專利名稱：一種檢測乳品中多種抗生素殘留的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種食品中獸藥殘留檢測技術(shù)。特別是涉及在采用表面等離子體共
振傳感器進行乳品中抗生素殘留檢測過程中的樣品處理及傳感器修飾方法。
背景技術(shù)：
抗生素在乳制品中的殘留越來越引起關(guān)注。除了一些常見的炎癥疾病，奶牛尤 其易患乳腺炎，因此獸醫(yī)常采用抗生素進行治療。由于一般抗生素能耐高溫，現(xiàn)有的加 熱殺菌工藝根本無法完全消除牛奶中的抗生素殘留。長期飲用含有微量抗生素的牛奶， 會增加人體內(nèi)細菌的耐藥性，降低或完全抵消抗生素類藥物的療效，另外，對于特定人 群，含有超量抗生素的牛奶還可能會引起抗生素過敏反應(yīng)。 目前鮮奶中抗生素殘留的檢測方法大致分為三類，分別是生物測定法(微生物 測定法和放射受體測定法等)、理化分析法(波譜法和色譜及聯(lián)用技術(shù)等)、免疫法(放射 免疫法、熒光免疫法和酶聯(lián)免疫法等)。由于生物測定法和理化分析法都具有測量程序復(fù) 雜、時間長等缺點，不適宜廣泛推廣，因此， 一些基于免疫法的檢測技術(shù)得到了快速發(fā) 展，有代表性的有酶聯(lián)免疫法、免疫傳感器等等。這些檢測技術(shù)采用抗生素與其抗體的 特異性反應(yīng)，能夠快速、準確的檢測出乳品中的抗生素殘留，檢測限達到了歐盟對乳品 中抗生素殘留的最高檢測限(Maxmum Residue Limit, MRL)。 這些免疫法的檢測技術(shù)也存在缺點，檢測用的試劑盒和傳感器往往具有專一 性。如在酶聯(lián)免疫試劑盒中，針對青霉素的試劑盒是無法檢測其他抗生素的，因為試劑 盒中的酶標抗體只針對青霉素抗體。而在免疫傳感器中，無論是直接法還是間接法，傳 感器上只針對待檢測的抗生素進行配體固定，對其他類的抗生素也不再適用(同類的結(jié)構(gòu) 相似的抗生素除外)。因此，檢測用的試劑盒和傳感器作為免疫法的耗材需要量很大，而 它們的成本往往都很高。例如，采用表面等離子體共振原理檢測的儀器BIACore，其常 用的傳感器芯片CM5成本為2000多元人民幣，有4個通道可以使用，最多檢測4種抗生 素。免疫法的耗材成本高也是其無法廣泛推廣的主要原因。 在采用表面等離子體共振技術(shù)的傳感器進行抗生素的檢測時，有兩種方法，直 接法和競爭法，這兩種方法中，傳感器均具有專一性。在采用直接法進行抗生素檢測 時，需要在傳感器表面固定相應(yīng)抗生素的單克隆/多克隆抗體，當(dāng)含有該抗生素的牛乳 流過時，傳感器對抗生素進行吸附，光學(xué)信號發(fā)生變化，產(chǎn)生響應(yīng)。由于抗生素的分子 量很小(幾百Da)，其信號與儀器噪聲水平接近，因此， 一般的表面等離子體共振傳感器 的檢測極限無法檢出該信號，隨著一些高精度儀器的發(fā)展，可以進行某些抗生素在最高 限量值附近的檢測，但是對于一些限量值極低的抗生素(如，青霉素G的最高限量值為 4ppb)仍然無法實現(xiàn)。競爭法需要在傳感器表面固定待檢測的抗生素或者抗生素偶聯(lián)物， 在樣品中加入定量的該抗生素的單克隆/多克隆抗體進行競爭抑制，當(dāng)樣品流經(jīng)傳感器 時，可以特異性的吸附未與抗生素結(jié)合的多余抗體，由于抗體分子量很大(幾萬-幾十萬 Da)，因此，檢測信號很大，而多余抗體的量也間接的反應(yīng)了樣品中抗生素的含量。因此，競爭法通過轉(zhuǎn)換測量對象，大大增加了傳感器的響應(yīng)，是被廣泛采用的方法，但傳 感器的專一性問題仍然存在。 有文獻報道，采用地高辛(digoxigenin， DIG)標記氨芐青霉素進行競爭法的檢 測，與本文所述的檢測方法有類似之處，但是由于DIG為小分子，采用DIG對其他抗生 素進行標記幾乎很難實現(xiàn)，未見過標記成功的報道，而該文獻也未提出將DIG標記的檢 測方法推廣到多種抗生素的檢測。因此，采用DIG標記的方法僅限于某些特殊的可被 DIG的少數(shù)抗生素。有些抗生素可以采用生物素進行標記，但是也僅限于很少的幾種抗 生素。