專利名稱：一種利用表面等離子諧振技術(shù)檢測(cè)特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的生物芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物芯片領(lǐng)域，特別是一種利用表面等離子諧振技術(shù)檢測(cè)特定糖鏈蛋 白、抗體或抗原的生物芯片及其基于表面等離子諧振原理的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
表面等離子諧振(SPR)是一種物理光學(xué)現(xiàn)象。當(dāng)平行表面的偏振光以稱之為表面 等離子角的入射角照在界面上發(fā)生全反射時(shí)，入射光被耦合入表面等離子體內(nèi)，在這個(gè)角 度由于表面等離子體諧振將引起界面反射率顯著減少。SI^R對(duì)附著在金屬表面的電介質(zhì)的 折射率非常敏感，而折射率是所有材料的固有特征。因此，任何附著在金屬表面上的電介質(zhì) 均可被檢測(cè)，不同電介質(zhì)其表面等離子角不同。而同一種材料，附著在金屬表面的量不同， 則SPR的響應(yīng)強(qiáng)度不同。根據(jù)上述原理，SI^R生物傳感器通常將已知的生物分子固定在幾 十納米厚的金屬(金、銀等)膜表面，加入與其互補(bǔ)的目標(biāo)生物分子，兩者結(jié)合(雜交)將 使金屬膜與溶液界面的折射率上升，從而導(dǎo)致諧振角改變，如果固定入射角度，就能根據(jù)諧 振角的改變程度對(duì)互補(bǔ)的目標(biāo)生物分子進(jìn)行定量檢測(cè)。整個(gè)傳感過程包括(1)生物分子的相互作用(藕聯(lián))；(2)敏感層電介質(zhì)變化(介電常數(shù)折射率改變)；(3)傳感器電磁場(chǎng)變化(反射光波衰減)；(4)光電信號(hào)檢測(cè)；(5)信號(hào)的連續(xù)檢測(cè)與分析。生物芯片是通過平面微細(xì)加工與生物分子的自組裝技術(shù)相結(jié)合，在微小玻片上組 裝成數(shù)目眾多的不同生物分子微陣列，以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子信息的大規(guī)模檢測(cè)。SI^R傳感技術(shù) 尤其適用于檢測(cè)生物大分子之間的相互作用過程。它具有免標(biāo)記、無(wú)需純化、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè) 等優(yōu)點(diǎn)，具有很高的靈敏度。且能測(cè)定生物大分子相互反應(yīng)過程中的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。這種技 術(shù)被認(rèn)為是生命科學(xué)研究中的高效工具，因而成為目前國(guó)內(nèi)外科學(xué)技術(shù)發(fā)展的熱點(diǎn)。糖生物學(xué)(glycobiology)是研究聚糖及其衍生物的結(jié)構(gòu)、化學(xué)、生物合成及生物 功能的科學(xué)?？茖W(xué)家把研究生物體內(nèi)多糖的科學(xué)叫做“糖生物學(xué)”，也有人沿襲“基因組學(xué)” 和“蛋白質(zhì)組學(xué)”的概念把這們學(xué)科叫做“糖原組學(xué)”。蛋白質(zhì)、核酸和多糖是構(gòu)成生命的三 類大分子，蛋白質(zhì)和核酸的研究已經(jīng)成為生命科學(xué)中的熱點(diǎn)問題。隨著蛋白質(zhì)和核酸研究 的深入，糖類的重要性也浮出水面，成為生命科學(xué)研究中的新熱點(diǎn)。1990年，有3家實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)組織受到損傷時(shí)，白血球和免疫細(xì)胞穿過 血管壁，進(jìn)入受損組織，以便殺滅入侵的微生物。然而，過多白血球的進(jìn)入則可能導(dǎo)致炎癥 的產(chǎn)生。并且發(fā)現(xiàn)炎癥過程與糖類和相關(guān)的糖結(jié)合蛋白參與有關(guān)。更進(jìn)一步的研究表明， 進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)的癌細(xì)胞可能借助了糖鏈改變的機(jī)制穿過血管，導(dǎo)致癌癥的轉(zhuǎn)移。隨后 又出現(xiàn)了以這一基礎(chǔ)研究成果為依據(jù)，開發(fā)抗炎和抗腫瘤藥物的熱潮。最近的研究結(jié)果 表明，糖復(fù)合物表面糖鏈結(jié)構(gòu)的改變和很多疾病的發(fā)生相伴隨。
