專利名稱：一種分離檢測手性三甲丙咪嗪的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及手性三甲丙咪嗪的研究領(lǐng)域，具體涉及一種分離檢測手性三甲丙咪嗪
的方法。
背景技術(shù)：
三甲丙咪嗪屬于三環(huán)類抗抑郁藥物，廣泛用于抑郁焦慮等疾病的治療。該化合物 是在側(cè)鏈具有一個(gè)手性中心的手性藥物，兩種手性分子為同分異構(gòu)體，在活性、代謝以及藥 動(dòng)學(xué)上存在著差異。早在1992年，美國食品藥物管理局就正式公布了題為《新立體異構(gòu) 藥物開發(fā)政策聲明》的手性藥物法規(guī)管理指南，規(guī)定新藥研究單位必需測定每個(gè)藥物的立 體異構(gòu)體的組成，并要求必須在報(bào)批資料中提供單個(gè)對映體的藥理學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié) 果。因此手性藥物的研究具有重要意義。 目前常用的手性拆分法一般使用高效液相色譜法，高效液相色譜具有很好的分離 能力，但是手性固定相的種類和數(shù)量有限，成本較高。檢測技術(shù)中紫外可見檢測是最常用的 檢測技術(shù)，但其靈敏度低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種分離檢測手性三甲丙咪嗪的方法，分離不需要昂
貴的手性固定相，操作成本較低，檢測靈敏度高。 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為 —種分離檢測手性三甲丙咪嗪的方法，使用毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測聯(lián)用裝置 對三甲丙咪嗪進(jìn)行分析，分析條件為 檢測電位IV 1. 4V，進(jìn)樣時(shí)間2s 8s，進(jìn)樣高壓10kV 20kV，分離高壓13kV 20kV，光電倍增管電壓為700V 900V ; 檢測池內(nèi)溶液為lmmol/L 4mmol/L的三聯(lián)妣啶釕，40mmol/L 60mmol/L、 6. 0《pH《9. 0的NaH2P04_Na2HP04緩沖溶液; 分離溶液為0. 5mmol/L 2mmol/L的P -CD溶液，O. 5mmol/L 2mmol/L的 HP- P -CD溶液，300mmol/L 700mmol/L、2. 0《pH《5. 0的Tris緩沖溶液，體積百分比濃 度為20% 30%的乙腈溶液。
作為優(yōu)選，所述分析條件為 檢測電位1.2V，進(jìn)樣時(shí)間4s，進(jìn)樣高壓20kV，分離高壓15kV，光電倍增管電壓為 800V ; 檢測池內(nèi)溶液為2mmol/L的三聯(lián)妣啶釕，50mmol/L、 pH = 7. 0的NaH2P04_Na2HP04 緩沖溶液； 分離溶液為1. 5mmol/L的P -CD溶液，1. 5mmol/L的HP-P -CD溶液，500mmol/L、 pH = 3. 5的Tris緩沖溶液，體積百分比濃度為20%的乙腈溶液。 作為優(yōu)選，還包括對毛細(xì)管進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理為在第一次使用毛細(xì)管電泳裝置前將毛細(xì)管用80mmol/L 120mmol/L的NaOH溶液沖洗后過夜，在每次使用毛細(xì)管 電泳裝置前，依次用80mmol/L 120mmol/L的NaOH溶液沖洗5min 15min、二次水沖洗 2min 6min以及用所述Tris緩沖液沖洗5min 15min。
作為優(yōu)選，所述毛細(xì)管為內(nèi)徑25ym的未涂層融硅毛細(xì)管。 作為優(yōu)選，所述毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測聯(lián)用裝置的電極為Pt盤工作電極、 Ag/AgCl參比電極和Pt絲對電極。 本發(fā)明使用毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光聯(lián)用來分離檢測手性三甲丙咪嗪，成本低、操 作簡單、分離能力強(qiáng)，檢測靈敏度高，重現(xiàn)性好。


圖1為本發(fā)明提供的三聯(lián)吡啶釕與三甲丙咪嗪在鉑盤電極上的循環(huán)伏安曲線及 其相對應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光曲線； 圖2為本發(fā)明提供的三甲丙咪嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液的電泳圖譜； 圖3為本發(fā)明提供的空白尿樣與添加了三甲丙咪嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液的尿樣的電泳譜圖。
具體實(shí)施例方式
