專利名稱：：腹瀉性貝毒軟海綿酸oa金標(biāo)測(cè)試板條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種免疫測(cè)定方法，更具體地，涉及一種應(yīng)用金標(biāo)技術(shù)進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
：近20年來(lái)，有害赤潮在全球范圍內(nèi)頻繁爆發(fā)，其中有毒赤潮和藻毒素問(wèn)題日漸突出。赤潮藻毒素通過(guò)食物鏈傳遞，在魚、貝類體內(nèi)累積，會(huì)造成嚴(yán)重的海產(chǎn)品食用安全問(wèn)題。由這類海洋生物毒素引起食源性中毒事件已經(jīng)引起了各國(guó)的關(guān)注，因此國(guó)內(nèi)外紛紛對(duì)各種毒素進(jìn)行了多方面的研究，包括結(jié)構(gòu)和功能、毒素生源和檢測(cè)方法的研究等。腹瀉性貝毒(diarrheticshellfishpoisoning,DSP)是由有毒赤潮藻類鰭藻屬Di,hysis禾口原甲藻屬Prorocentrum中部分藻種產(chǎn)生的一類脂溶性天然化合物，主要成分為軟海綿酸(okadaicacid，0A)及其衍生物DTXs。DSP引起的中毒癥狀包括腹瀉(92%)、惡心(80%)、嘔吐(79%)、下腹部疼痛(53X)，一般在食用后幾小時(shí)，嚴(yán)重時(shí)短至30min發(fā)作，且無(wú)有效藥物治療。由于0A對(duì)熱穩(wěn)定，一般的加熱處理不會(huì)使毒性失效，因此由OA引起的海產(chǎn)品食物中毒事件已成為國(guó)內(nèi)外衛(wèi)生學(xué)上嚴(yán)重的問(wèn)題之一。目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè)0A的方法主要是小鼠法、高效液相色譜法(HPLC)和免疫檢測(cè)技術(shù)。小鼠法簡(jiǎn)便易行，但缺點(diǎn)是不能區(qū)別毒素的種類和結(jié)構(gòu)，受干擾較大，數(shù)據(jù)不精確；HPLC法可準(zhǔn)確分析毒素的含量和種類，檢測(cè)限可低至ng/g，但樣品前處理過(guò)程復(fù)雜，且儀器昂貴，需要專門的分析技術(shù)人員。免疫層析法是出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方式，由于它的快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，具有高度特異性和高敏感性，結(jié)果直觀可靠，而且試劑和樣品用量極少，無(wú)需貴重儀器設(shè)備，簡(jiǎn)化了煩瑣的常規(guī)操作過(guò)程，同時(shí)也減小了因操作引起的誤差，因此已成為一種目前發(fā)展最快的復(fù)合型免疫技術(shù)，受到國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注。免疫層析法(immunochromatography)是膠體金在免疫層析快速診斷技術(shù)中的應(yīng)用，其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品(尿液或血清)后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。專利CN101131390A描述了一種快速檢測(cè)腹瀉性貝毒的免疫膠體金試紙條及其制法，檢測(cè)下限達(dá)到12.5ng/ml，檢測(cè)速度達(dá)到15min?，F(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的即時(shí)性需要更短的檢測(cè)時(shí)間。影響免疫層析法診斷結(jié)果的因素很多，包括膠體金的制備，膠體金的標(biāo)記等等，本發(fā)明通過(guò)對(duì)多個(gè)條件的優(yōu)化，在不降低檢測(cè)靈敏度的同時(shí)，大大提高了檢測(cè)速度。