糖生物學(xué)之所以落后于基因和蛋白質(zhì)的研究，在于糖分子本身的復(fù)雜性以及研究 人員缺乏研究糖類分子的有效工具。近年來在糖類研究方面已取得不少進(jìn)展。目前研究結(jié) 果表明，糖類作為信息分子在受精、發(fā)生、發(fā)育、分化、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)衡態(tài)的維持等方 面起著重要作用；炎癥和自身免疫疾病、老化、癌細(xì)胞的異常增殖和轉(zhuǎn)換、病原體感染等生 理和病理過程都與糖類的參與有關(guān)。糖蛋白是一種結(jié)合蛋白質(zhì)http://baike. baidu. com/view/15472. htm,由短的寡 糖鏈與蛋白質(zhì)共價(jià)連接構(gòu)成。糖與蛋白質(zhì)之間以蛋白質(zhì)為主，其一定部位上以共價(jià)鍵與若 干短的寡糖鏈相連，這些寡糖鏈常常是具分支的雜糖鏈，不呈現(xiàn)重復(fù)的雙糖系列，一般由 2 10個(gè)單體(少于15)組成，未端成員常常是唾液酸或L巖藻糖。通常每個(gè)分子的含糖量 較少(約4%)。一些糖蛋白只含一個(gè)或幾個(gè)糖基，另一些含有多個(gè)線性或分支的寡糖側(cè)鏈。 H^s_ http//baike. baidu. com/view/1326. htm、— http//baike. baidu. com/ view/1322, htm、載體 http://baike. baidu. com/view/184171. htm、凝集素 http://baike. baidu. com/view/557005. htm、抗體 http://baike. baidu. com/view/66869. htm 等。糖蛋白的生物學(xué)功能有一、糖蛋白攜帶某些蛋白質(zhì)代謝去向的信息。糖蛋白寡糖鏈末端的唾液酸殘基，決 定著某種蛋白質(zhì)是否在血流中存在或被肝臟除去的信息。二、寡糖鏈在細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)傳遞中起關(guān)鍵作用。淋巴細(xì)胞正常情況應(yīng)歸巢到脾 臟，而切去唾液酸后，結(jié)果競(jìng)歸巢到了肝臟。在原核中表達(dá)的真核基因，無(wú)法糖基化。糖蛋白可以是胞溶性的，也可以是膜結(jié)合型的，可以存在于細(xì)胞內(nèi)在也可存在于 細(xì)胞間質(zhì)中。糖蛋白在動(dòng)植物中較為典型，脊柱動(dòng)物中糖蛋白尤為豐富，如金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (轉(zhuǎn)鐵蛋白)、血銅藍(lán)蛋白，凝血因子、補(bǔ)體系統(tǒng)、一些激素，RNase、膜結(jié)合蛋白、主要組織 相容性抗原(major histocompatibility antigen)。絕大多數(shù)糖蛋白的寡糖是糖蛋白 的功能中心。有些糖蛋白的糖對(duì)于糖蛋白自身及機(jī)體起著保護(hù)作用或潤(rùn)滑作用，如牛的 RNaseB(糖蛋白)對(duì)熱的抗性大于RNaseA，大量的唾液酸能增強(qiáng)唾液粘蛋白的粘性從而增 強(qiáng)唾液的潤(rùn)滑性。南極魚抗凍蛋白的糖組分能與水形成氫鍵，阻止冰晶的形成從而提高 了抗凍性。糖蛋白在細(xì)胞間信號(hào)傳遞方面起著更為復(fù)雜的作用。HIV的靶細(xì)胞結(jié)合蛋白 GP120是一個(gè)糖蛋白，能與人類靶細(xì)胞表面的CD4受體結(jié)合從而附著在靶細(xì)胞表面，如果去 掉GP120的糖部分則不能與CD4受體結(jié)合從而失去感染能力。細(xì)胞表面的糖蛋白形成細(xì)胞 的糖萼(糖衣)、參與細(xì)胞的粘連，這在胚胎組織的生長(zhǎng)、發(fā)育以及分化中起著關(guān)鍵性作用。糖蛋白的異常對(duì)于很多疾病具有診斷意義，因此，可通過檢測(cè)異常糖蛋白為疾病 的檢測(cè)提供新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的在于提出一種利用表面等離子諧振技術(shù)檢測(cè)特定糖鏈蛋白、抗 體或抗原的生物芯片。本發(fā)明的又一發(fā)明目的在于提出一種特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的檢測(cè)方法。本發(fā)明的再一發(fā)明目的在于提出這種特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的檢測(cè)方法的應(yīng)用。為了完成本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采的技術(shù)方案為