為了進(jìn)一步了解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述，但是 應(yīng)當(dāng)理解，這些描述只是為進(jìn)一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，而不是對本發(fā)明權(quán)利要求的 限制。 毛細(xì)管電泳技術(shù)高效快速、方法簡易，分離模式多且容易改變，不需要昂貴的手性 固定相，樣品和試劑消耗量小，操作成本相對較低。電化學(xué)發(fā)光檢測是一種高靈敏度的檢測 方法，已被廣泛用于氨基酸、蛋白質(zhì)、DNA和有機(jī)胺類物質(zhì)的分析檢測，本發(fā)明使用毛細(xì)管電 泳電化學(xué)發(fā)光聯(lián)用技術(shù)分離檢測手性三甲丙咪嗪。 其中電極使用Pt盤工作電極、Ag/AgCl參比電極和Pt絲對電極。將Pt盤工作電 極在1. 0mol/L的H2S04溶液中，-0. 2V 1. 35V電位范圍內(nèi)循環(huán)掃描，可以得到Pt電極的 特征循環(huán)伏安曲線，證實(shí)Pt具有活性，可以用來作為工作電極，此為本領(lǐng)域所公知。毛細(xì) 管使用內(nèi)徑為25iim的未涂層融硅毛細(xì)管，為了保證檢測的靈敏度及分析結(jié)果的重現(xiàn)性， 作為優(yōu)選在用毛細(xì)管進(jìn)行分離前需要對毛細(xì)管進(jìn)行預(yù)處理，具體為在第一次使用毛細(xì)管電 泳裝置前將毛細(xì)管用80mmol/L 120mmol/L的Na0H溶液沖洗后過夜，在每次使用毛細(xì)管 電泳裝置前，依次用80mmol/L 120mmol/L的Na0H溶液沖洗5min 15min、二次水沖洗 2min 6min以及用300mmol/L 700mmol/L、2. 0《pH《5. 0的Tris緩沖液沖洗5min 15min。 然后配制一定濃度的三甲丙咪嗪的標(biāo)準(zhǔn)溶液，對其進(jìn)行靜態(tài)試驗(yàn)以50mmol/L， pH 7. 0的化1^04-化2昍04緩沖溶液作為背景電解質(zhì)，掃描電位范圍為0-1. 30V，記錄穩(wěn)定時(shí) 的循環(huán)伏安曲線和電化學(xué)發(fā)光曲線；加入2mmol/L三聯(lián)吡啶釕，并記錄穩(wěn)定時(shí)的循環(huán)伏安 曲線和電化學(xué)發(fā)光曲線；加入0. 3mmol/L三甲丙咪嗪，掃描區(qū)間同樣為0_1. 30V，記錄穩(wěn)定 時(shí)的循環(huán)伏安曲線和電化學(xué)發(fā)光曲線；將加入三甲丙咪嗪的循環(huán)伏安曲線和電化學(xué)發(fā)光曲 線與加入三聯(lián)吡啶釕的循環(huán)伏安曲線和電化學(xué)發(fā)光曲線對比，請參考圖l，圖1為本發(fā)明提 供的三聯(lián)吡啶釕與三甲丙咪嗪在鉑盤電極上的循環(huán)伏安曲線及其相對應(yīng)的電化學(xué)發(fā)光曲線。圖1的上半部分為三聯(lián)吡啶釕與三甲丙咪嗪的循環(huán)伏安曲線，下半部分為三聯(lián)吡啶釕 與三甲丙咪嗪的電化學(xué)發(fā)光曲線，由圖中可以看出加入三甲丙咪嗪的循環(huán)伏安曲線和電化 學(xué)發(fā)光曲線中的響應(yīng)度都比只加入三聯(lián)吡啶釕要強(qiáng)，三甲丙咪嗪可以增強(qiáng)三聯(lián)吡啶釕的電 化學(xué)發(fā)光活性，因此使用電化學(xué)發(fā)光檢測三甲丙咪嗪是可行的。 用毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光連用技術(shù)對三甲丙咪嗪進(jìn)行分離檢測，通過變化分離檢 測條件對實(shí)驗(yàn)的靈敏度、分離度、峰形、重現(xiàn)性進(jìn)行考察，確定本發(fā)明提供的分離檢測手性 三甲丙咪嗪的方法的分析條件為 檢測電位IV 1. 4V，進(jìn)樣時(shí)間2s 8s，進(jìn)樣高壓10kV 20kV，分離高壓13kV 20kV，光電倍增管電壓為700V 900V ;檢測池內(nèi)溶液為lmmol/L 4mmol/L的三聯(lián)吡啶釕， 40mmol/L 60mmol/L、6. 0《pH《9. 0的NaH2P04_Na2HP04緩沖溶液；分離溶液為0. 5mmo1/ L 2mmol/L的P -CD溶液，O. 5mmol/L 2mmol/L的HP-P -CD溶液，300mmol/L 700mmo1/ L、2. 0《pH《5. 0的Tris緩沖溶液，體積百分比濃度為20 % 30%的乙腈溶液。這里 NaH2P04_Na2HP04緩沖溶液的濃度指的是NaH2P04與Na2HP04都為40mmol/L 60mmol/L。
作為優(yōu)選，分析條件為檢測電位1. 2V，進(jìn)樣時(shí)間4s，進(jìn)樣高壓20kV，分離高壓 15kV，光電倍增管電壓為800V ;檢測池內(nèi)溶液為2mmol/L的三聯(lián)吡啶釕，50mmol/L、 pH = 7. 0的NaH2P04_Na2HP04緩沖溶液；分離溶液為1. 5mmol/L的P -CD溶液，1. 5mmol/L的 HP-e-CD溶液，500mmol/L、 pH = 3. 5的Tris緩沖溶液，體積百分比濃度為20%的乙腈溶 液。