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過(guò)對(duì)0A金標(biāo)測(cè)試板條及其制備方法中各個(gè)條件的優(yōu)化，使OA金標(biāo)測(cè)試條的檢測(cè)速度大大提高。技術(shù)方案如下—種腹瀉性貝毒軟海綿酸OA金標(biāo)測(cè)試板條，包括膠金墊，檢測(cè)線，控制線，所述的膠金墊包被有金標(biāo)記的軟海綿酸OA單克隆抗體，所述的控制線為羊抗鼠多克隆抗體，包被濃度為0.4-1.8mg/ml，包被量為0.5ul/cm。所述的金標(biāo)記的軟海綿酸OA單克隆抗體使用30nm的膠金體進(jìn)行金標(biāo)記，金標(biāo)記的單克隆抗體濃度優(yōu)選為200ug/ml。所述的膠金墊的OA單克隆抗體包被量?jī)?yōu)選為2.5iil/cm。所述的檢測(cè)線包被有軟海綿酸-卵白蛋白偶聯(lián)物，包被濃度優(yōu)選為0.75mg/ml，包被量?jī)?yōu)選為0.5ul/cm。所述的控制線包被有羊抗鼠多克隆抗體，包被濃度優(yōu)選1.Omg/ml，包被量?jī)?yōu)選為0.5ul/cm。—種權(quán)利要求1所述的腹瀉性貝毒軟海綿酸OA金標(biāo)測(cè)試板條制備方法，包括如下步驟(1)單克隆抗體的制備用軟海綿酸_牛血清蛋白偶聯(lián)物免疫BALB/c小鼠，取效價(jià)達(dá)到l:1.28乂106以上的免疫小鼠腹水用作軟海綿酸單克隆抗體；(2)金標(biāo)膠金體的制備制備30nm的膠金體用于金標(biāo)記軟海綿酸單克隆抗體，金標(biāo)時(shí)軟海綿酸單克隆抗體濃度優(yōu)選為200ug/ml;(3)檢測(cè)線包被抗原及濃度確定用碳二亞胺法制備包被抗原軟海綿酸_卵白蛋白偶聯(lián)物，包被濃度優(yōu)選用0.75mg/ml，包被量?jī)?yōu)選用0.5ul/cm;(4)控制線的制備用羊抗鼠多克隆抗體包被，包被濃度為0.4-1.8mg/ml，包被量?jī)?yōu)選為0.5ul/cm。本發(fā)明工作原理是待檢樣品溶液加在試紙條的一端，通過(guò)毛細(xì)作用向上移行，樣品中的OA先與金標(biāo)記的anti-OA-IgG發(fā)生特異性免疫反應(yīng)；反應(yīng)后，免疫復(fù)合物繼續(xù)上移至測(cè)試區(qū)(噴有OA-OVA，測(cè)試帶檢測(cè)線T)，如果樣品中的OA足夠多，全部結(jié)合了金標(biāo)抗體的位點(diǎn)，則免疫復(fù)合物在測(cè)試區(qū)不停留，測(cè)試條帶不顯色；隨后，免疫復(fù)合物繼續(xù)移動(dòng)至對(duì)照區(qū)(噴有羊抗鼠的第二抗體，對(duì)照帶控制線C)，發(fā)生第二種免疫結(jié)合反應(yīng)，免疫復(fù)合物被截留，對(duì)照帶顯紅色。當(dāng)樣品中不含OA或OA的量低于檢出限時(shí)，兩條帶均顯紅色，根據(jù)測(cè)試帶顏色的深淺可判斷樣品中待測(cè)物OA的多少。影響金標(biāo)測(cè)試條靈敏度及快速檢測(cè)的因素很多，包括金標(biāo)及金標(biāo)單抗的制備，金標(biāo)單抗的包被，檢測(cè)線T上抗體偶聯(lián)物的包被，控制線C上多抗的包被條件等等。本發(fā)明通過(guò)摸索不同用量的檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)，不同的金標(biāo)單抗?jié)舛?，不同的金?biāo)單抗包被量，不同的抗原偶聯(lián)物包被濃度，不同的二抗包被濃度以及不同的反應(yīng)時(shí)間來(lái)研究比較膠體金層析方法的效果，由此制備的金標(biāo)測(cè)試條靈敏度達(dá)到25ng/ml，只需3-5min即可目測(cè)判斷結(jié)果，大大提高了檢測(cè)效率。對(duì)比文件聲明測(cè)試靈敏度達(dá)到12.5ng/ml，是由于其將弱陽(yáng)性視為檢出，而本發(fā)明將弱陽(yáng)性視為未檢出，從而造成靈敏度表述上的差異。