專利名稱：單抗納米微球聯(lián)合檢測特異性血小板自身抗體的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單抗納米微球聯(lián)合檢測血小板特異性自身抗體的試劑盒，用于檢
測血液中的血小板特異性自身抗體，為免疫介導(dǎo)的血小板減少綜合征提供診斷依據(jù)。本發(fā) 明還涉及該試劑盒的制備及用于檢測血小板特異性自身抗體的方法。
背景技術(shù)：
特發(fā)性血小板減少性紫癒(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP)是一禾中 免疫介導(dǎo)的血小板減少綜合征，是臨床最常見的出血性疾病，約占出血性疾病總數(shù)的30% 。 一般認(rèn)為，該病是由自身抗體致敏的血小板被單核巨噬細胞系統(tǒng)過度破壞所致，以廣泛皮 膚、粘膜或內(nèi)臟出血，血小板減少，骨髓巨核細胞發(fā)育、成熟障礙，血小板生存時間縮短及血 小板自身抗體出現(xiàn)為特征。血小板自身抗體主要為抗血小板膜糖蛋白(GP)IIb/IIIa為主 要的自身抗體，其次為抗GPIb自身抗體，少數(shù)表現(xiàn)為抗GPIa/IIa、GPIV自身抗體。因此對血 小板特異性自身抗體的檢測是免疫介導(dǎo)的血小板減少綜合征的診斷依據(jù)。目前國內(nèi)外檢測 血小板特異性自身抗體的方法主要有單克隆抗體特異性血小板抗原固定術(shù)(MAIPA)、抗原 捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(MACE)和流式細胞術(shù)(FCM)。 MAIPA和MACE方法由于操作復(fù)雜、用 血量大、靈敏度低等技術(shù)上的限制而極少應(yīng)用于臨床診斷。FCM分析血小板膜糖蛋白特異性 自身抗體的方法尚不成熟。1995年，Koksch等利用流式細胞術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法， 測定抗血小板膜糖蛋白特定位點的自身抗體，然而該方法步驟繁瑣，難以標(biāo)準(zhǔn)化，無法作為 診斷ITP的常規(guī)檢查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種單抗納米微球聯(lián)合檢測血小板特異性自身抗體的試劑 盒和采用該試劑盒檢測血小板特異性自身抗體的方法，它能快速、簡便、準(zhǔn)確地檢測血小板 自身抗體，以便于對自身免疫性疾病的早期診斷。本發(fā)明還提供了該試劑盒的制備方法。
本發(fā)明檢測血小板特異性自身抗體的試劑盒的組成為 (1).以牛血清白蛋白封閉的分別連有單克隆抗體SZ-2，SZ-22，SZ-21和7E3的四 種單抗_聚苯乙烯納米微球，溶劑為PBS，聚苯乙烯納米微球濃度為2mg/ml，四種單抗-聚 苯乙烯納米微球包括 SZ-2-納米微球溶液3ml ，單克隆抗體SZ-2的濃度30 ii g/ml ， SZ-22-納米微球溶液3ml，單克隆抗體SZ-22的濃度為60 y g/ml， SZ-21-納米微球溶液3ml，單克隆抗體SZ-21的濃度為30 ii g/ml， 7E3-納米微球溶液3ml ;單克隆抗體7E3的濃度為20 y g/ml ; SZ-2， SZ-22, SZ-21和7E3分別為抗人血小板膜糖蛋白GPIb， GPIIb， GPIIIa和
GPIIb/IIIa的單克隆抗體。 (2).硫氰酸熒光素連接的羊抗人多克隆抗體6ml，濃度為15ii g/ml ; (3). PBS液，是0. 15mol/LNaCl、0. 01mol/LNa2HP04和0. 01mol/LNaH2P04的混合溶
4液，pH7. 4。 上述試劑盒用于檢測血小板特異性自身抗體的方法，其特征是如下步驟
