專利名稱：使用液相色譜熒光法測定水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
—種使用液相色譜熒光法測定水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的方法。
背景技術(shù)：
己烯雌酚屬激素類藥物，添加在飼料中，有促進(jìn)魚類等養(yǎng)殖活體生長的作用，目前 在水產(chǎn)養(yǎng)殖上有廣泛的使用。
己烯雌酚作為一種人工合成的化學(xué)物質(zhì)，具有較強(qiáng)的類雌激素作用。經(jīng)科學(xué)試驗
確證，己烯雌酚是一種致癌物質(zhì)，長期食用，會對人和動物的健康造成危害，甚至致癌，乃至
威脅生命。世界多數(shù)國家已經(jīng)禁止在飼料中使用己烯雌酚。我國農(nóng)業(yè)部第193號公告規(guī)定，
截止2002年5月15日，己烯雌酚及其鹽、酯制劑停止在所有食品動物中使用。 為了滿足檢測所有食品動物中是否含有己烯雌酚成分，需要有切實可行的檢測方法。 以前，己烯雌酚殘留的檢測方法有ELLISA法、HPLC紫外法、GC-MS法、LC-MS/MS法。 HPLC紫外法的測限為0. 25mg/kg。 ELLISA法雖然測限比較低，但因其操作方法復(fù)雜和過為 專業(yè)，只適合作為一種篩選方法使用。GC-MS法和LC-MS/MS法成本昂貴，無法在生產(chǎn)中普及 使用。 目前，尚沒有成本低廉、測限又可以滿足使用需求的DES(己烯雌酚)殘留檢測方 法，不能滿足社會進(jìn)步和市場日益繁榮的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明設(shè)計一種使用液相色譜熒光法測定水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的方法，通過 對己烯雌酚進(jìn)行磺化水解處理，使其生成發(fā)有熒光的反應(yīng)物，然后用高效液相色譜熒光檢 測器對其進(jìn)行分析，從而得到能夠與LC-MS/MS法相媲美的靈敏度和回收率，適合水產(chǎn)品中 己烯雌酚殘留量的測定。 本發(fā)明成本低廉、方法簡潔、測限可以滿足使用需求，適合在生產(chǎn)實踐中推廣使 用。 本發(fā)明使用的儀器如下Waters 2695高效液相色譜儀，配2475熒光檢測器、高速離心機(jī)(LG-10A)、超聲波 清洗器、氮吹儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、真空裝置和機(jī)械泵或ASPEC XL4自動固相萃取系統(tǒng)、SLH柱、 SPE裝置、正相固相萃取小柱(SLH)。
本發(fā)明使用的試劑如下 己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品(99. 5 % ，美國SIGMA-ALDRICH公司)、硫酸(分析純)、溴化十六 烷基三甲銨(分析純)、甲酸(色譜純)、乙酸乙酯(色譜純)、甲醇(色譜純)。
本發(fā)明的色譜條件如下 色譜柱Sunfire C184. 6mmX 150mm， 5 ii m ;流動相A為甲醇，B為2mmol/L溴化 十六烷基三甲銨；A : B = 40 : 60 ;流速0. 8mL/min ;柱溫35。C;激發(fā)波長發(fā)射波長進(jìn)樣量:20il L。 本發(fā)明的方法如下 (1)稱取10g絞碎的水產(chǎn)品樣品于50mL塑料離心管中，加入乙酸乙酯15_25mL， 均質(zhì)25-30s，7000r/min離心5-15min，移取乙酸乙酯層于100mL梨形瓶中，殘渣再加入 10mL乙酸乙酯，重復(fù)提取一次，離心后合并乙酸乙酯層，于40-5(TC旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至含水量低于 1-3%，用l-3mL正己烷-乙酸乙酯(85+15)混合溶劑溶解殘留物，攪拌5_8分鐘；
(2)用4-6ml正己烷、4-6mL乙酸乙酯活化SLH柱，將提取液加到SLH柱上，并控制 流速不超過1. 5-2. 5mL/min ;用l-3mL正己烷，l_3ml正己烷-乙酸乙酯(85+15)混合溶液淋 洗SLH柱，用8-12mL正己烷-乙酸乙酯(80+20)混合溶液洗脫，流速控制不超過1. 5_2. 5mL/ min，收集洗脫液，40-6(TC水浴氮氣吹干至初始狀態(tài)； (3)在氮氣吹干的離心管中加入0. 5-1. 5mL硫酸，漩渦混合0. 3-0. 7min，放置 80-100min，在離心管中加入7-9mL水，漩渦混合0. 3-0. 7min，放置25-35min，加入4-6mL乙 酸乙酯提取液，提取液40-6(TC水浴氮氣吹干至2-4%含水量，用lmL流動相定容，供高效液 相色譜測定即可。 使用本發(fā)明時，配制濃度為1. 0， 2. 0， 5. 0， 10. 0， 50. 0， 100. 0 ii g/L的己烯雌酚標(biāo) 準(zhǔn)溶液，按本發(fā)明工藝步驟和儀器條件，可得到己烯雌酚濃度(Y)與峰面積(x)之間的線性 關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r大于0. 99。按信噪比大于3計算，水產(chǎn)品中的己烯雌酚的檢出限可達(dá)到 0. 1 ii g/Kg。 本發(fā)明成本低廉、方法簡潔、測限低，適合在生產(chǎn)實踐中推廣使用，是市場中需要 的技術(shù)手段，有積極的社會意義和社會需求。