根據(jù)有關(guān)OA等DSP毒素的食用標(biāo)準(zhǔn)，各國(guó)所建議食用標(biāo)準(zhǔn)的安全濃度不同，美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)規(guī)定水產(chǎn)品可食部分為0.2mg/L;日本規(guī)定扇貝中腸腺OA為2.5iig/g，紫貽貝中腸腺1.5yg/g;澳大利亞規(guī)定100g可食部分OA含量低于25iig，lg中腸腺OA含量低于2yg;歐洲規(guī)定lg可食部分允許含0.2-0.6iigOA等價(jià)物；加拿大、英國(guó)等為20iig/100g軟組織；荷蘭定為0.12-0.14yg/g消化腺；我國(guó)貝類產(chǎn)品出口衛(wèi)生要求DSP毒素含量小于0.8mg/L(80yg/100g)。因此，本發(fā)明建立的OA檢測(cè)方法的檢出限，完全能滿足海產(chǎn)貝類食品安全檢測(cè)的需要。圖1:腹瀉性貝毒軟海綿酸OA金標(biāo)測(cè)試板條制備工藝流程圖圖2:膠體金層析試紙條檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施例方式下面根據(jù)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，所述方法若未說(shuō)明均屬常規(guī)方法，如記載于[美]J.薩姆布魯克D.W拉塞爾著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》或教科書?！⒃噭┡c儀器軟海綿酸(OA)標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自臺(tái)灣藻類生物技術(shù)有限公司)；1.0mg/ml羊抗鼠HRP-IgG(購(gòu)自上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)；卵白蛋白(0VA)、牛血清白蛋白(BSA)、新生牛血清、N-羥丁二酰亞胺(N-hydroxysuccinimide)、N，N雙環(huán)乙烷碳二亞胺(N，N-dicyclohexylcarbodiimide，DCC)、N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethyformamide，DMF)、聚乙二醇(polythyleneglycol-4000，PEG)、福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、二甲基亞砜(匿S0)、MES緩沖液等為Sigma公司產(chǎn)品；SP2/0骨髓瘤細(xì)胞(來(lái)自國(guó)家農(nóng)科院上海獸醫(yī)研究所)；1%氯金酸(HAuCl4)，l^檸檬酸三鈉，0.02MTris+1%BSA，其余為國(guó)產(chǎn)分析純。硝酸纖維素NC膜，膠體金墊，吸水紙，樣品墊(均為德國(guó)SchleicherSchull產(chǎn)品);酶標(biāo)儀(Bio-RadiMark)，噴膜機(jī)(Biodot-ZX1000)，噴金機(jī)(Biodot-XYZ3000)，切條機(jī)(Biodot-CM4000)。二、包被抗原0A-0VA的制備取4.5mgN-羥丁二酰亞胺和9mgN，N雙環(huán)乙烷碳二亞胺溶于30mlMES緩沖液，然后取50ii1加入到100iil含lmgOA的DMS0溶液中；另稱取3mg0VA，用PBS溶液溶解；將上述活化的0A和10iil吡啶加入0VA溶液中，攪拌6小時(shí)，4t:過(guò)夜。隨后透析，分裝，-2(TC保存。三、0A單克隆抗體的制備制備免疫原取4.5mgN-羥丁二酰亞胺和9mgN，N雙環(huán)乙烷碳二亞胺溶于30mlMES緩沖液，然后取50ii1加入到100iil含lmgOA的DMS0溶液中；另稱取3mgBSA，用PBS溶液溶解；將上述活化的OA和10ill吡啶加入BSA溶液中，攪拌6小時(shí)，4。C過(guò)夜。隨后透析，分裝、-2(TC保存。制得免疫抗原0A-BSA。