本發(fā)明涉及一種利用表面等離子諧振技術(shù)檢測(cè)特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的生物 芯片，所述的特定糖鏈蛋白包括糖鏈異常蛋白，所述生物芯片在基底上有金屬膜，在金屬表 面上固定有連接層，在連接層上固定有凝集素、抗體或抗原；其中基底選自玻璃基底等。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案為金屬膜的厚度為55 IOOnm ；優(yōu)選為60 80nm。本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案為金屬膜選自金膜、銀膜或鉬膜。凝集素選自蝸牛凝集素、扁豆凝集素、長(zhǎng)柔毛野豌豆凝集素、豌豆凝集素http:// www. 1798. cn/qybl/InfoShow_704892_232569. shtml (PSA)、刀豆凝集素、大豆凝集素、雙花 扁豆凝集素(DBA)、歐蔓陀羅凝集素或蔓陀羅凝集素等。其中，本發(fā)明中的連接層是由一端具有活性基團(tuán)、另一端通過巰基與金屬膜反應(yīng) 的長(zhǎng)鏈巰基乙醇構(gòu)成的混合自組裝單分子層(SAM)，再經(jīng)激活制備而成；激活的過程包括 以下步驟(1)將固定有混合自組裝單分子層表面的芯片用交聯(lián)劑1-乙基-3-(3-二甲基氨 丙基)_碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺活化，再與2-(2-氨基乙氧基)乙醇反應(yīng)；(2)將步驟(1)得到的芯片與表氯醇反應(yīng)生成環(huán)氧功能化的表面，然后與多聚糖 或可膨脹的有機(jī)聚合體結(jié)合；(3)用溴乙酸處理2 5次使多糖鏈羧基化。本發(fā)明的生物芯片的制備過程包括以下三個(gè)步驟一、在玻璃載體上鋪置具有等離子共振感應(yīng)型的金膜，其步驟包括按檸檬酸三鈉還原法(Frens法)制備金溶液；以Ν-β-(氨乙基)-Y-氨丙基三價(jià)氧基硅烷(APTMS)為核心鋪制性質(zhì)均一的表 面等離子共振金膜；所鋪設(shè)的金膜氮?dú)飧稍锖竺芊鈧溆?。二、在鋪設(shè)好金屬膜的芯片表面固定一層連接層，連接層為長(zhǎng)鏈巰基乙醇構(gòu)成的 混合自組裝單分子層，其固定方法的步驟包括徹底清潔鋪制好金膜的芯片；將鋪制好金膜的芯片浸在有機(jī)硫化物的乙醇溶液中，其中有機(jī)硫化物的濃度為 1 10mmol/L，時(shí)間為8 20小時(shí)，優(yōu)選13 16小時(shí)，溫度為室溫；其中，所述的有機(jī)硫化物為長(zhǎng)鏈巰基乙醇為(I)HS- (CH2) n-R 和 HS- (CH2) n_R，的混合物，(2)不對(duì)稱的二烷基二硫化物 R- (CH2) mS-S (CH2) n_R’，
(3)不對(duì)稱的二烷基硫化物 R- (CH2) m-S- (CH2) n_R’ ；其中，!11和η分別選自3到21的正整數(shù)，R和R’分別表示烷基的末端基團(tuán)，選自甲 基、羥基、羧基或氨基。三、SAM層的修飾1.直接反應(yīng)法在一定的反應(yīng)條件下，SAM表明暴露的功能集團(tuán)，如羥基、羧基，可以直接與反應(yīng)溶 液中的生物分子上相應(yīng)的配體反應(yīng)。2. SAM表面的活化將固定有SAM表面的芯片用EDC/NHS活化后與2_(2_氨基乙氧基)乙醇(AEE)反應(yīng)，然后與表氯醇反應(yīng)生成環(huán)氧功能化的表面，再與多聚糖或可膨脹的有機(jī)聚合體相連接； 最后用溴乙酸處理2 5次，使多聚糖或可膨脹的有機(jī)聚合體羧基化。其中，多聚糖或可膨 脹的有機(jī)聚合體選自葡聚糖、甘露聚糖、半乳甘露聚、果膠半乳糖、瓊脂糖；優(yōu)選為葡聚糖， EDC/NHS的濃度為0. 