專利名稱：一種蟲草制品中蟲草酸含量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蟲草制品中蟲草酸含量的檢測方法。
背景技術(shù)：
蟲草酸(cordyc印ic acid)，即甘露醇，是冬蟲夏草等蟲草菌類中藥中的主要活性成分之一，具有利尿、降低顱內(nèi)壓和眼內(nèi)壓、祛痰、鎮(zhèn)咳平喘和清除自由基等多種功效。就冬蟲夏草及其相關(guān)制品中的蟲草酸含量的檢測方法，目前有多種方法包括容量法、紫外_可見分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)以及毛細管區(qū)帶電泳法(CZE)等。據(jù)2005年中國藥典，蟲草酸的含量是采用容量法來進行定量分析。容量法是基于甘露醇的還原性利用氧化劑高碘酸鹽來滴定和計算含量，因冬蟲夏草等蟲草菌類生藥或制品中還原性物質(zhì)的干擾，測量值偏高，因此容量法僅適用于相對較純的甘露糖制劑。HPLC、 GC與CZE等分析方法需要貴重的設備、樣品制備和操作復雜、受外界干擾也大，結(jié)果重現(xiàn)性較差，不適合作為常規(guī)定量分析方法。紫外-可見分光光度法檢測蟲草酸，方法簡單、特異性高，許多含羥基的單糖對其無明顯干擾，能代表冬蟲夏草等蟲草類生藥或制品中蟲草酸的實際值而成為常規(guī)定量分析方法。然而，紫外-可見分光光度計一般最多能同時測定3個樣品，如果每個檢測樣品要設置3個重復，則一次只能檢測一個樣品。因此對批量樣品的定量分析因受檢測系統(tǒng)和人為因素造成誤差，嚴重影響結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種能同時大批量測試樣品且受外界干擾也小的蟲草制品中蟲草酸含量的檢測方法。采用簡單的方法和價格低廉的設備實現(xiàn)同時對大批量蟲草制品中蟲草酸含量的檢測，且檢測結(jié)果穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，適合作為常規(guī)定量分析方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種蟲草制品中蟲草酸含量的檢測方法，該方法是先將蟲草制品按常規(guī)方法制成待檢液；然后將待檢液制成測試液，用酶標儀檢測測試液的吸光度；再將蟲草酸配制成5 7個濃度的標準溶液，并測定其吸光度；以標準溶液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制蟲草酸的標準曲線，并建立相應的蟲草酸濃度與吸光度的線性關(guān)系方程，再把測試液的吸光度值代入方程獲得測試液中蟲草酸的含量，然后換算成蟲草制品單位質(zhì)量的百分含量。 上述的蟲草制品中蟲草酸含量的檢測方法中，所述測試液按如下步驟制備
a、量取0. 2mL用蟲草制品制備的待檢液放入試管中； b、在測試液中分別加蒸餾水或去離子水稀釋至20mL，混勻；取lmL作為A品；
c、在A品中加入lmL高碘酸鉀溶液，混勻，在24 26。C放置10分鐘，得B品；
d、在B品中加入2mL 0. 1 %的L-鼠李糖溶液，混勻，得C品； e、在C品中加入4mL新鮮配制的Nash試劑，53。C反應15分鐘使其顯色后，快速冷卻至室溫，得測試液。 f、在按步驟b e制備的過程中，取與待測液等量的蒸餾水或去離子水制備空白對照組。 前述的蟲草制品中蟲草酸含量的檢測方法中，所述吸光度按如下步驟測定
a、用加樣槍取測試液組和空白對照組至酶標板，每組三個復孔，每孔200ii L ;在412nm波長下，用酶標儀分別測定測試液和空白對照的吸光度，計算三孔測試液的平均吸光度值A測和三孔空白對照的平均吸光度A本貞； b、根據(jù)公式AA= A^-A^貞計算測試液中蟲草酸實際吸光度。
前述的蟲草制品中蟲草酸含量的檢測方法中，所述標準溶液按如下步驟制備
a、準確稱量25mg干燥至恒重的蟲草酸裝入25mL容量瓶中，加蒸餾水或去離子水溶解并稀釋至刻度，混勻，配置成質(zhì)量濃度為lg/L的蟲草酸溶液；； b、量取5 7個間隔為250ii L質(zhì)量濃度為lg/L的蟲草酸溶液，分別加入25mL容量瓶中，用蒸餾水或去離子水定容至刻度，分別得5 7個間隔為10mg/L蟲草酸含量的標準溶液，備用； c、再取lmL濃度為10mg/L的標準溶液，按照權(quán)利要求1和2的步驟獲得lOmg/L標準溶液的平均吸光度值； d、再分別取lmL b步驟獲得的標準溶液，按步驟c測定各濃度標準液相應的平均吸光度值。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用酶標儀來進行蟲草酸定量分析。首先由于用于酶標儀檢測的樣品載體酶標板上的孔數(shù)可多達數(shù)百個，即使一個樣品占用三個孔，也可同時檢測上百個樣品。如果用紫外分光光度計檢測上百個樣品，要反復操作上百次。