(1).取血小板裂解液待檢標(biāo)本四份，每份50 ii 1，分別加入50 ii 1 SZ-2-納米微 球、SZ-22-納米微球、SZ-21-納米微球、7E3-納米微球，室溫震蕩孵育2h，用0. Olmol/LPBS 洗滌液洗滌，離心，棄上清； (2).分別加入異硫氰酸熒光素連接的羊抗人多克隆抗體100iU，室溫震蕩孵育 30min，用洗滌液PBS洗滌，然后用600 y 1 PBS重懸； (3).四份懸液分別在流式細胞儀上檢測，每份計數(shù)1500-2000個微球，根據(jù)FSC/ SSC散點圖和FL-2的直方圖，分別得到SZ2、SZ22、SZ21、7E3四種被檢微球的平均熒光強度 值； (4).分別以健康人血小板裂解液的SZ2、 SZ22、 SZ21、7E3四種單抗微球的各平均 熒光強度作為基本對照；計算出步驟(3)測得的四種微球的各平均熒光強度值與對應(yīng)的基 本對照的平均熒光強度值之比率，當(dāng)比率分別大于1.37、1.24、1.48、1. 19時，判為陽性。
上述劑盒的制備方法，其特征是如下步驟
(1).單克隆抗體的純化 用親和層析柱Protein G-S印harose 4B純化單克隆抗體SZ_2、 SZ_21、 SZ-22和 7E3，經(jīng)濃縮透析后分別得到單克隆抗體SZ-2、 SZ-21、 SZ-22和7E3的PBS溶液。
(2).單克隆抗體與納米微球的連接 用0. 1M、 pH9. 6碳酸緩沖液分別稀釋單克隆抗體SZ_2、 SZ_22、 SZ-21和7E3至終 濃度為30、60、30和20 ii g/ml ; 經(jīng)丙酮洗滌的聚苯乙烯納米微球加入上述單克隆抗體中，4t:搖床過夜后，離心，
棄上清；用吐溫-20PBS溶液洗滌，離心，棄上清；然后用20mg/ml牛血清白蛋白的PBS溶液 封閉微球，搖床2h，用吐溫-20PBS溶液洗滌，離心，棄上清；加0. Olmol/LPBS重懸納米微 球，至納米微球濃度為2mg/ml，按劑量分裝，4t:保存； (3).配制異硫氰酸熒光素連接的羊抗人多克隆抗體，濃度為15ii g/ml，按劑量分 裝； (4).配制PBS液，使溶液中含有O. 15mol/L NaC1、0. Olmol/L Na2HP04和0. 01mo1/
L NaH2P04pH7. 4 ;按劑量分裝。 (5)各分裝物裝入試劑盒，4t:保存。 本發(fā)明試劑盒，包含分別攜帶抗人血小板膜糖蛋白GPIb、 GPIIb、 GPIIIa、 GPIIb/ IIIa復(fù)合物的四種單克隆抗體SZ-2、 SZ-22、 SZ-21和7E3(分別是抗原CD42b、 CD41b、 CD61、 CD61a的單克隆抗體)的聚苯乙烯納米微球，即SZ-2-納米微球、SZ-22-納米微球、 SZ-21-納米微球和7E3-納米微球，這些微球能夠在體外分別特異性地捕獲血小板糖蛋白 GPIb、 GPIIb、 GPIIIa、 GPIIb/IIIa特異性抗原分子CD42b、 CD41b、 CD61、 CD61a，并能夠在流 式細胞儀上應(yīng)用，從而能聯(lián)合測定ITP(免疫性血小板減少)患者GPIb、 GPIIb、 GPIIIa和 GPIIb/IIIa的自身抗體，達到臨床明確診斷ITP患者亞類，指導(dǎo)ITP患者治療。本試劑盒 檢測的是血小板上的自身抗體，所以特別為早期診斷ITP提供依據(jù)。研究表明，SZ-2-納米 微球、SZ-22-納米微球、SZ-21-納米微球和7E3-納米微球的表面抗體飽和載量變化非常 小，變異系數(shù)分別為2. 15%、2.65%、4. 22%、3.05%。納米微球表面抗體結(jié)合量至少是傳統(tǒng)ELISA板抗體結(jié)合量的四倍，從客觀上增大了該方法的檢測靈敏度。因此，用本發(fā)明試 劑盒及其建立的進行血小板特異性自身抗體的檢測方法重復(fù)性好，四種單克隆抗體納米微 球的批內(nèi)變異系數(shù)分別為3. 26%、2. 86%、1.65%、4. 94% ;批間變異系數(shù)分別為5. 86%、 4. 74%、5. 