專利名稱：一種定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，特別是一種定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的
試劑盒，該試劑盒以實時熒光定量聚合酶鏈反應技術(shù)，能夠早期、快速判斷樣品是否被副溶 血性弧菌污染。
背景技術(shù)：
副溶血性弧菌(又稱嗜鹽菌Vibrio Parahaemolyticus VP)是革蘭氏陰性多形態(tài) 桿菌或稍彎曲弧菌。本菌嗜鹽畏酸，在無鹽培養(yǎng)基上，不能生長，3% 6%食鹽水繁殖迅速， 每8 9分鐘為1周期，低于0. 5%或高于8%鹽水中停止生長。在食醋中1 3分鐘即死 亡，加熱至56t:，在5 10分鐘滅活，在濃度1%的鹽酸中，5分鐘內(nèi)死亡。它在自然界中廣 泛存在，是一種條件致病菌，可引起人和動物致病，引起內(nèi)臟出血、胃腸中毒癥狀，臨床上可 引起敗血癥、胃腸道感染、內(nèi)臟出血等。由于副溶血性弧菌有12種0抗原及59種K抗原， 據(jù)其發(fā)酵糖類的情況可分為5個類型。各種弧菌對人和動物均有較強的毒力，其致病物質(zhì) 主要有致熱性溶血素(TDH)和TDH類似溶血素(TRH)，具有溶血活性、腸毒素和致死作用。
副溶血性弧菌食物中毒也稱嗜鹽菌食物中毒，是進食含有該菌的食物所致，主要 來自海產(chǎn)品或鹽腌漬品，常見者為蟹類、烏賊、海蜇、魚、黃泥螺等，其次為蛋品、肉類或蔬 菜。臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀。主要病理變化為空腸及回 腸有輕度糜爛，胃粘膜炎、內(nèi)臟(肝、脾、肺)淤血等。 傳統(tǒng)的副溶血性弧菌的檢測方法主要依靠副溶血性弧菌的生物學特征(如革蘭 陰性菌，嗜鹽懼酸、能產(chǎn)致熱性溶血素等)結(jié)合多種生化試劑進行檢測，該方法具有一定的 特異性和敏感性，但操作繁瑣且耗時長，主要用于對大規(guī)模樣品進行檢測。由于副溶血性 弧菌感染進展快，易耐藥，病死率高，傳統(tǒng)的檢測方法有可能延誤診斷和治療，因此，開發(fā)早 期、快速的檢測技術(shù)非常必要。 近年來，隨著分子診斷技術(shù)的飛速發(fā)展，聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù)已經(jīng)廣泛應用 于細菌、病毒基因水平的研究，也給衛(wèi)生條件的快速鑒定提供了可能。國內(nèi)外已經(jīng)有部分實 驗室采用PCR擴增核酸來檢測副溶血性弧菌，如鐘凱等通過擴增16S rRNA基因來檢測冷凍 蝦仁、沙丁魚是否受到副溶血性弧菌的污染。 實時熒光PCR技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的一種核酸檢測技術(shù)，使用一種帶有核電 偶聯(lián)裝置(CCD)的PCR擴增儀，通過檢測熒光信號的動態(tài)變化實時反映PCR的每個循環(huán) 的擴增水平。CCD能夠按照一定的程序周期性的發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測熒光信 號，并通過軟件分析匯總到工作站得到擴增曲線。T叫man PCR技術(shù)是實時熒光PCR的一 禾中(Mackay IM et al. Real—time PCR in virology. Nucleic AcidsRes. 20025 ;30 (6): 1292—1305 ;Lie， Y. s. ， Petropoulos， c.j. ， Advancesin quantitative PCR technology : 5'皿clease assays. CurrentOpinion in Biotechnology 1998. 9，43-48.)。 與傳統(tǒng)的PCR 相對比，其在反應體系中增加了一條兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團的探針。探針 結(jié)構(gòu)完整時，熒光報告基團發(fā)出熒光的能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團，呈現(xiàn)淬滅效應。