而操作上百次，儀器和人為因素將給所測定的數(shù)據(jù)造成很大的系統(tǒng)誤差和偶然誤差，精確度和重復性差，無法保證結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性。而本法僅需要進行一次測定，還可通過設置多個重復，減少系統(tǒng)誤差和偶然誤差；第二，酶標板中加入樣品時不易產(chǎn)生氣泡，液面一致，光程短，具有高靈敏度和低檢測限的優(yōu)點；第三，傳統(tǒng)的紫外-可見分光光度計是水平光路，而酶標儀是垂直光路，全波長和雙波長酶標儀還可通過設定參考波長，有利于減少測定干擾與電路干擾；第四，本法需要樣品量少。第五，本法適合其它需要紫外-分光光度法檢測的化合物。本發(fā)明所用的檢測方法簡單實用，所用設備價格低廉，檢測結(jié)果受外界干擾小穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，適合作為常規(guī)定量分析方法。
說明書附圖


圖1是蟲草酸的標準曲線圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的蟲草制品中蟲草酸含量的檢測方法作進一步的詳細說明，但并不作為對本發(fā)明做任何限制的依據(jù)。 實施例。 一種蟲草制品中蟲草酸含量的檢測方法，該方法是先將一定量的蟲草制品按常規(guī)方法制成待檢液；然后將待檢液制成測試液，用酶標儀檢測測試液的吸光度；再將蟲草酸配制成6個濃度的標準溶液，并測定其吸光度。 以標準溶液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標建立蟲草酸的標準曲線。6個標準溶液的值10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L分別對應橫坐標上的6個點，在縱坐標上是與標準溶液10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L相對應的6個吸光度值的點，這樣在坐標上獲得6個點，并繪制一條連接這6個點的趨勢線，即反映蟲草酸濃度與吸光度對應關(guān)系的蟲草酸標準曲線。 根據(jù)獲得的蟲草酸的標準曲線建立相應的蟲草酸濃度與吸光度的線性關(guān)系方程
從圖l可見，蟲草酸的標準曲線趨近于一條直線，所以根據(jù)數(shù)學原理可以建立一個一元一
次方程方程式如下 x = (A蟲+0. 0005)+0. 007 公式中Aa表示測試液的吸光度值； X表示測試液中蟲草酸的含量； 公式中的0. 0005和0. 007由曲線的斜率和截距決定。 再把測試液的吸光度值代入方程獲得測試液中蟲草酸的含量，最后乘以蟲草制品待測液的總量，即獲得該一定量蟲草制品中蟲草酸的總含量，然后換算成蟲草制品單位質(zhì)量的百分含量。 所述的待檢液可按如下方法制備，準確稱量0.5g干燥至恒重的蟲草制品，加入25% (v/v)乙醇水溶液，料液比為l : 30(w/v)，沸水浴浸提2小時，過濾后再浸提l次，合并濾液，獲得60mL蟲草待測液。上述的待檢液制備方法僅是一例，不局限用此方法，不作為對本發(fā)明做任何限制的依據(jù)。也可以采用其它方法，如用水直接熱提取、超聲提取或微波提取等方法。
上述的測試液按如下步驟制備 a、量取0. 2mL用蟲草制品制備的待檢液放入試管中； b、在測試液中分別加蒸餾水或去離子水稀釋至20mL，混勻；取lmL作為A品；
c、在A品中加入lmL高碘酸鉀溶液，混勻，在24_26oC放置10分鐘，得B品；
d、在B品中加入2mL 0. 1 %的L-鼠李糖溶液，混勻，得C品； e、在C品中加入4mL新鮮配制的Nash試劑，53oC反應15分鐘使其顯色后，快速冷卻至室溫，得測試液。 f、在按步驟b e制備的過程中，取與待測液等量的蒸餾水或去離子水制備空白對照液。 前述的吸光度按如下步驟測定 a、用加樣槍取測試液和空白對照組至酶標板，每組3孔，每孔加200 y L(本例所用的酶標板有96個孔)；在412nm波長下，用酶標儀分別測定測試液和空白對照組的吸光度，計算3孔測試液的平均吸光度值AM= 0. 1306和3孔空白對照的的平均吸光度A本底二0.0620 ;b、根據(jù)公式AA= A;則-A本底計算測試液中蟲草酸實際吸光度是0. 0686。
前述的標準溶液按如下步驟制備 a、準確稱量25mg干燥至恒重的蟲草酸裝入25mL容量瓶中，加蒸餾水或去離子水溶解并稀釋至刻度，混勻，配置成質(zhì)量濃度為lg/L的蟲草酸溶液；； b、量取6個間隔為250ii L(250、500、750、1000、1250、1500ii L)質(zhì)量濃度為lg/L的蟲草酸溶液，分別加入25mL容量瓶中，用蒸餾水或去離子水定容至刻度，分別得6個(10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L)間隔為10mg/L蟲草酸含量的標準溶液，備用；