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種采用同一表面等離子體共振 傳感器檢測乳品中多種抗生素殘留的方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中傳感器專一，不能測量多種 抗生素的問題 本發(fā)明的技術(shù)方案為 一種采用同一表面等離子體共振生物傳感器實現(xiàn)多種乳 品中抗生素殘留檢測的方法，包括以下步驟 (1)對傳感器表面進行修飾，采用分子標記物的抗體或特異性吸附蛋白進行配體 固定； (2)對乳品樣品采取預(yù)處理，對樣品中的抗生素進行兩次競爭抑制，如圖l所 示，包括 首先，向樣品中加入適量的待測抗生素的單克隆/多克隆抗體進行一段時間的孵 化，使得樣品中的抗生素與其抗體充分反應(yīng)，其中抗體為過量； 其次，繼續(xù)向樣品中加入適量的被分子探針標記的待測抗生素，進行一段時間 孵化，樣品中剩余的抗體又與新加入的被分子標記的抗生素反應(yīng)，其中分子探針標記的 抗生素相對上步中加入的抗體量為過量； (3)測量環(huán)節(jié)將預(yù)處理后的樣品通入傳感器表面，使被分子標記的抗生素抗體 復(fù)合物和被分子標記的抗生素被吸附，通過測量分子標記的抗生素抗體復(fù)合物間接測量 樣品中抗生素的含量； (4)對傳感器表面進行重建，對其它抗生素預(yù)處理，進行另一種抗生素測量。
所述分子標記物為多肽或蛋白質(zhì)。
所述步驟(3)測量環(huán)節(jié)包括如下步驟 (1)通入磷酸鹽或者鹽酸鹽或者硼酸鹽緩沖液作為測量基準；
(2)用緩沖液配置不同所測抗生素濃度的溶液； (3)按照權(quán)利要求1步驟(1)所述方法，對配置的溶液進行預(yù)處理； (4)將預(yù)處理后的溶液通入傳感器一段時間，再通入緩沖液沖洗，記錄通入溶液
前后的傳感器響應(yīng)差值； (5)對傳感器的表面進行重建，并通入緩沖液沖洗；
(6)依次通入其他濃度的溶液，均記錄傳感器響應(yīng)值； (7)將各個濃度下的傳感器響應(yīng)繪制工作曲線，并進行二次多項式曲線擬合，獲 得回歸曲線的方程；
(8)對于未知抗生素濃度的奶制樣品進行測量，同樣按照步驟(4)、 (5)進行，獲 得樣品通入前后的傳感器差值； (9)將傳感器響應(yīng)值代入回歸曲線方程，預(yù)測出樣品的抗生素濃度值。
所述蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白或卵清蛋白或匙孔血藍蛋白等。 所述步驟(4)中傳感器表面的重建是通入一定濃度的酸或堿或高離子強度電解質(zhì) 溶液，用以破壞抗原抗體的結(jié)合。 本發(fā)明引入分子探針技術(shù)，將表面等離子體共振傳感器對待測抗生素的測量轉(zhuǎn) 換為對分子探針的測量，采用可對抗生素進行標記的分子探針的單克隆/多克隆抗體或者 特異性吸附蛋白對表面等離子體共振傳感器進行化學(xué)修飾，從而實現(xiàn)傳感器的通用性， 對任意可被分子探針標記的抗生素均可進行測量。具體測量的轉(zhuǎn)換環(huán)節(jié)是通過樣品的預(yù) 處理實現(xiàn)的。 所述的測量環(huán)節(jié)是采用分子間相互作用原理實現(xiàn)的，采用分子探針的抗體或者 特異性吸附蛋白對傳感器表面進行修飾，將預(yù)處理后的樣品通入傳感器表面時，被分子 標記的抗生素抗體復(fù)合物和被分子標記的抗生素均被吸附。由于被吸附的兩種分子，其 總量是不變的，各自的含量成互補關(guān)系，若分子標記的抗生素含量多，則分子標記的抗 生素-抗體量少，此時引起的傳感器響應(yīng)越小。在對不同抗生素濃度的樣品進行測量時， 抗生素含量越多，傳感器吸附的分子標記的抗生素-抗體量越少，因此傳感器響應(yīng)越小。 這樣，就實現(xiàn)了測量對象的轉(zhuǎn)換，通過測量分子標記的抗生素-抗體復(fù)合物間接測量樣品 中的抗生素。由于抗體的分子量很大，因此，傳感器的響應(yīng)很大，測量極限較低。配置 不同濃度抗生素含量的樣品獲得其傳感器響應(yīng)，建立標準工作曲線，即可確定出樣品中 的抗生素殘留量。具體測量原理見附圖2。 