免疫小鼠取BALB/c小鼠(購(gòu)于上海斯克萊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)，首免按150g/只OA-BSA加完全弗氏佐劑足墊注射，三周后加強(qiáng)免疫一次，改用不完全弗氏佐劑，皮下注射，劑量為200g/只；以后每隔二周繼續(xù)加強(qiáng)免疫，用不完全弗氏佐劑，肌肉注射，劑量為200iig/只。第四次腹腔加強(qiáng)免疫，劑量為200iig/只，不用佐劑。3d后取脾臟，進(jìn)行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合無(wú)菌取免疫小鼠脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞以5:1體積比混合，按常規(guī)方法進(jìn)行融合，融合劑為PEG。陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選融合細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積的1/31/2時(shí)，采用間接ELISA方法分步篩選雜交瘤細(xì)胞，首先標(biāo)記單個(gè)克隆或2個(gè)克隆(細(xì)胞克隆相互分開(kāi))的細(xì)胞培養(yǎng)孔，以1Pg/mL0A-0VA包被酶標(biāo)板孔，分別加入被測(cè)孔的培養(yǎng)上清液，常規(guī)ELISA篩選陽(yáng)性孔(P/N>2.1)，然后分別以0A-0VA和BSA包被，進(jìn)行陽(yáng)性克隆的再次篩選，以僅對(duì)0A-0VA包被孔顯色判為陽(yáng)性，最后對(duì)初篩的陽(yáng)性孔的上清液作間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，判斷50ng/ml0A對(duì)0D值的影響，經(jīng)23次檢測(cè)抑制率均達(dá)到100%的孔，及時(shí)轉(zhuǎn)移到單孔中培養(yǎng)并用有限稀釋法進(jìn)行克隆化。經(jīng)過(guò)亞克隆，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，取細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好即在一般光鏡下觀察，細(xì)胞是均質(zhì)而透明的，結(jié)構(gòu)不是很明顯，且增值速度快的克隆細(xì)胞進(jìn)行建株液氮保存。單抗的生產(chǎn)與純化取7周齡的BLAB/c雌性小鼠，腹腔注射滅菌降植烷0.5mL。7d后腹腔接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠分別注射1X106個(gè)細(xì)胞，待小鼠腹部膨大，瀕死不動(dòng)時(shí)，用針頭采集腹水，用硫酸銨沉淀法純化腹水，并用DEAE纖維素層析柱繼續(xù)純化腹水，凍干保存。收集的腹水液，用間接ELISA方法測(cè)定效價(jià)。效價(jià)達(dá)到1:1.28Xl(f以上的免疫小鼠腹水即可用作單克隆抗體。四、0A單抗的定量將0A單抗用PBS作1:10稀釋，測(cè)定A260=0.2496，A280=0.4273，按公式A280*l.45-A260*0.74計(jì)算單抗的濃度為4.35mg/ml。五、膠體金的制備檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，金顆粒大小受檸檬酸三鈉濃度等因素影響很大，改變檸檬酸三鈉濃度，便可制備出不同顆粒大小的膠體金。根據(jù)Frens于1973介紹的膠體金顆粒的制備方法取lml1%氯金酸(HAuCl4)溶液，加入到100ml水中，加熱至沸，再加入0.5-4ml1%檸檬酸三鈉，混合煮沸5分鐘，直到顏色不發(fā)生變化。該方法可制備15-60nm不同直徑大小的金顆粒，顆粒大小取決于加入的檸檬酸三鈉的量。通過(guò)這種方法制得不同直徑大小的金顆粒，標(biāo)記鼠抗OA單克隆抗體，按工藝組裝試紙條，以一例陽(yáng)性標(biāo)本及PBS加樣，比較不同顆粒大小金標(biāo)結(jié)合物的生物活性。