專利名稱：：豬戊型肝炎病毒elisa診斷試劑盒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種豬戊型肝炎病毒ELISA診斷試劑盒的制備方法。
背景技術(shù)：
：戊型肝炎病毒(H印atitisEvirus,HEV，簡(jiǎn)稱戊肝)是一種經(jīng)糞、口途徑傳播的非甲-非乙型肝炎病毒。該病毒會(huì)在人群引起暴發(fā)流行，主要侵害青壯年，對(duì)孕婦可造成20%的病死率。1986-1988年我國(guó)新疆南部地區(qū)因飲水污染導(dǎo)致戊型肝炎流行，共計(jì)發(fā)病119280例，死亡707例，是迄今世界上最大的一次戊型肝炎流行。近年來戊型肝炎發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)，據(jù)我國(guó)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，戊肝發(fā)病率2003年比2002年上升40.4%。因此，戊肝防控已列入各級(jí)公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的工作日程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HEV可以感染豬、牛、羊、鼠和雞等動(dòng)物。其中，病毒在豬和鼠的抗體陽(yáng)性率高于50X，由此推測(cè)動(dòng)物是HEV傳播的重要中間宿主?；蛐蛄蟹治霰砻?，從動(dòng)物體內(nèi)分離的戊型肝炎病毒與人的HEV有極高的基因同源性，并且已有人食用野豬肉和鹿肉而感染戊肝的報(bào)道，證明戊肝是一種可以通過食物傳播的人畜共患疫病。葛勝祥等中國(guó)人獸共患病雜志，2003，19(2)，108-109對(duì)我國(guó)20個(gè)省、市和自治區(qū)的120個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)的8626只成年豬進(jìn)行了HEV血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明平均感染陽(yáng)性率為83.4%，其中最高省份為內(nèi)蒙古(100%)，最低為湖北(68%)。鑒于我國(guó)HEV居高不下的感染率，對(duì)豬戊肝病毒的表位進(jìn)行研究，建立特異、有效的豬戊肝檢測(cè)方法，研制安全、有效的豬戊肝疫苗，了解的流行發(fā)病規(guī)律，阻斷該病由豬向人的傳播，對(duì)于保證人民的健康安全意義重大。雖然豬戊肝研究越來越得到全世界的重視，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)豬戊肝的研究多限于局部區(qū)域的流行病學(xué)調(diào)查和一些簡(jiǎn)單的動(dòng)物感染試驗(yàn)。在豬戊肝防控研究方面尚有以下有待回答問題和技術(shù)瓶頸。目前還沒有豬戊肝病毒的表位研究報(bào)道，用于檢測(cè)豬戊型肝炎病毒的方法還不是很完善，市場(chǎng)上用于豬戊肝檢測(cè)的試劑盒是用于人戊肝檢測(cè)的試劑盒，如北京萬泰試劑盒和上?？迫A試劑盒。雖然豬戊肝病毒與人戊肝病毒序列同源性很高，但是他們之間畢竟還是有些差別，用人的戊肝病毒表位來檢測(cè)豬戊肝病毒導(dǎo)致檢測(cè)的特異性不強(qiáng)，不能特異反映出豬戊肝流行規(guī)律。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種豬戊型肝炎病毒ELISA診斷試劑盒的制備方法，以解決豬戊型肝炎病毒快速檢測(cè)問題。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)—種豬戊型肝炎病毒ELISA診斷試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)抗原表位的計(jì)算機(jī)篩選；2)抗原的制備；3)血清的采集；4)間接ELISA方法的建立；5)間接ELISA方法的敏感性和特異性驗(yàn)證；6)試劑盒的穩(wěn)定性驗(yàn)證；7)對(duì)屠宰場(chǎng)進(jìn)行臨床檢測(cè)。所述間接ELISA方法還包括抗原稀釋、封閉、加一抗、加二抗、顯色、終止等步驟。本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性合格、重復(fù)性好。應(yīng)用該方法制得的試劑盒能有效檢出感染豬的戊型肝炎病毒，適用于大批量發(fā)病樣本的檢測(cè)，可用于豬戊肝的快速診斷，并預(yù)防、控制豬戊肝病毒的流行和阻斷戊肝病毒由豬向人傳播。