutationcagacatctg■gcc^gtctgcctagcgtcaaagcctatgtccctgggc60actactccactctcctagtgcctctgactcagtggtgatg120tttctttcttcttttcatcccagcttgcactggtttccgcctccnacctg180gctttcctctcgggatttcttgggtggcctggccttccgagtcttccact240catcagacatgg3tCC33gCccatgtatacccccgaaccgtgagtactgt300ccagttgccaggcac^tgagcgccatcttttcctgctgc■g^tgagg360ttgctggctggtCC3C3gg3ctagttgtctctccatccaa420gg卿tttggtcatcctgtgagactgtttgctggtagtac■tgg卿tttg500〈223>n=a或g〈400>1ElgCElgCgElggagttatgtgtagctttgagttggctggcctcctccagctatttgggttcacagactgatttcatctattc〈210>2〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉用于PAH基因第7號外顯子序列擴增的正向引物。〈400>2tctttcttcttttcatccbtcc22〈210>3〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉用于PAH基因第7號外顯子序列擴增的反向引物。〈400>3aacctcattcttcaaatctcca22〈210>4〈211>500〈212>DNA〈213>人(Homosapiens)〈220〉〈221>mutation〈223>n=c或g〈400>4tatatatgtgtttgtacatacatecagagg60agactcattaaaactccattccccccgcctcagccctggc120ggaggtgtccgtgttcctaaaaatgccactgagaactctc180ctttctccaaatggtgcccttcactcaagcctgtggttttggtcttegga240cacaatacctcggcccttctcagttcnctacgacccatac3CCC^3gg3300cagcagcttaagattttggctgattccatt360ttacgaggccactcggtttctcagtaatcgaagactgtctttccctacca420teaggag^aagcacctcca500gggttcattgggggactaaacttcccaagacctgctctagttaagactacactttgctgcttgaggtcttaatttacacctcgccataggtgtaagccat〈210>5〈211>22〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉用于PAH基因第12號外顯子序列擴增的正向引物?！?00>5ctcagttcgctacgacccatac〈210>6〈211>22〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉用于PAH基因第12號外顯子序列擴增的反向引物?！?00>6ttgtccaagacctcaatcaata權利要求一種苯丙氨酸羥化酶基因突變的檢測方法，其特征在于，具體步驟為步驟1.采集被測者口腔粘膜樣本；步驟2.基因組DNA的抽提方法采用硅膠吸附法抽提步驟1中的被測者口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，抽提時間為2-3小時，采用電泳凝膠成像法對DNA的濃度和純度作檢測，肉眼見清晰白色條帶即進入下一步檢測；步驟3.基因分型將每一個被測者樣本分別放入2個反應孔，2個反應孔分別檢測PAH基因7號以及12號外顯子突變情況，采用PCR技術進行擴增、凝膠電泳技術檢測純度以及測序技術對這些位點基因型進行確定；步驟3-1，反應體系配置在每一個反應孔中加入PCR標準反應體系，標準反應體系的引物濃度為10uM，反應體系總體積為20ul，由PCR試劑5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/μl的步驟2得到的PAHDNA模板3μl和去離子水11.2ul組成；PAH基因第7外顯子正向和反向引物正向引物tctttcttcttttcatccbtcc反向引物aacctcattcttcaaatctccaPAH基因第12外顯子正向和反向引物正向引物ctcagttcgctacgacccatac反向引物ttgtccaagacctcaatcaata步驟3-2，PCR反應條件將反應孔在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為95℃預熱15分鐘；再進行35個循環(huán)的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分鐘后，降溫至4℃；步驟3-3，將反應孔在PCR擴增儀反應后的產物進行電泳檢測，肉眼見清晰白色條帶即進入下一步a.1％瓊脂糖凝膠插小號孔梳子；b.2000bpDNA標記物6ul；c.步驟3-2的PCR產物4ul加入電泳緩沖液1ul；d.電泳電壓120v；e.電泳時間20min拍攝一張電泳圖；30min拍攝一張電泳圖；PAH基因第7外顯子目的條帶在330bp左右；PAH基因第12外顯子目的條帶在400bp左右；步驟3-4，純化在每一個反應孔中加入反應體系，反應體系總體積為7ul，由去離子水ddH2O3.825ul、PCR產物純化試劑SAP0.05ul、PCR產物純化試劑EXON10.125ul和步驟3-3的PCR產物3ul組成；終濃度PCR產物純化試劑SAP0.2U/7ul、PCR產物純化試劑EXON12.5U/7ul；反應條件為37℃、60min；80℃、15min；4℃恒溫保存；步驟3-5，將純化后的每一個反應孔用ABI3730測序儀進行測序；步驟3-5-1，從-20度冰箱中取出步驟3-4的PCR純化產物、測序試劑BigDye、四種dNTP、1uM測序引物，7號以及12號外顯子測序引物分別為tctttcttcttttcatccbtcc和ctcagttcgctacgacccatac；步驟3-5-2，記錄日期、所作反應的PCR純化產物名、所用引物、反應體系、測序試劑用量和PCR反應條件；步驟3-5-3，取一塊反應板，標上模板名、測序引物名和日期；步驟3-5-4，在每一個反應孔中加入反應體系，反應體系由0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的測序引物、3ul的PCR純化產物和0.1ul的去離子水ddH2O組成；體系分裝好后，上離心機，達900轉/分即停；步驟3-5-5，將反應板放在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為預熱96℃、10秒；再進行25個循環(huán)的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分鐘；60℃、4分鐘后，降溫至4℃恒溫保存；步驟3-5-6，擴增結束后，在每孔加入1ul125mM乙二胺四乙酸EDTA；步驟3-5-7，再在每孔加入無水乙醇15ul于室溫進行沉淀，不得超過24小時；步驟3-5-8，將96孔板放入冰凍離心機，3650轉/分，4℃離心30分鐘；步驟3-5-9，倒去上清液，將96孔板離心，達800轉即停，再在每孔加30ul70％乙醇，3650轉/分，4℃離心15分鐘，倒去上清液，將96孔板離心，達800轉即停，將殘余酒精風干，室溫放置20分鐘；步驟3-5-10，每孔加入8ul95％甲酰胺與ddH2O混合物；步驟3-5-11，在ABI3730上進行結果讀取，用軟件Chromas查閱測序檢測結果第7以及第12外顯子都2類結果，即正常結果和突變結果；步驟4，結果分析1.未檢出突變您的檢測結果中未發(fā)現(xiàn)PAH基因第7以及第12號外顯子上存在突變；2.檢出突變您的檢測結果中發(fā)現(xiàn)PAH基因第7或第12號外顯子上存在突變。全文摘要本發(fā)明涉及一種苯丙氨酸羥化酶基因突變的檢測方法，屬于分子生物學
技術領域：
。所述的苯丙氨酸羥化酶基因突變的檢測方法，其特征在于，具體步驟為采集被測者口腔粘膜樣本，抽提基因組DNA，基因分型和結果分析。本發(fā)明的優(yōu)點是簡單易行、可重復性高。文檔編號G01N27/447GK101693921SQ20091019695公開日2010年4月14日申請日期2009年10月10日優(yōu)先權日2009年10月10日發(fā)明者傅詠南,張奕申請人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司;