具體實施例方式
現(xiàn)舉一實例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
實施例 以測定海參中己烯雌酚殘留量為例 (1)稱取10g絞碎的水產(chǎn)品樣品于50mL塑料離心管中，加入乙酸乙酯20mL，均質(zhì) 30s，7000r/min離心10min，移取乙酸乙酯層于100mL梨形瓶中，殘渣再加入10mL乙酸乙 酯，重復(fù)提取一次，離心后合并乙酸乙酯層，于45t:旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用2mL正己烷-乙酸乙酯 (85+15)混合溶劑溶解殘留物，攪拌6分鐘； (2)用5ml正己烷、5mL乙酸乙酯活化SLH柱，將提取液加到SLH柱上，并控制流 速不超過2mL/min ;用2mL正己烷，2ml正己烷-乙酸乙酯(85+15)混合溶液淋洗SLH柱， 用lOmL正己烷-乙酸乙酯(80+20)混合溶液洗脫，流速控制不超過2mL/min，收集洗脫液， 5(TC水浴氮氣吹干至初始狀態(tài)； (3)在氮氣吹干的離心管中加入lmL硫酸，漩渦混合O. 5min，放置90min，在離心管 中加入8mL水，漩渦混合0. 5min，放置30min，加入5mL乙酸乙酯提取液，提取液5(TC水浴氮 氣吹干，用lmL流動相定容，供高效液相色譜測定即可。 實例證明，在海參樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本發(fā)明的方法進(jìn)行回收，重復(fù)5次， 計算回收率和精密度，結(jié)果表明添加量為0. 1 0. 5ii g/kg水平時，平均回收率均大于 70% ;相對標(biāo)準(zhǔn)偏差都小于10%。
權(quán)利要求
一種使用液相色譜熒光法測定水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的方法，其特征在于(1)稱取10g絞碎的水產(chǎn)品樣品于50mL塑料離心管中，加入乙酸乙酯15-25mL，均質(zhì)25-30s，7000r/min離心5-15min，移取乙酸乙酯層于100mL梨形瓶中，殘渣再加入10mL乙酸乙酯，重復(fù)提取一次，離心后合并乙酸乙酯層，于40-50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至含水量低于1-3％，用1-3mL正己烷-乙酸乙酯(85+15)混合溶劑溶解殘留物，攪拌5-8分鐘；(2)用4-6ml正己烷、4-6mL乙酸乙酯活化SLH柱，將提取液加到SLH柱上，并控制流速不超過1.5-2.5mL/min；用1-3mL正己烷，1-3ml正己烷-乙酸乙酯(85+15)混合溶液淋洗SLH柱，用8-12mL正己烷-乙酸乙酯(80+20)混合溶液洗脫，流速控制不超過1.5-2.5mL/min，收集洗脫液，40-60℃水浴氮氣吹干至初始狀態(tài)；(3)在氮氣吹干的離心管中加入0.5-1.5mL硫酸，漩渦混合0.3-0.7min，放置80-100min，在離心管中加入7-9mL水，漩渦混合0.3-0.7min，放置25-35min，加入4-6mL乙酸乙酯提取液，提取液40-60℃水浴氮氣吹干至2-4％含水量，用1mL流動相定容，供高效液相色譜測定即可。
全文摘要
一種使用液相色譜熒光法測定水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留量的方法，(1)稱取10g絞碎的水產(chǎn)品樣品于50mL塑料離心管中，加入乙酸乙酯15-25mL，均質(zhì)25-30s，7000r/min離心5-15min，移取乙酸乙酯層于100mL梨形瓶中，用1-3mL正己烷-乙酸乙酯(85+15)混合溶劑溶解殘留物，攪拌5-8分鐘；(2)用4-6ml正己烷、4-6mL乙酸乙酯活化SLH柱，將提取液加到SLH柱上，用8-12mL正己烷-乙酸乙酯(80+20)混合溶液洗脫，流速控制不超過1.5-2.5mL/min，收集洗脫液，40-60℃水浴氮氣吹干至初始狀態(tài)；(3)在氮氣吹干的離心管中加入0.5-1.5mL硫酸，在離心管中加入7-9mL水，用1mL流動相定容，供高效液相色譜測定即可。
文檔編號G01N30/74GK101718755SQ200910223269
公開日2010年6月2日 申請日期2009年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月23日
發(fā)明者劉慧慧, 宮向紅, 張世娟, 張秀珍, 徐英江, 田秀慧 申請人:山東省海洋水產(chǎn)研究所