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)驗(yàn)試劑和材料多肽swHEVll(由GL-Biochem(shanghai)Ltd.多肽合成儀合成)，Na2HP04(上海新華化工廠)，NaH2P04(上海新華化工廠)，Na2C03(上海試劑二廠)，NaHC03(上海文旻生化科技有限公司)，NaCl(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，KC1(上海試一化學(xué)試劑有限公司)，Tris-Base(上海雙向巴斯科技發(fā)展有限公司)，Tween-20(FarcoChemicalSupplies)，二甲基亞砜(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(上海斯高勒生物科技有限公司)，檸檬酸(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)，檸檬酸三鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，H202(上海化學(xué)試劑有限公司)，濃鹽酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，BSA(上海斯高勒生物科技有限公司)，二抗(ImmunologyCo固ltantsLaboratory，Inc.)，D_海藻糖(上海滬峰生物科技有限公司)，萬泰試劑盒(北京萬泰生物藥業(yè)有限公司)，酶標(biāo)板(廈門市云鵬科技發(fā)展有限公司)，電子天平(梅特勒_托利多儀器(上海)有限公司)，洗板機(jī)(Wellwash4MK2)禾口酶標(biāo)儀(MultiskanMK3)(Thermoelectroncorporation)，PH檢測(cè)儀(MettlerToledo)，微量振蕩器和漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。實(shí)施例1—、計(jì)算機(jī)篩選豬戊型肝炎病毒表位并合成多肽利用計(jì)算機(jī)軟件從豬戊型肝炎病毒全基因組開放閱讀框0RF1、0RF2和0RF3的對(duì)應(yīng)蛋白中篩選識(shí)別表位。表位識(shí)別的主要依據(jù)是蛋白質(zhì)或多肽氨基酸序列的親水性、表面度、柔韌度、Chou-Fasman的螺旋、片狀和轉(zhuǎn)角、Robson-Garnier的二級(jí)結(jié)構(gòu)及C_和N-末端來預(yù)測(cè)抗原綜合數(shù)據(jù)(AntigenicIndex,AI)。利用現(xiàn)有的軟件，如GCG(Madison，Wisconsin,USA)及DNAStar(Madison,Wisconsin,USA)從豬HEV的0RF1、0RF2和0RF3的蛋白中計(jì)算AI和輔助識(shí)別抗原區(qū)。根據(jù)豬HEV的0RF1、0RF2和0RF3的已知蛋白質(zhì)取得的氨基酸序列，再用計(jì)算機(jī)程序來估計(jì)它們的抗原區(qū)(AI)(—般10到15個(gè)氨基酸)。通過分析，分別從HEV0RF1、0RF2和0RF3選定12個(gè)多肽(參見表1)。表1多肽多抗原swHEV-1-12的氨基酸序列4PeptidesPositionORF1swHEV-1swHEV-2swHEV-3swHEV-4orf2swHEV-5swHEV-6swHEV-7orf3swHEV-8swHEV-9swHEV-10swHEV-11swHEV-12agrclevgahprsindnpnvlhrcflkpvgrdv諷wytaptrgpaancrrsalrglppvehnpkrleaayretcsrrgtaaypllgagiykvpvglsfdawernhrpgdesdsvltfeltdivhcrmaapsqrkavlstlvgrygrrtklyeaahadvrgseslrgfwkkhsgepgtllwntvw薩aviahcyefrdlkvaafkgddsvvlcsdyrqsrdaaaprqparplgsa徵dqsqrpaastrrrpapagaspltavapapdtapvpdvdsrgailrrqynlsaqqdkgiaiphdidlgesrvviqdydnqheqdrptpspapsrpfpvsisavgvlaphsalailedtadyparahtfddfcpecrslglqgccprhrpvsplavaaggaaavpavvsgvtgu:lspspsspspspifiqptpshltfqpqpglelalgsqpvhsaplgatspsapplppvvdlpqlglalgsqpvhsaplgatspsapplppvvdlpglglrrlgatspsapplppvvdlpqlglrrlalgsqpvhsaplgatspsappl83-140874-9251295-13461521-1582卯-153433-476606-65322-5855-11279-11491-11479-101上述序列由GL-Biochem(shanghai)Ltd通過多肽合成儀合成后，再由HPLC純化得到純度大于95%的多肽。