如果擴增過程中有靶序列的存在，擴增的過程中探針分子逐漸被水解切斷，熒光報告基團與淬滅基團相 互解離，阻斷了二者熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應，熒光報告基團發(fā)出熒光信號。隨著擴增的進 行，熒光信號隨著目的片段的擴增而呈現(xiàn)線性增強。 與普通PCR相比，T叫Man PCR技術(shù)有如下有點通過對擴增曲線以及對數(shù)增長期 的循環(huán)閾值(Ct)的分析，摒棄普通PCR方法受多種因素干擾的重點分析方法，能夠?qū)z測 樣品進行準確定量分析，從而有效檢測藥物治療的效果將DNA擴增與檢測過程融合為一 體，可以實時、動態(tài)監(jiān)測DNA擴增的全過程，省掉了PCR后處理過程，大大縮短了結(jié)果分析時 間，使得該方法更加快捷、方便；由于采取一種封閉的檢測模式，從而減少了氣溶膠污染和 由此造成的假陽性；由于在普通PCR基礎上增加了一條可與模板互補配對的熒光探針，進 一步提高了檢測靶多核苷酸的特異性。因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析 中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應用。 美國食品與藥品管理局(FDA)已經(jīng)批準了一些定量檢測病原體的PCR診斷試劑 盒，如用于HIV，結(jié)核分枝桿菌、沙眼衣原體等的實時熒光檢測的試劑盒。同樣，中國目前也 已批準了乙型肝炎、丙型肝炎、HPV、 HIV和SARS等的實時熒光PCR檢測試劑盒的生產(chǎn)和臨 床應用。因此，現(xiàn)在亟待需要發(fā)展一種能夠檢測副溶血性弧菌的實時熒光PCR方法，滿足副 溶血性弧菌的檢測與監(jiān)測工作的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑
盒，該試劑盒使用實時熒光PCR技術(shù)來定性及定量檢測樣品中副溶血性弧菌微量污染及感
染早期在實驗室診斷中的應用。其基本原理是利用一對靶多核苷酸的特異性引物和一條靶
多核苷酸的特異性探針，在耐熱DNA聚合酶、高質(zhì)量的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及
Mg2+等PCR反應緩沖液中，通過TL988、 ABI7500等熒光PCR擴增儀實現(xiàn)靶多核苷酸的循環(huán)
擴增，從而達到快速、實時、定量檢測靶多核苷酸的目的。 為了實現(xiàn)上述任務，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案 —種定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，該試劑盒包括分別包 裝的DNA提取液、PCR擴增反應液、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和定量標準品并加蓋密封的多 個試劑瓶或試管，其特征在于，所述的PCR擴增反應液中含有靶多核苷酸擴增的正向引物 VP-F、反向引物VP-R、寡核苷酸探針VP-P、耐熱DNA聚合酶以及脫氧核糖核苷三磷酸。
所述的正向引物VP-F和反向引物VP-R以及寡核苷酸探針VP-P的核苷酸序列是
正向引物VP-F : 5' -CGGTAGTAAACACACTGTCAG-3';
反向引物VP-R : 5' -GTTTCAGGCTCACCATGACG-3'; 其中，正向引物VP-F可向5'和3'端方向各延伸3個堿基，反向引物VP-R可向5'
和3'端方向各延伸3個堿基； 所述的寡核苷酸探針的核苷酸序列是 寡核苷酸探針VP-P :5'-CATATCCACACGCAAACTTACCG-3' (SEQ IDN0:3)，該寡核苷 酸探針可向5'和3'端方向各延伸3個堿基。 所述的PCR擴增反應中的正向引物VP-F和反向引物VP-R的濃度均為0. 33umo1/ L，所述的寡核苷酸探針VP-P濃度為0. 22umol/L。
所述的PCR擴增反應液中還有濃度為2. 5mmol/L的鎂離子。
所述的PCR擴增反應液中的耐熱DNA聚合酶的濃度為2U/人份。
所述的PCR擴增反應液中的脫氧核糖核苷三磷酸的濃度為0. 2mmol/L。