2M EDC/0. 05M NHS的水溶液。3.凝集素、抗體或抗原與芯片的固定將結(jié)合有羧基化的多聚糖的芯片與活化試劑反應(yīng)，反應(yīng)完畢洗去活化試劑，在芯 片表面加上含有凝集素、抗體或抗原的緩沖溶液；結(jié)合反應(yīng)完畢后，加入去活化試劑將芯 片上沒有與凝集素、抗體或抗原反應(yīng)的活化基團(tuán)失活。其中，活化試劑優(yōu)選EDC/NHS溶液 或EDC/硫代NHS，去活化試劑優(yōu)選為乙醇胺的堿性溶液，乙醇胺堿性溶液的濃度為0. 5 2mol/L, pH值為7. 5 8. 5，優(yōu)選為8. 0 ；緩沖溶液優(yōu)選IOmM的乙酸鹽緩沖溶液，pH值為 3. 5 5. 5，優(yōu)選為4. 5 ；凝集素、抗體或抗原的濃度優(yōu)選為10 100 μ g/ml。將反應(yīng)完畢的芯片在潮濕的環(huán)境中孵育30分鐘到2小時(shí)，然后在0 4°C條件下 密封保存。本發(fā)明的蛋白芯片在用于檢測(cè)特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的步驟為(1)提取組織或體液中的蛋白質(zhì)；(2)在本發(fā)明的蛋白芯片上加樣，特定糖鏈蛋白與凝集素結(jié)合、抗體/抗原特異結(jié) 合；(3)將處理好的芯片注入微流動(dòng)反應(yīng)池中進(jìn)行反應(yīng)，條件為緩沖液為pH7. 4的HBP EP緩沖液或PBS緩沖液；反應(yīng)溶積為10 μ 1 50 μ 1，反 應(yīng)時(shí)間為15分鐘 2小時(shí)。每一輪實(shí)驗(yàn)完畢后，芯片表面用含0. 1% SDS的HBS-EP溶液再生30秒，循環(huán)反應(yīng) 速度為5 20靚/min，反應(yīng)溫度為10 38°C。本發(fā)明還涉及一種特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)建立標(biāo)準(zhǔn)品的表面等離子諧振技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；a)取本發(fā)明的檢驗(yàn)特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的生物芯片，用Sra分析儀或分光 光度計(jì)測(cè)量得到第一組數(shù)據(jù)；b)在所述的生物芯片上加入標(biāo)準(zhǔn)品，待凝集素、抗原或抗體與特定糖鏈蛋白、抗體 或抗原結(jié)合后，用SI^R分析儀或分光光度計(jì)測(cè)量得到第二組數(shù)據(jù)；c)分析比較所述的第一組數(shù)據(jù)和所述的第二組數(shù)據(jù)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)按照同步驟(1)相同的方法建立待測(cè)樣品的曲線；(3)將標(biāo)準(zhǔn)品的曲線與待測(cè)樣品的曲線比較，從而確定待測(cè)樣品中特定糖鏈蛋白、 抗體或抗原是否存在以及存在的數(shù)量。本發(fā)明還涉及特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的檢驗(yàn)方法在檢測(cè)腫瘤、代謝性疾病或 免疫性疾病的應(yīng)用。其中，腫瘤、代謝性疾病或免疫性疾病包括肝癌、胃癌、肺癌、腸癌、肝癌、前列腺 癌、食管癌、鼻咽癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、糖鏈異常IgA腎病或糖尿病。本發(fā)明所具有的技術(shù)優(yōu)勢(shì)為本發(fā)明的生物芯片利用凝集素與特定糖鏈蛋白特異性結(jié)合、抗體/抗原特異結(jié) 合，對(duì)疾病尤其是糖鏈異常蛋白的檢測(cè)來進(jìn)行診斷，為疾病的診斷提供新途徑。
本發(fā)明的生物芯片利用凝集素與糖蛋白的特異性結(jié)合，抗體/抗原特異結(jié)合，具 有更高的特異性行和敏感性。本發(fā)明的生物芯片應(yīng)用表面等離子體共振原理進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，該方法簡(jiǎn)便易行， 成本較低，簡(jiǎn)化了操作步驟，縮短了檢測(cè)時(shí)間。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的具體實(shí)施方式