實(shí)施例 使用的儀器裝置為內(nèi)徑25iim的未涂層融硅毛細(xì)管柱，直徑500iim的Pt盤工作 電極，AgAgCl參比電極，Pt絲對電極，MPI-A型毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測儀。
使用的試劑為三聯(lián)吡啶釕(Ru (bpy) 3C12. 6H20) ， |3 -環(huán)糊精(|3 -CD)，羥丙 基-P -環(huán)糊精(HP-P -CD)，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，化1^04，化2昍04，1^04，三甲丙咪嗪 標(biāo)準(zhǔn)品，乙腈，二次水。所用試劑均為分析純，所配制好的溶液在使用之前均經(jīng)0. 22 ii m濾 膜過濾； 1、配制緩沖溶液 (1)NaH2P04-Na2HP04緩沖溶液 先配制濃度為100mmol/L的NaH2P04溶液和濃度為100mmol/L的Na2HP04溶液，將 同濃度的二者混合再用二次水稀釋配成濃度為50mmol/L，再將溶液的pH值調(diào)成7. 0。
(2)Tris緩沖溶液先配制濃度為1000mmol/L的Tris溶液，接著用二次水稀釋至500mmol/L，之后用 濃H3P04溶液調(diào)節(jié)至pH = 3. 5。
2、對毛細(xì)管進(jìn)行預(yù)處理 將毛細(xì)管用100mmol/L的NaOH溶液沖洗后過夜，在使用毛細(xì)管電泳裝置前，再依 次用100mmol/L的NaOH溶液沖洗10min、二次水沖洗5min以及用配置好的Tris緩沖液沖 洗10min。 3、通過毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光聯(lián)用對1. Ommol/L的三甲丙咪嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分
檢測電位1.2V，進(jìn)樣時(shí)間4s，進(jìn)樣高壓20kV，分離高壓15kV，光電倍增管電壓為
5800V ;檢測池內(nèi)溶液為2mmol/L的三聯(lián)吡啶釕，50mmol/L、pH = 7. 0的NaH2P04_Na2HP04緩沖 溶液；分離溶液為1. 5mmol/L的P -CD溶液，1. 5mmol/L的HP- P -CD溶液，500mmol/L、pH = 3. 5的Tris緩沖溶液，體積百分比濃度為20%的乙腈溶液。 在此檢測條件下，三甲丙咪嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測限是1. 0X10—^01/L，線性范圍是 5. 0X10—7mol/L 2. 0X 10—5mol/L，在25min內(nèi)三甲丙咪嗪得到分離，請參考圖2，圖2為本 發(fā)明提供的三甲丙咪嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液的電泳圖譜?？梢钥吹皆?500s附近出現(xiàn)兩個(gè)峰，兩個(gè)峰 已經(jīng)被分開，分別為三甲丙咪嗪的兩個(gè)同分異構(gòu)體的峰。
4、對尿樣中的三甲丙咪嗪進(jìn)行分離檢測 由于在臨床上檢測三甲丙咪嗪時(shí)一般是檢測血液和尿液，所以本發(fā)明對尿液中的 三甲丙咪嗪進(jìn)行分離檢測。 取健康人的尿液，經(jīng)0. 22 m濾膜過濾，然后用乙腈溶液稀釋10倍，作為空白尿 樣。再將三甲丙咪嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白尿樣中配成含三甲丙咪嗪濃度為2. OX 10—6mol/L的 尿樣。 通過毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光聯(lián)用對空白尿樣和含2.0X10—Smol/L三甲丙咪嗪的 尿樣進(jìn)行檢測，分離檢測條件與分離檢測三甲丙咪嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)相同，請參考圖3，圖3為 本發(fā)明提供的空白尿樣與添加了三甲丙咪嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液的尿樣的電泳譜圖，A是空白尿樣，B 是含2.0X10—Smol/L三甲丙咪嗪的尿樣。B中1500s處出現(xiàn)的是三甲丙咪嗪兩個(gè)同分異構(gòu) 體的峰，兩個(gè)峰已經(jīng)被分開，且可以看出尿液的基底對三甲丙咪嗪的分離檢測沒有干擾。
因此臨床上檢測尿液中的三甲丙咪嗪時(shí)使用本發(fā)明的方法是可行的，而且本發(fā) 明的方法同其他分析方法比較還具有如下特點(diǎn)毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測成本低，同質(zhì) 譜和激光誘導(dǎo)熒光等一些靈敏的檢測方法相比，操作更簡單；對三甲丙咪嗪的檢測限為 1. 0 X 10—7mol/L，比最常用的紫外檢測方法檢測限低2個(gè)數(shù)量級，線性范圍是5. 0 X 10—7mol/ L 2. OX 10—5mol/L ;重現(xiàn)性好，有機(jī)添加劑乙腈能夠溶解電極表面的污染物，操作過程中 不用對電極進(jìn)行活化，提高了分析的重現(xiàn)性。 以上對本發(fā)明所提供的一種分離檢測手性三甲丙咪嗪的方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹。本