所述的DNA提取液由chelex-lOO、 NaOH、 EDTA組成。 本發(fā)明的定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，可以檢測出副溶血
性弧菌的最低濃度為5X 102個/ml，說明本試劑盒具有非常好的靈敏度。 本發(fā)明針對副溶血性弧菌的外毒素基因保守區(qū)設計特異性引物和寡核苷酸探針，
可檢測出副溶血性弧菌病原體，但不能檢出非副溶血性弧菌病原體，說明本試劑盒具有很
好的特異性。 本發(fā)明的定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，可以檢測食品樣品 及臨床胃腸道炎癥、內(nèi)臟出血等疾病患者的嘔吐物、血液、糞便等樣品中的副溶血性弧菌病 原體，可為靈敏、快速早期診斷副溶血性弧菌污染及感染和診斷副溶血性弧菌反復感染提 供可靠的實驗證據(jù)；同時由于能夠準確定量，所以可對臨床用藥進行有效監(jiān)測。


圖l顯示3個陽性參考品的檢測結(jié)果圖，3個陽性參考品的Ct值為17 28，擴增 曲線有明顯指數(shù)增長期，成S型，可明確判定為陽性。 圖2顯示陰性參考品的檢測結(jié)果圖，7個陰性參考品的擴增曲線平直且與閾值線 無交叉，沒有Ct值，可明確判定為陰性。7個陰性參考品包括近源種明斯特沙門氏菌，痢 疾志賀氏菌，奇異變形桿菌，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，陰溝腸桿菌，蜂房哈夫尼亞菌，粘質(zhì)沙 雷氏菌，都是從中國微生物菌種保藏管理委員會所購買的標準菌株。 圖3顯示線性與靈敏度標準品擴增結(jié)果的標準曲線。針對模板數(shù)為5. OX 101 1.0Xl(f個/ml的反應體系進行TaqMan PCR分析。當副溶血性弧菌個數(shù)為5. 0 X 102個時， 檢測樣品的Ct值在35左右，即檢測下限靈敏度可達5. OX 102個/ml。繪制得到的標準曲 線斜率為-3.43，在Y軸的的截距為34.64，相關(guān)系數(shù)(R2) = 0.994。 圖4顯示同一份陽性標本10次重復性實驗的檢測曲線，可看出不同的擴增曲線均 在同一Ct值范圍，變異系數(shù)CV〈5X，說明試劑盒的重復性好。 圖5顯示六個臨床陽性標本的擴增曲線。六個標本的Ct值分別是23.83，24.63， 26. 02,27. 05,27. 28,29. 61 ;結(jié)合擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，均能夠判定為陽性。
以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式
本發(fā)明是一種檢測懷疑被副溶血性弧菌污染的食品樣品和臨床上懷疑因感染副 溶血性弧菌而發(fā)生的胃腸炎，內(nèi)臟出血性疾病等患者樣品中的病原體副溶血性弧菌存在的 試劑盒，特別是涉及以實時熒光定量聚合酶鏈反應技術(shù)早期、快速診斷副溶血性弧菌污染 或感染的試劑盒。 眾所周知，在使用已知的實時熒光定量PCR技術(shù)檢測和定量分析食品及臨床樣品 某特定靶核酸的實踐中，為了減少和避免檢測結(jié)果的假陰性或假陽性，提高定量分析的準 確性，一個關(guān)鍵性的基本技術(shù)環(huán)節(jié)是如何基于已知的靶多核苷酸序列設計并制備適當?shù)囊锖凸押塑账崽结槨Ｉ暾埲藢崟r熒光定量PCR技術(shù)應用于副溶血性弧菌的所有已知變異 體之基因組多核苷酸的檢測和定量分析，成功地實現(xiàn)了本發(fā)明。 本發(fā)明的定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，包括分別包裝的 DNA提取液、PCR擴增反應液、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和定量標準品并加蓋密封的多個試 劑瓶或試管，和分隔并集中包裝這些試劑瓶或試管的包裝盒，PCR擴增反應液中含有靶多核 苷酸擴增的正向引物VP-F、反向引物VP-R、寡核苷酸探針VP-P、耐熱DNA聚合酶以及脫氧核 糖核苷三磷酸。 上述正向引物VP-F和反向引物VP-R以及寡核苷酸探針VP-P的核苷酸序列是 正向引物VP-F :5'—CGGTAGTAAACACACTGTCAG-3， (SEQ ID N0:1); 反向引物VP-R :5'-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3' (SEQ ID NO :2); 其中，正向引物VP-F可向5'和3'端方向各延伸3個堿基，反向引物VP-R可向5'