(陽(yáng)性標(biāo)本為50ng/ml濃度的OA，要求5分鐘內(nèi)不出現(xiàn)檢測(cè)線，PBS要求顯色強(qiáng)，下同)結(jié)果見(jiàn)表1:表l不同大小金顆粒標(biāo)記的效果比較擰檬酸三鈉的量金顆粒直徑陽(yáng)性標(biāo)本檢出結(jié)果申P(guān)BS標(biāo)本結(jié)果穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*注指5分鐘檢測(cè)結(jié)果綜合比較上述方法及發(fā)明的結(jié)果，只有30nm的膠體金能同時(shí)滿足陽(yáng)性檢出時(shí)間要求和PBS結(jié)果要求，因此選擇30nm的膠體金用于標(biāo)記，確定膠體金顆粒的制備工藝0.01%氯金酸(HAuCl4)水溶液100ml加熱至沸騰，加入1%檸檬酸三鈉1.5ml，混勻，煮沸5分鐘，待膠體金溶液顏色由藍(lán)經(jīng)紫變紫紅后，冷卻備用。據(jù)此工藝制備的膠體金顆粒滿足試紙的檢測(cè)要求。六、膠體金對(duì)單抗的標(biāo)記取30nm的膠體金2ml，加50-400ug/ml單抗0.2ml，攪拌中混勻1小時(shí)，再加20mgBSA，繼續(xù)攪拌30分鐘，10000rpm離心30分鐘，去上清，沉淀用420mMTris-HCL100ul溶解，加BSA至終濃度為10mg/ml，置4°C中備用。七、金標(biāo)時(shí)單抗?jié)舛鹊拇_定用噴金機(jī)對(duì)各單抗?jié)舛葮?biāo)記的金標(biāo)鼠抗OA進(jìn)行包被，均噴2.5ul/cm，干燥，組裝試紙，以50ng/ml，OA陽(yáng)性標(biāo)本和PBS加樣比較不同單抗量對(duì)金標(biāo)單抗靈敏度的影響。表2不同金標(biāo)記單抗?jié)舛鹊男Ч容^單抗標(biāo)記濃度(ug/ml)陽(yáng)性標(biāo)本檢出結(jié)果*PBS標(biāo)本結(jié)果50不出線顯色弱100不出線顯色弱200不出線顯色強(qiáng)300不出線顯色強(qiáng)400出線顯色強(qiáng)*注指5分鐘檢測(cè)結(jié)果結(jié)果顯示，金標(biāo)記時(shí)單抗?jié)舛扔?00ug/ml，陽(yáng)性與陰性標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果最滿意。八、金標(biāo)鼠抗OA單克隆抗體包被量的確定用噴金機(jī)對(duì)金標(biāo)鼠抗OA單克隆抗體進(jìn)行包被，噴不同的噴量，干燥，按工藝組裝試紙，以陽(yáng)性標(biāo)本和PBS加樣比較不同包被濃度的靈敏度高低。表3不同噴量下陽(yáng)性標(biāo)本和PBS的檢出結(jié)果噴量(pl/cm)陽(yáng)性標(biāo)本檢出結(jié)果*PBS標(biāo)本結(jié)果1.0不出線顯色弱L5不出線顯色弱2.0不出線顯色弱2.5不出線顯色強(qiáng)3.0出線顯色強(qiáng)3.5出線顯色強(qiáng)*注指5分鐘檢測(cè)結(jié)果當(dāng)噴量達(dá)到2.5ii1/cm，陽(yáng)性標(biāo)本和PBS標(biāo)本的檢出結(jié)果即已符合設(shè)計(jì)要求，綜合考慮最終確定金標(biāo)單抗的包被量，即噴金機(jī)噴量為2.5ii1/cm。九、檢測(cè)線(T)工作液濃度的確定調(diào)整鼠抗OA-OVA的包被濃度，按工藝(見(jiàn)圖1)組裝試劑條，以陽(yáng)性標(biāo)本和PBS加樣比較不同包被濃度的靈敏度高低。結(jié)果見(jiàn)表4:表4不同OA-OVA包被濃度的效果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*注指5分鐘檢測(cè)結(jié)果當(dāng)包被濃度達(dá)到0.75mg/ml，既能滿足陽(yáng)性標(biāo)本的檢出要求，又能達(dá)到PBS標(biāo)本的要求，而進(jìn)一步提高包被濃度則滿足不了陽(yáng)性標(biāo)本的要求，降低濃度則不能達(dá)到PBS標(biāo)本的檢出要求。