目的在于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的解釋和說明，并不對(duì)本發(fā) 明的內(nèi)容進(jìn)行限制。實(shí)施例1利用生物芯片檢測(cè)肝癌1.鋪制金膜1. 1按檸檬酸三鈉還原法制備金溶膠取0. 01%氯金酸水溶液IOOmL加熱煮沸，邊 攪拌邊加入檸檬酸三鈉水溶液0. 75ml，金黃色的氯金酸水溶液在2分鐘內(nèi)變成紫紅色， 繼續(xù)煮沸15分鐘，冷卻后以蒸餾水補(bǔ)足到原體積。1. 2金膜鋪制1.2. 1玻片酸洗清潔后，放入Ν-β-(氨乙基)-Y-氨丙基三價(jià)氧基硅烷(APTMS)/ 甲苯溶液中回流12小時(shí)后洗凈，取出，氮?dú)獯蹈?，置于清潔干燥處備用?. 2. 2處理好的玻片置納米金溶液中浸泡12小時(shí)后，浸入0. Olmol/L的PDDA水溶 液中10 15分鐘，取出用超凈水清洗。烘干后移入羥胺/氯金酸溶液中，浸泡20 30分 鐘，玻片表片形成光亮的金屬膜。2.制備 SAMs2. 1將制備好的金膜在piranha液(30% H2O2 濃硫酸體積比=1 3)中浸泡清 洗，然后用雙蒸水反復(fù)清洗，氮?dú)獯蹈桑?. 2將鋪制好金膜的芯片浸在有機(jī)硫化物的乙醇溶液中，其中有機(jī)硫化物的濃度 為lOmmol/L，時(shí)間為16小時(shí)，溫度為室溫；其中，所述的有機(jī)硫化物為長(zhǎng)鏈巰基乙醇為 HS- (CH2) 18-0H 和 HS- (CH2) 18_C00H 的混合物。2.3 SAM層的修飾2. 3. 1將固定有SAM表面的芯片加入0. 2M EDC/0. 05M NHS的水溶液活化，加入 0. 2M2-(2-氨基乙氧基)乙醇(AEE)反應(yīng)，2. 3. 2加入質(zhì)量百分比為6%的表氯醇，再加入葡聚糖，用lmol/L溴乙酸處理3 次，使葡聚糖羧基化。3.小扁豆凝集素(LCA)、AFP抗體與芯片的固定3. 1 將結(jié)合有羧基化的多聚糖的芯片與0. 2M EDC/0. 05M NHS反應(yīng)，反應(yīng)完畢用 IOmM的pH4. 5乙酸鈉緩沖溶液洗去活化試劑，3. 2在芯片表面不同的位點(diǎn)上分別滴加含有小扁豆凝集素(LCA)的緩沖溶液、含 有APF抗體的緩沖溶液；緩沖溶液為IOmM的pH4. 5乙酸鈉緩沖溶液，小扁豆凝集素的濃度 為 100 μ g/ml ；3.3結(jié)合反應(yīng)完畢后，加入去pH 8.0的2mol/L乙醇胺溶液將芯片上沒有與凝集 素反應(yīng)的活化基團(tuán)失活，將反應(yīng)完畢的芯片在潮濕的環(huán)境中孵育1小時(shí)，然后在0 4°C條 件下密封保存。
4.處理樣本取肝癌病人血清樣本300份，正常人血清樣本700份；5. SPR 檢測(cè)5. 1測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)甲胎蛋白異質(zhì)體及甲胎蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線5. 1. 1將制備好的芯片組裝到所制作的表面等離子共振傳感器棱鏡表面，流動(dòng)反 應(yīng)池中注入20 μ 1 HBP-EP緩沖液，預(yù)熱37°C 30分鐘，讀取此時(shí)反射光反射角度初始數(shù)值；5. 1. 2將甲胎蛋白異質(zhì)體及甲胎蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別注入到20 μ 1流動(dòng)反應(yīng)池中， 37°C反應(yīng)2小時(shí)，并讀取甲胎蛋白異質(zhì)體標(biāo)準(zhǔn)品及甲胎蛋白標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣點(diǎn)反射管反射角數(shù) 值；流動(dòng)反應(yīng)池中充入20 μ 1 HBP-EP緩沖液，37°C清洗1小時(shí)，重復(fù)3次；5. 1. 3 ；分別分析所得數(shù)據(jù)，得到甲胎蛋白異質(zhì)體標(biāo)準(zhǔn)品及甲胎蛋白標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲 線.