和3'端方向各延伸3個堿基。 寡核苷酸探針的核苷酸序列是 寡核苷酸探針VP-P :5'-CATATCCACACGCAAACTTACCG-3' (SEQ IDN0:3)，其中該寡
核苷酸探針序列可向5'和3'端方向各延伸3個堿基。 上述DNA提取液由chelex-100、NaOH、EDTA組成。 上述PCR擴增反應液中至少含有 (a)耐熱DNA聚合酶，最佳用量為2U/人份； (b)脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)，最佳濃度為0. 20mmol/L ; (c)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物VP-F，最佳濃度均為 0.33umol/L ; (d)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物VP-R，最佳濃度均為 0.33umol/L ; (e)能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團 的寡核苷酸探針VP-P，最佳濃度為0. 22umol八 (f)PCR擴增反應液中還有鎂離子，最佳鎂離子濃度為2. 5mmol/L。 其中，正向引物VP-F和反向引物VP-R的濃度均為O. 33umol/L，所述的寡核苷酸探
針VP-P濃度為0. 22umol/L。 用于PCR擴增的最佳反應溫度和時間為93°C ，預變性5 8分鐘；然后93°C ， 15 秒，58 °C ， 40秒，共40個循環(huán)。 上述陰性質(zhì)控品為不含副溶血性弧菌的液體培養(yǎng)基或生理鹽水。 上述陽性質(zhì)控品為副溶血性弧菌弧菌標準菌株培養(yǎng)液，包括3X 107個/ml的強陽
性質(zhì)控品和3X 103個/ml的臨界陽性質(zhì)控品。 上述定量標準品為副溶血性弧菌標準株培養(yǎng)液，包括4個濃度梯度即3Xl(f個 /ml、3X106個/ml、3Xl()5個/ml和3Xl()4個/ml。
以下是發(fā)明人給出的具體的實施例。
實施例1 :副溶血性弧菌檢測試劑的研制 1、引物和探針的設計通過對Genbank數(shù)據(jù)庫已有的全部副溶血性弧菌核酸序列 以及國內(nèi)外已發(fā)表文獻中報導的核酸序列進行序列比對分析，以與副溶血性弧菌致病有關(guān)的主要毒力因子外毒素基因為擴增靶位點，選擇無二級結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段，根據(jù)引物 和探針設計的基本原則，利用軟件和人工設計多對引物和探針。
2、臨床樣本的選擇根掘國內(nèi)外相關(guān)文獻報道，檢測的樣品可選自各種食品標本， 如海產(chǎn)品或鹽腌漬品，常見者為蟹類、烏賊、海蜇、魚、黃泥螺等，其次為蛋品、肉類或蔬菜； 也可選自臨床上因食用副溶血性弧菌污染可疑的患者的血液、尿液、糞便等樣品。
3、反應體系的建立與優(yōu)化 1)樣品的準備以中國微生物菌種保藏管理委員會的副溶血性弧菌標準菌株作 為副溶血性弧菌檢測的陽性標準品；以明斯特沙門氏菌，痢疾志賀氏菌，奇異變形桿菌，小 腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，陰溝腸桿菌，蜂房哈夫尼亞菌，粘質(zhì)沙雷氏菌作為陰性參考品。分別 用DNA提取液煮沸法提取上述陽性標準品與陰性參考品的基因組DNA待用。
2)引物和寡核苷酸探針的篩選以上述1中設計的多組引物探針分別檢測上述的 陽性質(zhì)控品與陰性質(zhì)控品的基因組DNA，經(jīng)反復試驗，篩選出以下特異性、靈敏度和重復性 好的最佳引物和寡核苷酸探針組合 正向引物VP-F :5'—CGGTAGTAAACACACTGTCAG-3， (SEQ ID N0:1)
反向引物VP-R :5'-GTTTCAGGCTCACCATGACG-3' (SEQ ID NO :2)