文中應(yīng)用了具體個(gè)例對本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說明只是用于 幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在
不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落 入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種分離檢測手性三甲丙咪嗪的方法，其特征在于，使用毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測聯(lián)用裝置對三甲丙咪嗪進(jìn)行分析，分析條件為檢測電位1V～1.4V，進(jìn)樣時(shí)間2s～8s，進(jìn)樣高壓10kV～20kV，分離高壓13kV～20kV，光電倍增管電壓為700V～900V；檢測池內(nèi)溶液為1mmol/L～4mmol/L的三聯(lián)吡啶釕，40mmol/L～60mmol/L、6.0≤pH≤9.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液；分離溶液為0.5mmol/L～2mmol/L的β-CD溶液，0.5mmol/L～2mmol/L的HP-β-CD溶液，300mmol/L～700mmol/L、2.0≤pH≤5.0的Tris緩沖溶液，體積百分比濃度為20％～30％的乙腈溶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離檢測手性三甲丙咪嗪的方法，其特征在于，所述分析條件為檢測電位1. 2V，進(jìn)樣時(shí)間4s，進(jìn)樣高壓20kV，分離高壓15kV，光電倍增管電壓為800V ;檢測池內(nèi)溶液為2mmol/L的三聯(lián)吡啶釕，50mmol/L、 pH = 7. 0的NaH2P04_Na2HP04緩沖溶液；分離溶液為1. 5mmol/L的P -CD溶液，1. 5mmol/L的HP- P -CD溶液，500mmol/L、 pH =3. 5的Tris緩沖溶液，體積百分比濃度為20%的乙腈溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離檢測手性三甲丙咪嗪的方法，其特征在于，還包括對毛細(xì)管進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理為在第一次使用毛細(xì)管電泳裝置前將毛細(xì)管用80mmo1/L 120mmol/L的NaOH溶液沖洗后過夜，在每次使用毛細(xì)管電泳裝置前，依次用80mmo1/L 120mmol/L的NaOH溶液沖洗5min 15min、二次水沖洗2min 6min以及用所述Tris緩沖液沖洗5min 15min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離檢測手性三甲丙咪嗪的方法，其特征在于，所述毛細(xì)管為內(nèi)徑25 ii m的未涂層融硅毛細(xì)管。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離檢測手性三甲丙咪嗪的方法，其特征在于，所述毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測聯(lián)用裝置的電極為Pt盤工作電極、Ag/AgCl參比電極和Pt絲對電極。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測聯(lián)用分離檢測手性三甲丙咪嗪的方法，分析條件為檢測電位1V～1.4V，進(jìn)樣時(shí)間2s～8s，進(jìn)樣高壓10kV～20kV，分離高壓13kV～20kV，光電倍增管電壓為700V～900V；檢測池溶液為三聯(lián)吡啶釕，NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液；分離溶液為β-CD溶液，HP-β-CD溶液，Tris緩沖溶液，體積百分比濃度為20％～30％的乙腈溶液。本發(fā)明對三甲丙咪嗪的分離檢測方法成本低、操作簡單、分離能力強(qiáng)，檢測靈敏度高，重現(xiàn)性好。
文檔編號G01N27/447GK101726530SQ200910265400
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者于彩霞, 唐小風(fēng), 由天艷, 袁柏青 申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所