69%、7. 56%。經(jīng)35例健康獻血者和血小板減少癥患者58例(其中初診ITP患 者41例，非免疫性血小板減少患者(NITP) 17例)分別進行聯(lián)合檢測抗GPI、GPIIb、GPIIIa 和GPIIb/IIIa的自身抗體，結(jié)果表明，ITP患者組熒光強度明顯高于正常人。用本試劑盒 及檢測方法用血量少，只要2ml ;操作簡便，時間較短，重復(fù)性好；標(biāo)本預(yù)處理過程簡單，整 個過程只要4小時；靈敏度高，特異性好。本單克隆抗體納米微球除了應(yīng)用于診斷ITP患者 血小板自身抗體外，也能檢測其他自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等患者的抗血小板 自身抗體。


圖1 (A)是健康人標(biāo)本的散射光信號圖； 圖1 (B) 圖1 (E)分別是健康人的四種自身抗體SZ2、SZ22、SZ21、7E3的熒光強度 檢測結(jié)果。 圖1 (F)是患者標(biāo)本的散射光信號圖； 圖1 (G) 圖1 (J)分別是患者的四種自身抗體SZ2、 SZ22、 SZ21、7E3檢測結(jié)果。
圖2(A)-圖2(D)分別是ITP患者組和正常對照組生成的受試者SZ2、SZ21、SZ22、 7E3的工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,簡稱ROC曲線)。
具體實施例方式
實施例1試劑盒的制備
—.單克隆抗體的制備和純化 本例中的單克隆抗體SZ-2、SZ-21、SZ-22和7E3由發(fā)明人自制。單克隆抗體SZ-2、 SZ-21、 SZ-22禾P 7E3腹水分別在pH8. 0，0. 1M PB(O. lmol/L Na2HP04，0. lmol/LNaH2P04， pH8. O))中透析，離心(8000rpm)，取上清約1ml過柱(親和層析柱ProteinG-S印harose 4B)使各單克隆抗體與蛋白G充分結(jié)合，用O. lM甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2. 8)洗脫，收集各 單克隆抗體峰。將收集的各單克隆抗體用聚乙二醇20000濃縮，然后在0. 01M PBS中透析 4小時，得到純的單克隆抗體SZ-2、 SZ-21、 SZ-22和7E3，置于低溫冰箱備用。
二.單克隆抗體與納米微球的連接 用緩沖液(0. 1M， pH9. 6碳酸緩沖液)分別稀釋單克隆抗體SZ_2 (CD42b)、 SZ-22 (CD41b)、SZ-21(CD61)和7E3 (CD61a)，各單克隆抗體稀釋的終濃度分別為30、60、30、 20 ii g/ml 。 聚苯乙烯納米微球(直徑為18. 39 ii m，簡稱納米微球，深圳市納微生物科技有限 公司)用丙酮洗滌，然后分別加入上述單克隆抗體中，4t:搖床過夜，用洗滌液(0. 05%吐 溫-20-PBS)洗3遍，用20mg/ml牛血清白蛋白的PBS溶液封閉微球(室溫搖床2h)，然后洗 滌3遍(1500rpm，離心5分鐘)，0. Olmol/L PBS重懸納米微球，使納米微球濃度為2mg/ml， 按每份3ml分裝，4t:保存。
三.試劑盒分裝
每試劑盒中裝入 1.四種單抗的納米微球溶液各一份，每份3ml， 2.濃度為15ii g/ml的硫氰酸熒光素連接的羊抗人多克隆抗體(FITC_GAH_IgG)(購自f去國Immuotech公司)6ml。
3. PBS液，pH7. 4. 實施例2血小板特異性自身抗體的檢測
— .血小板裂解液的制備 根據(jù)患者和健康人血小板計數(shù)，用EDTA抗凝的硅化管采集外周靜脈血2ml，輕輕混勻后800rpm離心10min，取上層富血小板血漿，3000rpm離心10min，分離血漿-2(TC保存(用做MAIPA)，取血小板沉淀，用0. 05% EDTA-PBS洗滌血小板3遍，計數(shù)血小板，調(diào)整血小板濃度到1 X 107個/ml，吸取400 ii 1， 3000rpm離心5min后棄掉上清，加入240 y 1濃度為0. 5%的Triton X-100 (室溫20min) ， 3000rpm離心5min，吸取上清至4個Eppendorf管，每管50 iU，即得到血小板裂解液。