一入 ，5. 2按照相同的方法建立待測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體及甲胎蛋白的表面等離子諧振技術(shù) 的曲線；5. 3分別將甲胎蛋白異質(zhì)體、甲胎蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的曲線與待測(cè)甲胎蛋白異質(zhì)體及甲 胎蛋白的曲線比較，從而確定待測(cè)樣品中甲胎蛋白異質(zhì)體、甲胎蛋白是否存在以及存在的數(shù)量。6.結(jié)果判定6. 1 AFP-L3 比率=(AFP-L3 含量 /AFP 含量)X 100%陽(yáng)性結(jié)果甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3)占總甲胎蛋白(AFP)比率彡10%陰性結(jié)果甲胎蛋白異質(zhì)體(AFP-L3)占總甲胎蛋白(AFP)比率彡10%檢測(cè)結(jié)果用本方法檢測(cè)700例正常人的血清樣品，檢測(cè)結(jié)果685例為陰性，15例為假陽(yáng)性， 特異性為97. 86% ；用本方法檢測(cè)300例原發(fā)性肝癌患者血清，287例為陽(yáng)性，13例為假陰 性，與病理檢測(cè)結(jié)果的符合率為95. 67%。實(shí)施例2利用生物芯片檢測(cè)糖鏈異常IgA腎炎1.鋪制金膜1.1按檸檬酸三鈉還原法制備金溶膠取0. 01 %氯金酸水溶液IOOmL加熱煮沸，邊 攪拌邊加入檸檬酸三鈉水溶液0. 75ml，金黃色的氯金酸水溶液在2分鐘內(nèi)變成紫紅色， 繼續(xù)煮沸15分鐘，冷卻后以蒸餾水補(bǔ)足到原體積。1.2金膜鋪制1.2.1玻片酸洗清潔后，放入Ν-β-(氨乙基)-Y氨丙基三價(jià)氧基硅烷(APTMS)/ 甲苯溶液中回流12小時(shí)后洗凈，取出，氮?dú)獯蹈桑糜谇鍧嵏稍锾巶溆茫?. 2. 2處理好的玻片置納米金溶液中浸泡12小時(shí)后，浸入0. Olmol/L的PDDA水溶 液中15分鐘，取出用超凈水清洗。烘干后移入羥胺/氯金酸溶液中，浸泡30分鐘，玻片表 片形成光亮的金屬膜。2.制備 SAMs2. 1將制備好的金膜在piranha液(30% H202 濃硫酸體積比=1 3)中浸泡
清洗，然后用雙蒸水反復(fù)清洗，氮?dú)獯蹈桑?. 2將鋪制好金膜的芯片浸在有機(jī)硫化物的乙醇溶液中，其中有機(jī)硫化物的濃度
9為lOmmol/L，時(shí)間為13小時(shí)，溫度為室溫；其中，所述的有機(jī)硫化物為長(zhǎng)鏈巰基乙醇為 HS- (CH2) 15-0H 和 HS- (CH2) 15_C00H 的混合物。2.3 SAM層的修飾2. 3. 1將固定有SAM表面的芯片加入0.2M EDC/0. 05M NHS的水溶液活化，加入 0. 2M2-(2-氨基乙氧基)乙醇(AEE)反應(yīng)，2. 3. 2加入質(zhì)量百分比為6%的表氯醇，再加入葡聚糖，用lmol/L溴乙酸處理5 次，使葡聚糖羧基化。3.蝸牛凝集素(HAA/HPA)或長(zhǎng)柔毛野豌豆凝集素(VVL)與芯片的固定3. 1 將結(jié)合有羧基化的多聚糖的芯片與0. 2M EDC/0. 05M NHS反應(yīng)，反應(yīng)完畢后 用IOmM的pH4. 5乙酸鈉緩沖溶液洗去活化試劑；3. 2在芯片表面加上含有蝸牛凝集素的緩沖溶液；緩沖溶液為IOmM的pH4. 5乙酸 鈉緩沖溶液，蝸牛凝集素的濃度為100μ g/ml ；3. 3結(jié)合反應(yīng)完畢后，加入去乙醇胺的堿性溶液將芯片上沒有與凝集素反應(yīng)的活 化基團(tuán)失活，乙醇胺堿性溶液的濃度為2mol/L，pH值為8. 0。將反應(yīng)完畢的芯片在潮濕的環(huán)境中孵育1小時(shí)，然后在0 4°C條件下密封保存。4.處理樣本取糖鏈異常IgA腎炎患者血清300份和正常人血清700份5. SPR 檢測(cè)5. 