寡核苷酸探針VP-P :5'-CATATCCACACGCAAACTTACCG-3' (SEQ IDNO :3);
3)正向引物、反向引物和寡核苷酸探針濃度的優(yōu)化 在PCR擴增反應液中其他組分不變的情況下，分別使用從O. 15umol/L至0. 5咖o1/ U農(nóng)度梯度的引物和從O. 075umol/L至0. 5umol/L濃度梯度的寡核苷酸探針進行PCR反應， 經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的正向引物VP-F和反向引物VP-R濃度為0. 33umol/L、寡核 苷酸探針VP-P濃度為0. 22umol/L。
4)鎂離子濃度的優(yōu)化 在反PCR擴增反應液其它組分不變的情況下，分別使用從lmmol/L至3mmol/L濃 度梯度的鎂離子進行PCR反應，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的鎂離子濃度為2. 5mmo1/ L。 5)耐熱DNA聚合酶用量的優(yōu)化 在40uL反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從1U (酶單位)至8U濃度 梯度的酶用量/人份進行PCR反應，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的酶用量為2U/人份。
6)脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)濃度的優(yōu)化 在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從O. lmmol/L至0. 25mmol/L濃度 梯度的dNTPs進行PCR反應，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的dNTPs濃度為0. 20mmol/L。
5)反應溫度的優(yōu)化根據(jù)酶的活性和靶多核苷酸的長度，主要對退火溫度和延伸 時間進行了優(yōu)化，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的退火溫度和時間為93t:預變性，5 8min ;然后93°C ， 15s， 58°C ， 40s，共40個循環(huán)。 4、靈敏度實驗以麥氏比濁法測定上述ATCC的副溶血性弧菌標準株純培養(yǎng)物的 濃度為3. 0 X 109個/mL，然后10倍梯度稀釋成3. 0 X 106個/mL、3. 0 X 105個/mL、3. 0 X 104 個/mL、3. OX 103個/mL、3. OX 102個/mL、3. OX 101個/mL。作為副溶血性弧菌線性靈敏度 定量標準品，檢測結(jié)果表明，本試劑盒的靈敏度為5. OX 102個/mL。 5、臨床標本檢測以懷疑被副溶血性弧菌污染的食品作為待檢標本，分別用DNA提取液煮沸法提取標本的基因組DNA后，經(jīng)上述優(yōu)化建立的核酸擴增體系檢測，結(jié)果表明
本試劑盒可以很靈敏的檢測出臨床標本中的副溶血性弧菌病原體。 實施例2 :副溶血性弧菌檢測試劑盒及其應用 1、制備包括下列組成成分的試劑盒DNA提取液2管(500ul/管)、PCR擴增反應 液20管(20ul/管)、陰性質(zhì)控品l管(100ul/管)、陽性質(zhì)控品l管(50ul/管)、定量標準 品4管(50ul/管)。
2、標本采集、運送和保存 (1)標本采集包括各種食品標本，如血液、尿液、痰液、膿汁以及穿剌液等，亦包 括來自醫(yī)院臨床上的各種標本，如嘔吐物、血液、糞便等，按照PCR取樣要求進行操作；按照 國家化妝品微生物檢驗標準進行操作。密閉送檢。
(2)標本保存和運送標本可立即用于測試，也可保存于一 2(TC待測，保存期為6