二 .用流式細胞儀檢測 吸取單克隆抗體納米微球各50 1，分別加入50 1血小板裂解液，室溫震蕩孵育2h，洗滌液0. Olmol/L PBS洗3遍后，分別加入100 y 1的FITC-GAH-IgG (15 y g/ml)，室溫震蕩孵育30min，洗滌液洗一遍，用600iU的PBS(O. Olmol/L)重懸。在流式細胞儀上檢測，計數(shù)1500-2000個微球，取FSC/SSC散點圖和FL_2的直方圖，根據(jù)FSC/SSC散點圖劃出檢測Rl微球分析區(qū)域，F(xiàn)L-2的直方圖中顯示Rl中的檢測微球的平均熒光強度值，每次檢測都使用相同的儀器設(shè)置。同時做三個健康人血小板的四種單克隆抗體納米微球的平均熒光強度作為基本對照，用各組每個標(biāo)本的平均熒光強度和基本對照熒光強度的比率來判斷陰陽性。 實施例3微球上連接的單克隆抗體穩(wěn)定性檢測 將四種單克隆抗體_納米微球(SZ-2-納米微球、SZ-22-納米微球、SZ-21-納米微球和7E3-納米微球)4t:放置45天，每隔9天取50 ill單克隆抗體-納米微球與10 的FITC-GAH-IgG(O. 75mg/ml)反應(yīng)，用流式細胞儀檢測微球平均熒光強度值，用來反映抗體與微球連接的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，檢測微球表面抗體量變化非常小，變異系數(shù)分別為2. 15%、2. 65 % 、4. 22 % 、3. 05 % ，并且可在4°C至少存放45天。
實施例4單克隆抗體_納米微球穩(wěn)定性測定 批內(nèi)重復(fù)性檢測取1份患者血小板標(biāo)本進行4種抗體檢測(CV% )， 一天內(nèi)重復(fù)檢測20次，批內(nèi)變異系數(shù)分別為3. 26%、2. 86%、1. 65%、8. 09% ; 批間重復(fù)性測定取同一個健康人的1(f個血小板與微球孵育30min，再加FITC標(biāo)記CD61單克隆抗體，上機檢測，連續(xù)做8天，批間變異系數(shù)分別為5. 86%、4. 74%、5. 69%、7. 56%。實驗結(jié)果充分說明單克隆抗體納米微球穩(wěn)定性高，檢測數(shù)據(jù)重復(fù)性好。
實施例5臨床標(biāo)本采集和抗體測定 采集血小板減少患者58例的血小板標(biāo)本，其中初診ITP患者41例，男9例，女32例，年齡19-61歲(中位年齡36歲)，標(biāo)本采集時患者血小板數(shù)目為(2-90) X109/L，均符合美國血液病學(xué)會慢性ITP的診斷標(biāo)準(zhǔn)，均未用過激素、免疫抑制劑及脾臟切除等治療；非免疫性血小板減少患者(NITP) 17例，男8例、女9例，年齡15-63歲(中位年齡32歲)，包括再生障礙性貧血5例，急性白血病9例，骨髓增生異常綜合征3例，診斷符合1998年《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)；正常血小板來自蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院35例健康獻血員，年齡20 52歲(中位年齡35歲)，其中男12名、女23名。 計算每個標(biāo)本各抗體平均熒光強度與基本對照的比率，ITP組、NITP組、正常對照組，各組熒光強度比率的中位值及其上、下限(見表.1)，若將ITP組的GPIb、GPIIb、GPIIIa、GPIIb-IIIa四種抗體檢測結(jié)果比率分別大于1. 37、 1. 24、 1. 48、 1. 19判為陽性。