二、采集血清用北京萬泰實(shí)業(yè)生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)的豬HEV總抗體ELISA試劑盒對(duì)采集到的豬血清進(jìn)行進(jìn)行鑒定，篩選出豬HEV陽(yáng)性血清和陰性血清。三、間接ELISA方法的建立用豬HEV陽(yáng)性血清和陰性血清對(duì)合成得到的豬HEV多肽進(jìn)行ELISA鑒定，篩選出豬HEV表位抗原。其具體步驟如下1.抗原稀釋取10iil濃度為10mg/ml的多肽(將5mg合成的多肽溶解在0.5ml二甲基亞砜匿S0而得)與90iUPBS液混勻，得到的抗原稀釋液溶度為1Pg/yl。再取15iU抗原稀釋液與5ml包被液混勻，得到的抗原稀釋溶度為3iig/ml。在酶標(biāo)板上加入抗原稀釋溶度100ii1/孔，4。C包被12h。2.封閉吸去包被液，每孔加入200iil封閉液于37t:封閉2h。封閉液為3%牛血清白蛋白(BSA)/TBS液。3.加一抗用TBST液洗板3次，每孔加1001%BSA/TBST液和10ii1血清，震蕩混勻，置37。C溫育lh。4.加二抗用TBST液洗板5次，每孔加100y1辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗豬IgG或IgM(均購(gòu)自于ImmunologyConsultantsLaboratory,Inc.，USA)稀釋液，置37。C溫育lh。二抗用1%BSA/TBST液稀釋(IgG以1:10000稀釋，IgM以1:100000稀釋)。5.顯色用TBST液洗板5次，每孔加底物液100yl，37度顯色10min。底物液是由10ml檸檬酸緩沖液，O.4mlTMB和333%H202配置而成的。6.終止每孔加50ii1lmol/1HC1的終止液來終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)0D值。當(dāng)(樣品OD值/陰性對(duì)照OD值)>2.1為陽(yáng)性，當(dāng)(樣品OD值/陰性對(duì)照OD值)<2.1為陰性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2和表3。表2合成豬HEV多肽與豬HEV陽(yáng)、陰性血清盤的免疫反應(yīng)(對(duì)于IgG)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>swHEV-10131124156swHEV-1121324066swHEV-1221324246注+，陽(yáng)性；-，陰性。表3合成豬HEV多肽與豬HEV陽(yáng)性血清盤的免疫反應(yīng)(對(duì)于IgM)候選多肽+陽(yáng)性參照數(shù)量swHEV-142024swHEV-21924swHEV-32124swHEV-402424swHEV-561824swHEV-661824swHEV-71924swHEV-81924swHEV-932124注+，陽(yáng)性廠，陰性。經(jīng)鑒定多肽swHEV-2、swHEV-3、swHEV-5、swHEV-7、swHEV-9、swHEV-10、swHEV-ll、swHEV-12是陽(yáng)性表位，是豬HEV表位。將swHEV-11作為包被抗原制作成豬戊型肝炎病毒診斷試劑盒。四、試劑盒的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)對(duì)試劑盒做批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)。批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)小于10%，批間重復(fù)變異系數(shù)小于20%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該試劑盒重復(fù)性良好(參見表4)。表4批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注X，平均0D值；S.D.，標(biāo)準(zhǔn)差；CV，變異系數(shù)。