綜合考慮最終確定鼠抗OA-OVA檢測(cè)線包被濃度為0.75mg/ml，包被量為0.5ul/cm。十、控制線(C)工作液濃度的確定調(diào)整羊抗鼠IgG抗體濃度，按正常制備工藝，見(jiàn)流程圖l，組裝試劑條，以PBS加樣比較不同包被濃度對(duì)照線顯色時(shí)間。結(jié)果見(jiàn)表5:表5不同二抗包被濃度的效果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>包被濃度達(dá)到1.0mg/ml，對(duì)照線即在lmin內(nèi)清晰可辯，符合設(shè)計(jì)要求。最終確定對(duì)照線包被濃度1.0mg/ml，包被量為0.5ul/cm。^^—、反應(yīng)時(shí)間的確定A方案反應(yīng)2分鐘觀察結(jié)果。B方案反應(yīng)3分鐘觀察結(jié)果。C方案反應(yīng)5分鐘觀察結(jié)果。D方案反應(yīng)10分鐘觀察結(jié)果。A方案結(jié)果選擇檢測(cè)濃度為50ng/ml的OA標(biāo)準(zhǔn)品，在2分鐘內(nèi)檢測(cè)區(qū)(T)無(wú)條帶，PBS顯色弱，測(cè)試不合格。B方案結(jié)果選擇檢測(cè)濃度為50ng/ml的OA標(biāo)準(zhǔn)品，在3分鐘內(nèi)檢測(cè)區(qū)(T)無(wú)條帶，PBS顯色強(qiáng)，測(cè)試合格。C方案結(jié)果選擇檢測(cè)濃度為50ng/ml的OA標(biāo)準(zhǔn)品，在5分鐘內(nèi)檢測(cè)區(qū)(T)無(wú)條帶，PBS顯色強(qiáng)，測(cè)試合格。D方案結(jié)果選擇檢測(cè)濃度為50ng/ml的OA標(biāo)準(zhǔn)品，在10分鐘內(nèi)檢測(cè)區(qū)(T)有條帶，PBS顯色強(qiáng)，測(cè)試不合格。根據(jù)結(jié)果選擇反應(yīng)時(shí)間為3-5分鐘觀察結(jié)果，10分鐘結(jié)果無(wú)效。十二、靈敏度的檢測(cè)以各最佳條件制備金標(biāo)測(cè)試條，對(duì)各濃度OA作靈敏度檢測(cè)，結(jié)果如下表6不同OA濃度的靈敏度效果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*注指5分鐘檢測(cè)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)圖2，從左至右為檢測(cè)不同樣本的OA金標(biāo)測(cè)試板條顯示結(jié)果。所檢測(cè)的OA濃度依次為1，空白對(duì)照，PBS溶液；2，OA濃度6.25ng/ml;3，OA濃度12.5ng/ml;4，OA濃度25ng/ml。其中OA金標(biāo)測(cè)試板條上，01為樣本區(qū)，02為結(jié)果觀測(cè)區(qū)，03C為控制線，04T為檢測(cè)線，05S為樣本區(qū)的標(biāo)志。由圖可知，檢測(cè)空白對(duì)照和6.25ng/mL的OA標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)試帶有明顯的紅色(見(jiàn)圖1第1、2塊測(cè)試板條的T線)；測(cè)試12.5ng/mL的OA標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)試帶顯示非常淺的紫紅色(見(jiàn)圖1第3塊測(cè)試板條的T線)；測(cè)試25ng/mL的OA標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)試帶完全被抑制，沒(méi)有顏色(見(jiàn)圖1第4塊測(cè)試板條的T線)。由此可以看出，在C線清晰可見(jiàn)的同時(shí)，以肉眼不出T線為標(biāo)準(zhǔn)，制備的金標(biāo)試紙條靈敏度可達(dá)到25ng/ml。十三、使用方法若測(cè)試板條放fC中保存，由冰箱中取出后需在室溫中放置30分鐘，方能啟封。