圖1 (F)-圖1 (J)為其中1例患者自身抗體檢測得的熒光強度，各圖分別表示四種抗體平均熒光強度分別為9. 16、6. 33、6. 44、6. 57。圖l(B)-(E)表示一正常人自身抗體檢測結(jié)果，表示平均熒光強度分別為0. 59、0. 61、0. 58、0. 69。經(jīng)計算，此患者四種抗體檢測得到的熒光強度分別為正常人的15. 53、10. 38、11. 10、9. 52倍，因此患者四種抗體均為陽性。圖1(A)和圖1(F)分別表示受試健康人及患者標(biāo)本微粒的大小和特性。 圖2(A)-圖2(D)分別為SZ2、 SZ21、 SZ22、7E3的ROC曲線，圖中縱坐標(biāo)為靈敏度，橫坐標(biāo)為1-特異性。四組ROC曲線下面積的AUC值均大于0. 7，說明該方法對于ITP疾病的診斷具有很高的準(zhǔn)確性，特異性可達94. 29%以上。 本試劑盒檢測血小板特異性自身抗體的敏感性73. 2% (表2)，而用改良MAIPA法檢測的敏感性只有51.2%。對該兩種方法采用樣本率比較的x2檢驗，進行分析如表2，可知本方法檢測敏感度高于改良間接MAIPA法(x 2 = 4. 34， p < 0. 05)，經(jīng)檢驗得ITP組與其余兩組差異有顯著性(P < 0. 01)，且NITP組與正常對照組差異無顯著性，實驗結(jié)果表明本試劑盒及其檢測方法能夠用于測定自身免疫性疾病中抗血小板自身抗體，從而明確診斷ITP患者的抗體分類。 表1ITP組、NITP組、正常對照組與基本對照熒光強度比率的中位數(shù)以及上下限
實驗組例數(shù)比率(中位值-上下限)
SZ2SZ22SZ217E3
ITP411.63(0. 98--16.2)* 1.60 (0.96-11.3) ' 1.68(0.95-11.0)'1.31(0.84-9.81)'
NITP171.12(1. 00--1.33)1.13 (1.03-1.29)1.13(0. 97-1.32)1.05(0. 86-1.13)
正常對照351.01(0. 95--1.37)0.99 (0.85-1.24) 1.01(0. 85-1.48)1.01(0. 74-1.19) ITP組與NITP和正常對照組比較有顯著差異，*P < 0. 01
表2ITP組納米微球技術(shù)與MAIPA檢測結(jié)果敏感性比較
方法敏感性(檢出病例數(shù)Z總病例數(shù))總敏感性(檢出病例數(shù)
SZ2SZ22 SZ217E3/總病例數(shù))
納米微球技術(shù) 改良MAIPA68.29% (28/41) 46. 3 (19/41)60.98% (25/41) 68.29% (28/41) 51.22% (21/41) 48.78% (20/41)56.腦(23/41) 43.90% (18/41)73. 17% (30/41)* 51.22% (21/41) n = 41，采用兩樣本率比較的乂2檢驗，納米微球技術(shù)檢測的總敏感性高于改良MAIPA法，*P < 0. 0權(quán)利要求
單抗納米微球聯(lián)合檢測特異性血小板自身抗體的試劑盒，其特征是該試劑盒組成為(1)以牛血清白蛋白封閉的分別連有單克隆抗體SZ-2，SZ-22，SZ-21和7E3的四種單抗-聚苯乙烯納米微球，溶劑為PBS，聚苯乙烯納米微球濃度為2mg/ml，四種單抗-聚苯乙烯納米微球包括SZ-2-納米微球PBS溶液3ml，單克隆抗體SZ-2的濃度30μg/ml，SZ-22-納米微球溶液3ml，單克隆抗體SZ-22的濃度為60μg/ml，SZ-21-納米微球溶液3ml，單克隆抗體SZ-21的濃度為30μg/ml，7E3-納米微球溶液3ml；單克隆抗體7E3的濃度為20μg/ml；SZ-2，SZ-22，SZ-21和7E3分別為抗人血小板膜糖蛋白GPIb，GPIIb，GPIIIa和GPIIb/IIIa的單克隆抗體；(2)異硫氰酸熒光素連接的羊抗人多克隆抗體6ml，濃度為15μg/ml；(3).PBS液，是0.15mol/L NaCl、0.01mol/L Na2HPO4和0.01mol/L NaH2PO4的混合溶液，pH7.4。