五、敏感性實(shí)驗(yàn)將試驗(yàn)血清樣品做一系列稀釋后，再用本發(fā)明的試劑盒和萬泰試劑盒進(jìn)行ELISA敏感性試驗(yàn)，兩者有較高的符合率(參見表5)。表5間接ELISA敏感性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>六、特異性實(shí)驗(yàn)與其它豬病血清樣品的ELISA特異性試驗(yàn)，結(jié)果顯示含有PCV和PRRS的豬血清樣品為HEV陽(yáng)性，表明現(xiàn)在豬中帶有其它類型的病毒中也帶有戊肝病毒，與現(xiàn)在的豬HEV的高流行率一致(參見表6)。表6間接ELISA特異性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>七、與抗原重組為基礎(chǔ)的試劑盒比較與萬泰試劑盒比較，符合率為73.4%(參見表7)，而與科華試劑盒比較，符合率為47.9%(參見表8)，說明本方法能很好的檢測(cè)出豬戊型肝炎病毒。表7與萬泰試劑盒比較結(jié)果萬泰試劑盒本試劑盒+6424一15總數(shù)_注+，陽(yáng)性；-，陰性。表8與科華試劑盒比較結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注+，陽(yáng)性；-，陰性。八、用本試劑盒對(duì)豬進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)用本試劑盒檢測(cè)上海一屠宰場(chǎng)1564頭成年豬，結(jié)果有1142頭豬被檢測(cè)出陽(yáng)性，陽(yáng)性率為72.9%，本方法檢測(cè)結(jié)果表明上海地區(qū)的食用豬的戊肝感染率很普遍。注上述各溶液的配方PBS液(500ml，pH7.4):0.575gNa2HP04和0.114gNaH2P04加蒸餾水溶解，定容至入500ml。包被液(1000ml，pH9.6):1.59gNa2C03和2.93gNaHC03加蒸餾水溶解，定容至入1000ml。TBS液(2000ml，pH8.6):16gNaCl、0.4gKC1和2.42gTrizma-Base加蒸餾水溶解，定容至入2000ml。TBST液(1000ml，Tween-20的濃度為0.1%):1000mlTBS液力Q入1.0mlTween_20。檸檬酸緩沖液(100ml，pH3.5-4.0):0.84g檸檬酸和0.294g檸檬酸鈉加蒸餾水溶解，定容至入100ml。終止液(500ml，1MHC1):40.88ml濃鹽酸溶解于459.12ml蒸餾水。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。10權(quán)利要求一種豬戊型肝炎病毒ELISA診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)抗原表位的計(jì)算機(jī)篩選；2)抗原的制備；3)血清的采集；4)間接ELISA方法的建立；5)間接ELISA方法的敏感性和特異性驗(yàn)證；6)試劑盒的穩(wěn)定性驗(yàn)證；7)對(duì)屠宰場(chǎng)進(jìn)行臨床檢測(cè)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述間接ELISA方法包括抗原稀釋、封閉、加一抗、加二抗、顯色、終止步驟。全文摘要本發(fā)明公開了一種豬戊型肝炎病毒ELISA診斷試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)抗原表位的計(jì)算機(jī)篩選；2)抗原的制備；3)血清的采集；4)間接ELISA方法的建立；5)間接ELISA方法的敏感性和特異性驗(yàn)證；6)試劑盒的穩(wěn)定性驗(yàn)證；7)對(duì)屠宰場(chǎng)進(jìn)行臨床檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性合格、重復(fù)性好。應(yīng)用本發(fā)明制得的試劑盒能有效檢出感染豬的戊型肝炎病毒，適用于大批量發(fā)病樣本的檢測(cè)，可用于豬戊肝的快速診斷，并預(yù)防、控制豬戊肝病毒的流行和阻斷戊肝病毒由豬向人傳播。文檔編號(hào)G01N33/531GK101726595SQ20091020068公開日2010年6月9日申請(qǐng)日期2009年12月24日優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日發(fā)明者于瑞嵩,劉啟文,吳瀟,唐雪明,朱宏,李震,王金斌,蔣玲曦,譚芙蓉,趙凱,陶世如申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院