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c、再取lmL濃度為10mg/L的標準溶液，按照權(quán)利要求1和2的步驟獲得lOmg/L 標準溶液的平均吸光度值； d、再分別取lmL濃度為20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L的標準溶液，按步 驟c測定各濃度標準液相應的平均吸光度值。 以O. 5g蟲草制品獲得60mL待測液為例，測得蟲草制品測試液的吸光度是0. 0686， 根據(jù)公式計算蟲草酸含量x等于9. 8492mg/L，根據(jù)0. 2mL待測液加蒸餾水至20mL，即稀釋 了 100倍，因此，待測液中的蟲草酸含量為984. 92mg/L，經(jīng)計算該蟲草制品的蟲草酸含量是 11.82% (w/w)。
權(quán)利要求
一種蟲草制品中蟲草酸含量的檢測方法，其特征在于該方法是先將蟲草制品按常規(guī)方法制成待檢液；然后將待檢液制成測試液，用酶標儀檢測測試液的吸光度；再將蟲草酸配制成5～7個濃度的標準溶液，并測定其吸光度；以標準溶液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制蟲草酸的標準曲線，并建立相應的蟲草酸濃度與吸光度的線性關(guān)系方程，再把測試液的吸光度值代入方程獲得測試液中蟲草酸的含量，然后換算成蟲草制品單位質(zhì)量的百分含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲草制品中蟲草酸含量的檢測方法，其特征在于所述測試液按如下步驟制備a、 量取0. 2mL用蟲草制品制備的待檢液放入試管中；b、 在測試液中分別加蒸餾水或去離子水稀釋至20mL，混勻；取lmL作為A品；c、 在A品中加入lmL高碘酸鉀溶液，混勻，在24 26。C放置10分鐘，得B品；d、 在B品中加入2mL 0. 1%的L-鼠李糖溶液，混勻，得C品；e、 在C品中加入4mL新鮮配制的Nash試劑，53。C反應15分鐘使其顯色后，快速冷卻至室溫，得測試液。f、 在按步驟b e制備的過程中，取與待測液等量的蒸餾水或去離子水制備空白對照液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲草制品中蟲草酸含量的檢測方法，其特征在于所述吸光度按如下步驟測定a、 取測試液組和空白對照組至酶標板，每組三個復孔，每孔200 ii L ;在412nm波長下，用酶標儀分別測定測試液和空白對照的吸光度，計算三孔測試液的平均吸光度值A，'和三孔空白對照的平均吸光度A^貞b、 根據(jù)公式Aa二 A^-A^貞計算測試液中蟲草酸實際吸光度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲草制品中蟲草酸含量的檢測方法，其特征在于所述標準溶液按如下步驟制備a、 準確稱量25mg干燥至恒重的蟲草酸裝入25mL容量瓶中，加蒸餾水或去離子水溶解并稀釋至刻度，混勻，配置成質(zhì)量濃度為lg/L的蟲草酸溶液；；b、 量取5 7個間隔為250 ii L質(zhì)量濃度為lg/L的蟲草酸溶液，分別加入25mL容量瓶中，用蒸餾水或去離子水定容至刻度，分別得5 7個間隔為10mg/L蟲草酸含量的標準溶液，備用；c、 再取lmL濃度為10mg/L的標準溶液，按照權(quán)利要求1和2的步驟獲得10mg/L標準溶液的平均吸光度值；d、 再分別取lmL b步驟獲得的標準溶液，按步驟c測定各濃度標準液相應的平均吸光度值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蟲草制品中蟲草酸含量的檢測方法，該方法是先將蟲草制品按常規(guī)方法制成待檢液；然后將待檢液制成測試液，用酶標儀檢測測試液的吸光度；再將蟲草酸配制成5～7個濃度的標準溶液，并測定其吸光度；以標準溶液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制蟲草酸的標準曲線，并建立相應的蟲草酸濃度與吸光度的線性關(guān)系方程，再把測試液的吸光度值代入方程獲得測試液中蟲草酸的含量，然后換算成蟲草制品單位質(zhì)量的百分含量。本發(fā)明采用簡單的方法和價格低廉的設備實現(xiàn)同時檢測大批量蟲草制品中蟲草酸含量，減少系統(tǒng)誤差和偶然誤差，檢測結(jié)果受外界干擾小，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，適合作為常規(guī)定量分析方法。
文檔編號G01N21/78GK101769872SQ20091030007
公開日2010年7月7日 申請日期2009年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月6日
發(fā)明者肖代敏, 肖建輝, 鐘建江, 陳代雄 申請人:遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院