1測(cè)定糖鏈異常IgA標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線5. 1. 1將制備好的芯片組裝到所制作的表面等離子共振傳感器棱鏡表面，流動(dòng)反 應(yīng)池中注入20 μ 1 HBP-EP緩沖液，預(yù)熱37°C 30分鐘，讀取此時(shí)反射光反射角度初始數(shù)值；5. 1. 2將糖鏈異常IgA標(biāo)準(zhǔn)品注入到20 μ 1流動(dòng)反應(yīng)池中，37°C反應(yīng)2小時(shí)，并讀 取糖鏈異常IgA標(biāo)準(zhǔn)品反射角數(shù)值；流動(dòng)反應(yīng)池中充入20 μ 1 HBP-EP緩沖液，37°C清洗1 小時(shí)，重復(fù)3次；5. 1. 3 ；分析比較上述檢測(cè)數(shù)據(jù)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；5. 2按照相同的方法建立待測(cè)樣品的表面等離子諧振技術(shù)的曲線；5. 3將標(biāo)準(zhǔn)品的曲線與待測(cè)樣品的曲線比較，從而確定待測(cè)樣品中待測(cè)物是否存 在以及存在的數(shù)量。6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果用本方法檢測(cè)700例正常人的血清樣品，檢測(cè)結(jié)果694例為陰性，6例為假陽(yáng)性，特 異性為99. 14% ；用本方法檢測(cè)300例糖鏈異常IgA腎炎患者血清，297例為陽(yáng)性，3例為假 陰性，與腎穿刺病理檢測(cè)結(jié)果的符合率為99%。
10
權(quán)利要求
一種利用表面等離子諧振技術(shù)檢測(cè)特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的生物芯片，其特征在于，所述的特定糖鏈蛋白包括糖鏈異常蛋白，所述的生物芯片在基底上有金屬膜，在金屬表面上固定有連接層，在連接層上固定有凝集素、抗原或抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的利用表面等離子諧振技術(shù)檢測(cè)特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的生 物芯片，其特征在于，所述金屬膜的厚度為55 lOOnm。
3.如權(quán)利要求1所述的利用表面等離子諧振技術(shù)檢測(cè)特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的生 物芯片，其特征在于，所述的金屬膜選自金膜、銀膜或鉬膜。
4.如權(quán)利要求1所述的利用表面等離子諧振技術(shù)檢測(cè)特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的生 物芯片，其特征在于，所述的連接層是由一端具有活性基團(tuán)、另一端通過巰基與金屬膜反應(yīng) 的長(zhǎng)鏈巰基乙醇構(gòu)成的混合自組裝單分子層，再經(jīng)激活制備而成。
5.如權(quán)利要求4所述的利用表面等離子諧振技術(shù)檢測(cè)特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的生 物芯片，其特征在于，所述的激活的過程包括以下步驟(1)將固定有混合自組裝單分子層表面的芯片用交聯(lián)劑1-乙基-3_(3-二甲基氨丙 基)-碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺活化，再與2- (2-氨基乙氧基)乙醇反應(yīng)；(2)將步驟(1)得到的芯片與表氯醇反應(yīng)生成環(huán)氧功能化的表面，然后與多聚糖或可 膨脹的有機(jī)聚合體結(jié)合；(3)用溴乙酸處理2 5次使多聚糖或可膨脹的有機(jī)聚合體的多糖鏈羧基化。