板條平放，加樣，滴加3滴樣品，待3-5分鐘觀察結(jié)果。T線不顯色為陽(yáng)性結(jié)果，顯色為陰性結(jié)果。C線顯色為該板條有效，不顯色為板條已無(wú)效。十四、保存和有效期置2°C_30°C中保存，遠(yuǎn)離潮濕和光照。有效期為二年。權(quán)利要求一種腹瀉性貝毒軟海綿酸OA金標(biāo)測(cè)試板條，包括膠金墊，檢測(cè)線，控制線，所述的膠金墊包被有金標(biāo)記的軟海綿酸OA單克隆抗體，其特征在于，所述的控制線為羊抗鼠多克隆抗體，包被濃度為0.4-1.8mg/ml，包被量為0.5ul/cm。2.如權(quán)利要求1所述的金標(biāo)測(cè)試板條，其特征在于，所述的金標(biāo)記的軟海綿酸OA單克隆抗體使用30nm的膠金體進(jìn)行金標(biāo)記，金標(biāo)記的單克隆抗體濃度為200ug/ml。3.如權(quán)利要求2所述的金標(biāo)測(cè)試板條，其特征在于，所述的膠金墊的OA單克隆抗體包被量為2.5ul/cm。4.如權(quán)利要求l所述的金標(biāo)測(cè)試板條，其特征在于，所述的檢測(cè)線包被有軟海綿酸-卵白蛋白偶聯(lián)物，包被濃度為0.75mg/ml，包被量為0.5ul/cm。5.如權(quán)利要求1所述的金標(biāo)測(cè)試板條，其特征在于，所述的控制線包被有羊抗鼠多克隆抗體，包被濃度1.Omg/ml，包被量為0.5ul/cm。6.—種權(quán)利要求1所述的腹瀉性貝毒軟海綿酸0A金標(biāo)測(cè)試板條的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)單克隆抗體的制備用軟海綿酸-牛血清蛋白偶聯(lián)物免疫BALB/c小鼠，取效價(jià)達(dá)到l:1.28乂106以上的免疫小鼠腹水用作軟海綿酸單克隆抗體；(2)金標(biāo)膠金體的制備制備30nm的膠金體用于金標(biāo)記軟海綿酸單克隆抗體，金標(biāo)時(shí)軟海綿酸單克隆抗體濃度為200ug/ml;(3)檢測(cè)線包被抗原及濃度確定用碳二亞胺法制備包被抗原軟海綿酸-卵白蛋白偶聯(lián)物，包被濃度用0.75mg/ml，包被量用0.5ul/cm;(4)控制線的制備用羊抗鼠多克隆抗體包被，包被濃度為O.4-1.8mg/ml，包被量為0.5ul/cm。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種腹瀉性貝毒軟海綿酸OA金標(biāo)測(cè)試板條及其制備方法，提供了一種赤潮毒素腹瀉性貝毒軟海綿酸的快速膠體金免疫層析檢測(cè)方法。本發(fā)明通過(guò)制備平均粒徑30nm的膠體金，用以標(biāo)記抗軟海綿酸單克隆抗體；將軟海綿酸半抗原與卵清蛋白的偶聯(lián)物包被在硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)帶，羊抗鼠二抗作為質(zhì)控帶，依據(jù)免疫競(jìng)爭(zhēng)法原理，制備了快速檢測(cè)腹瀉性貝毒軟海綿酸OA金標(biāo)測(cè)試板條。本發(fā)明通過(guò)對(duì)膠體金的制備，膠體金的標(biāo)記等等，多個(gè)條件的優(yōu)化，大大提高了OA金標(biāo)測(cè)試板條的檢測(cè)速度。該方法靈敏度達(dá)25ng/mL，只需3-5min即可目測(cè)判斷結(jié)果，可作為檢驗(yàn)水產(chǎn)品貝類是否感染赤潮毒素并進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)大量篩選的有效手段。文檔編號(hào)G01N33/577GK101726600SQ20091020124公開(kāi)日2010年6月9日申請(qǐng)日期2009年12月16日優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日發(fā)明者何培民,柳俊秀,汪卿,蔡春爾,饒濤申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)