個月。標本運送時應保存在(TC 8°C 。 3、檢測步驟 (1)標本處理與DNA提取 增菌處理與DNA提取上述采集的各類標本都可以按照國家有關(guān)副溶血性弧菌 標準培養(yǎng)方法進行增菌后，取菌液50ul加入50ul DNA提取液中充分混勻，IO(TC恒溫處理 10±1分鐘，12，000rpm離心5分鐘，備用; 非增菌處理與DNA提取根據(jù)不同類型的標本選擇合適的方法或以常規(guī)的核酸提 取試劑盒方法進行DNA提取。 以痰液為例痰液中加入4倍體積的4% NaOH溶液，混勻后室溫或65。C水浴30分 鐘；用槍頭或吸管混勻后吸取lml至1. 5ml離心管中，5， OOOrpm離心5分鐘；去上清，留沉 淀及液體約20ul，加入lml滅菌生理鹽水，混勻后12， OOOrpm離心5分鐘；去上清，留沉淀 及液體約20ul，加入30ulDNA提取液充分混勻，IO(TC恒溫處理10±1分鐘，以12， OOOrpm離 心5分鐘，備用。 (2)PCR反應與結(jié)果分析 分別取陰性質(zhì)控品、標本、陽性質(zhì)控品、定量標準品各5ul，加入PCR反應管中進行 PCR擴增。PCR循環(huán)條件是93°C ，預變性5min ;然后93°C ， 15s， 58°C ， 40s，共40個循環(huán)。
反應結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根據(jù)PCR擴增結(jié)果所得到的曲線圖調(diào)節(jié)分析參 數(shù)，使標準曲線(Std curve)窗口下的標準曲線達到最佳(即相關(guān)性數(shù)值絕對值> 0. 97) (參見附圖3所示)。由附圖1可以看出，陽性樣品的熒光曲線與設定的閾值線有一交點， 由交點所在位置得出Ct值分別為26. 77,30. 34,33. 04 ;在附圖2中，由于陰性標本的熒光 曲線低于閾值，故沒有Ct值。最后由儀器自動分析裝置計算出未知標本的測定數(shù)值(Qty)， 即標本中副溶血性弧菌的濃度分別為6. 04X 105、8. 38X 103、1. 36X 103(個/ml)。
實施例3 :應用副溶血性弧菌檢測試劑盒定量檢測臨床樣品 臨床樣品來自南京兒童醫(yī)院的半固體培養(yǎng)物，直接取上層培養(yǎng)物50ul作為待測 物，標本處理與DNA提取、PCR反應與結(jié)果分析參照實施例2進行。 PCR反應結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線先調(diào)節(jié)分析參數(shù)，使標準曲線(Std curve)窗口 下的標準曲線達到最佳(即相關(guān)性數(shù)值絕對值>0.97)，然后分析臨床樣品。臨床樣品的 檢測結(jié)果如附圖5所示六個臨床陽性標本擴增曲線的Ct值分別是23. 83,24. 63,26. 02，27.05,27. 28，29.61，結(jié)合擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，均能夠判定為陽性。參照同一次試 驗中線性定量參考品的標準曲線圖(如附圖3所示)可以判定六個臨床陽性標本的副溶血 性弧菌濃度分別為1. 53X 1067、5. 37X 106、9. 12X105、5. 11X105、4. 22X 105、9. 14Xl(f個
'ml。
0091]核苷酸序列表
0092]〈110〉西安天隆科技有限公司
0093]〈120〉 一種定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒
0094]〈140〉
0095]〈141〉
0096]〈160>3
0097]〈210>SEQ ID NO :1
0098]〈211>21
0099]〈212>DNA
0100]〈213〉人工序列
0101]〈220〉
0102]〈223〉
0103]〈400>SEQ ID NO :1
0104]CGGTAGTAAACACACTGTCAG
0105]〈210>SEQ ID NO :2
0106]〈211>20
0107]〈212>DNA
0108]〈213〉人工序列
0109]〈220〉
0110]〈223〉
0111 ]〈400>SEQ ID NO :2
0112]GTTTCAGGCTCACCATGACG
0113]〈210>SEQ ID NO :3
0114]〈211>23
0115]〈212>DNA
0116]〈213〉人工序列
0117]〈220〉
0118]〈223〉
0119]〈400>SEQ ID NO :3
0120]CATATCCACACGCAAACTTACCG
權(quán)利要求