6.如權(quán)利要求5所述的利用表面等離子諧振技術(shù)檢測(cè)特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的生 物芯片，其特征在于，所述的多聚糖選自葡聚糖、甘露聚糖、半乳甘露聚、果膠半乳糖或瓊脂 糖。
7.如權(quán)利要求4所述的利用表面等離子諧振技術(shù)檢測(cè)特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的生 物芯片，其特征在于，所述的長(zhǎng)鏈巰基乙醇的為(1)HS-(CH2) n-R 和 HS- (CH2) η-R，的混合物，(2)不對(duì)稱的二烷基二硫化物R-(CH2) mS-S (CH2) n-R’，和(3)不對(duì)稱的二烷基硫化物R-(CH2)m-S-(CH2)n-R’；其中，m和η分別選自5到20的正整數(shù)，R和R’分別表示烷基的末端基團(tuán)，選自甲基、羥基、羧基或氨基。
8.一種特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)建立標(biāo)準(zhǔn)品的表面等離子諧振技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；a)取權(quán)利要求1 7所述的檢驗(yàn)特定糖鏈、抗體或抗原的生物芯片，用SI^R分析儀或分 光光度計(jì)測(cè)量得到第一組數(shù)據(jù)；b)在所述的生物芯片上加入標(biāo)準(zhǔn)品，待凝集素、抗原或抗體與特定糖鏈蛋白、抗體或抗 原結(jié)合后，用SI^R分析儀或分光光度計(jì)測(cè)量得到第二組數(shù)據(jù)；c)分析比較所述的第一組數(shù)據(jù)和所述的第二組數(shù)據(jù)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)按照同步驟(1)相同的方法建立待測(cè)樣品的曲線；(3)將標(biāo)準(zhǔn)品的曲線與待測(cè)樣品的曲線比較，從而確定待測(cè)樣品中特定糖鏈蛋白、抗體 或抗原是否存在以及存在的數(shù)量。
9.權(quán)利要求8所述的特定糖鏈蛋白、抗體或抗原的檢驗(yàn)方法在檢測(cè)腫瘤、代謝性疾病 或免疫性疾病的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤、代謝性疾病或免疫性疾病 選自肝癌、胃癌、肺癌、腸癌、肝癌、前列腺癌、食管癌、鼻咽癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、糖鏈 異常IgA腎病或糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物芯片領(lǐng)域，特別是涉及一種利用表面等離子諧振技術(shù)檢測(cè)特定糖鏈蛋自、抗體或抗原蛋自芯片及其基于表面等離子諧振原理的檢測(cè)方法。本發(fā)明的芯片在基底上有金屬膜，在金屬膜表面上固定有連接層，在連接層上固定有凝集素或其他抗原或抗體；所述的連接層是由一端具有活性基團(tuán)、另一端通過巰基與金屬膜反應(yīng)的長(zhǎng)鏈巰基乙醇構(gòu)成的自組裝單分子層，再經(jīng)激活制備而成。本發(fā)明的芯片利用凝集素與特定糖鏈蛋自的特異性結(jié)合、特異性抗原抗體結(jié)合來診斷疾病，為疾病的診斷提供了新的途徑。該方法簡(jiǎn)便易行，成本較低，簡(jiǎn)化了操作步驟，縮短了檢測(cè)時(shí)間，是一種適宜推廣的新方法。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101968440SQ20091030488
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月27日
發(fā)明者劉睿強(qiáng) 申請(qǐng)人:上海慧普生物醫(yī)藥科技有限公司