2. 權(quán)利要求1的劑盒用于檢測血小板特異性自身抗體的方法，其特征是如下步驟(1) 取血小板裂解液待檢標(biāo)本四份，每份50iil，分別加入50ia SZ-2-納米微球、 SZ-22-納米微球、SZ-21-納米微球、7E3-納米微球，室溫震蕩孵育2h，用0. Olmol/L PBS洗 滌液洗滌，離心，棄上清；(2) .分別加入異硫氰酸熒光素連接的羊抗人多克隆抗體100iU，室溫震蕩孵育 30min，用洗滌液PBS洗滌，然后用600 y 1 PBS重懸；(3) .四份懸液分別在流式細胞儀上檢測，每份計數(shù)1500-2000個微球，根據(jù)FSC/SSC散 點圖和FL-2的直方圖，分別得到四種被檢微球的各平均熒光強度值；(4) .分別以健康人血小板裂解液的SZ2、 SZ22、 SZ21、7E3四種單抗微球的各平均熒光 強度作為基本對照；計算出步驟(3)測得的四種微球的各平均熒光強度值與對應(yīng)的基本對 照的平均熒光強度值之比率，當(dāng)比率分別大于1.37、1.24、1.48、1. 19時，判為陽性。
3. 權(quán)利要求1的劑盒的制備方法，其特征是如下步驟(1) .單克隆抗體的純化用親和層析柱Protein G-S印harose 4B純化單克隆抗體SZ_2、 SZ_21、 SZ-22和7E3， 經(jīng)濃縮透析后分別得到單克隆抗體SZ-2、 SZ-21 、 SZ-22和7E3的PBS溶液；(2) .單克隆抗體與納米微球的連接用0. 1M、 pH9. 6碳酸緩沖液分別稀釋單克隆抗體SZ-2、 SZ-22、 SZ-21和7E3至終濃度 為30、60、30和20 ii g/ml ;經(jīng)丙酮洗滌的聚苯乙烯納米微球加入上述單克隆抗體中，4t:搖床過夜后，離心，棄上清；用吐溫-20PBS溶液洗滌，離心，棄上清；然后用20mg/ml牛血清白蛋白的PBS溶液封閉 微球，搖床2h，用吐溫-20PBS溶液洗滌，離心，棄上清；加0. Olmol/L PBS重懸納米微球，至納米微球濃度為2mg/ml，4t:保存；(3) .配制異硫氰酸熒光素連接的羊抗人多克隆抗體，濃度為15i！ g/ml，按劑量分裝；(4) .配制PBS液，使溶液中含有0. 15mol/LNa2Cl、0. 01mol/LNa2HP04、0. Olmol/ LNaH2P04， pH7. 4 ;按劑量分裝；(5)各分裝物裝入試劑盒，4t:保存c
全文摘要
本發(fā)明涉及一組單抗納米微球聯(lián)合檢測特異性血小板自身抗體的試劑盒，包含以牛血清白蛋白封閉分別已連有單克隆抗體SZ-2，SZ-22，SZ-21和7E3的四種單抗-聚苯乙烯納米微球PBS溶液各3ml，聚苯乙烯納米微球濃度為2mg/ml，濃度為15μg/ml的異硫氰酸熒光素連接的羊抗人多克隆抗體6ml和PBS液。用單抗-微球與血小板裂解液標(biāo)本震蕩孵育，經(jīng)PBS洗滌，加入異硫氰酸熒光素連接的羊抗人多克隆抗體，洗滌后用PBS重懸，在流式細胞儀上檢測，分別得到四種微球的平均熒光強度值，根據(jù)它與健康人對應(yīng)的基本對照值之比率，確定血小板特異性自身抗體是否陽性，為早期診斷ITP提供依據(jù)。檢測過程簡單，靈敏度高，特異性好。
文檔編號G01N33/577GK101713782SQ200910233380
公開日2010年5月26日 申請日期2009年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日
發(fā)明者何楊, 費敏, 趙益明, 阮長耿 申請人:蘇州蘇大賽爾免疫生物技術(shù)有限公司;蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院