一種定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，該試劑盒包括分別包裝的DNA提取液、PCR擴增反應液、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和定量標準品并加蓋密封的多個試劑瓶或試管，其特征在于，所述的PCR擴增反應液中含有靶多核苷酸擴增的正向引物VP-F、反向引物VP-R、寡核苷酸探針VP-P、耐熱DNA聚合酶以及脫氧核糖核苷三磷酸。
2. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在 于，所述的正向引物VP-F和反向引物VP-R以及寡核苷酸探針VP-P的核苷酸序列是正向引物VP-F:5' -CGGTAGTAAACACACTGTCAG-3'; 反向引物VP-R:5' -GTTTCAGGCTCACCATGACG-3';其中，正向引物VP-F可向5'和3'端方向各延伸3個堿基，反向引物VP-R可向5'和 3'端方向各延伸3個堿基；所述的寡核苷酸探針的核苷酸序列是寡核苷酸探針VP-P :5'-CATATCCACACGCAAACTTACCG-3' (SEQ IDN0 :3)，該寡核苷酸探 針可向5'和3'端方向各延伸3個堿基。
3. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在 于，所述的PCR擴增反應中的正向引物VP-F和反向引物VP-R的濃度均為0. 33umol/L，所述 的寡核苷酸探針VP-P濃度為0. 22umol/L。
4. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在 于，所述的PCR擴增反應液中還有濃度為2. 5mmol/L的鎂離子。
5. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在 于，所述的PCR擴增反應液中的耐熱DNA聚合酶的濃度為2U/人份。
6. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在 于，所述的PCR擴增反應液中的脫氧核糖核苷三磷酸的濃度為0. 2mmol/L。
7. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在 于，所述的DNA提取液由chelex-100、 NaOH、 EDTA組成。
8. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在 于，所述的陰性質(zhì)控品為不含副溶血性弧菌的液體培養(yǎng)基或生理鹽水。
9. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在 于，所述的陽性質(zhì)控品為副溶血性弧菌弧菌標準菌株培養(yǎng)液，包括3X 107個/ml的強陽性 質(zhì)控品和3X 103個/ml的臨界陽性質(zhì)控品。
10. 如權(quán)利要求1所述的定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，其特征 在于，所述的定量標準品為副溶血性弧菌標準株培養(yǎng)液，包括4個濃度梯度即3X 107個/ ml、3X106個/ml、3Xl()5個/ml和3Xl()4個/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定量檢測食品及臨床樣品中副溶血性弧菌的試劑盒，該試劑盒包括分別包裝的DNA提取液、PCR擴增反應液、陰性標準品、陽性參考品和定量標準品并加蓋密封的多個試劑瓶或試管，其特征在于，所述的PCR擴增反應液中含有靶多核苷酸擴增的正向引物VP-F、反向引物VP-R、寡核苷酸探針VP-P、耐熱DNA聚合酶以及脫氧核糖核苷三磷酸。可以檢測食品樣品及臨床胃腸道炎癥、內(nèi)臟出血等疾病患者的嘔吐物、血液、糞便等樣品中的副溶血性弧菌病原體，可為靈敏、快速早期診斷副溶血性弧菌污染及感染和診斷副溶血性弧菌反復感染提供可靠的實驗證據(jù)；同時由于能夠準確定量，所以可對臨床用藥進行有效監(jiān)測。
文檔編號G01N21/64GK101709331SQ20091021860
公開日2010年5月19日 申請日期2009年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日
發(fā)明者彭年才, 李紅東, 焦剛, 赤宏濤 申請人:西安天隆科技有限公司