所述的傳感器對多種抗生素測量是通過對樣品進行不同的預(yù)處理實現(xiàn)的，而測 量環(huán)節(jié)是相同的，均是通過分子探針的抗體對其的特異性吸附實現(xiàn)的。對不同抗生素的 檢測，在預(yù)處理環(huán)節(jié)只需要在步驟(l)、 (2)分別加入待測量的該抗生素的單克隆/多克隆 抗體和分子探針標記的該抗生素即可。值得注意的是，要保證抗生素標記所使用的分子 探針是相同的。 在測量步驟(2)中，配置的抗生素濃度選擇依據(jù)為圍繞該抗生素的最高限量值 MRL展開，覆蓋0到2倍MRL，選擇適當(dāng)?shù)臐舛忍荻燃纯伞?本發(fā)明提供的采用表面等離子體共振傳感器檢測乳品中多種抗生素殘留的方 法，借助分子探針技術(shù)，解決了在表面等離子體共振傳感器進行抗生素殘留檢測過程中 的傳感器專一性問題。通過對抗生素進行適當(dāng)?shù)姆肿訕擞?，并通過樣品的預(yù)處理將抗生 素的檢測轉(zhuǎn)換為對分子探針的測量，實現(xiàn)了同一傳感器對多種抗生素的檢測。這一發(fā) 明，增加了檢測過程中所需的試劑，但大大節(jié)省了傳感器的使用數(shù)量和傳感器配體固定 所需的時間，促進了基于表面等離子體共振的抗生素殘留檢測技術(shù)的推廣和實際應(yīng)用的 發(fā)展。


圖1是本發(fā)明所述的待測樣品的預(yù)處理方法流程圖；其中(a)為樣品中含有抗生 素
(b)為樣品中不含抗生素；a代表抗生素；入代表抗生素抗體；令代表分子探針；金代表分子標記的抗生素。
圖2是本發(fā)明所述的抗生素檢測原理圖；其中(a)為樣品中含有抗生素 (b)為樣品中不含抗生素；厶代表抗生素；入代表抗生素抗體；令代表分子
探針 代表分子標記的抗生素；，分子探針抗體或特異性吸附蛋白。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作以詳細描述。 實施例主要針對分子探針為大分子量(> lOOOODa)的標記物進行說明，如多肽、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、匙孔血藍蛋白(KLH)等生物大分子。
具體實例分子探針以BSA為例，兩種抗生素以氨芐青霉素和鏈霉素為例，具體操作方法如下 (1)傳感器配體修飾方法 表面等離子體共振傳感器表面為一層金或者銀的金屬薄膜，通常采用的方法是在其表面通過化學(xué)鍵修飾一層羧甲基葡聚糖，然后通過胺連接或者硫醇連接將配體固定到傳感器表面，并封閉位點，形成待測表面。 本例采用BSA抗體作為配體，采用胺連接進行固定，用以吸附BSA標記后的抗生素。該方法屬通用方法，不再贅述。[OO43] (2)氨芐青霉素的BSA標記 采用碳化二亞胺(EDC)法或者戊二醛法對氨芐青霉素進行BSA的標記處理，待用?；蛘咧苯淤徺I氨芐青霉素-BSA偶聯(lián)物待用。[OO45] (3)含氨芐青霉素的樣品預(yù)處理方法
樣品在進行測量之前需要進行兩步預(yù)處理 1)向樣品中加入相對于氨芐青霉素含量過量的氨芐青霉素單克隆抗體，混合均勻，孵化15分鐘； 2)向樣品中加入相對于1)中抗體量過量的氨芐青霉素-BSA偶聯(lián)物，混合均勻，孵化15分鐘。 (4)氨芐青霉素的測量方法 對處理好的樣品，可采用(1)中修飾好的傳感器進行測量，具體測量步驟為
1)通入磷酸鹽緩沖液作為測量基準； 2)用磷酸鹽緩沖液配置不同氨芐青霉素濃度的溶液，依次為0， lng/ml， 2ng/ml， 4ng/ml， 6ng/ml， 8ng/ml， 艮卩約為0， 0.25MRL， 0.5MRL， 1MRL， 1.5MRL，2MRL 。
氨芐青霉素的MRL為4ppb 。
3)按照(3)所述，對配置的溶液進行相同預(yù)處理； 4)將預(yù)處理后的溶液通入傳感器10分鐘，再通入緩沖液沖洗5分鐘，記錄通入溶液前后的傳感器相應(yīng)差值；
5)對傳感器的表面通入進行重建，NaOH溶液(0.1mol/L)10分鐘，用以破壞抗原抗體的結(jié)合，并通入緩沖液沖洗； 6)依次通入2)中配置的其他濃度的溶液，記錄下通入前后的緩沖液的傳感器響應(yīng)差值； 7)將各個濃度下的傳感器響應(yīng)繪制工作曲線，并進行二次多項式曲線擬合，獲得回歸曲線的方程； 8)對于未知抗生素濃度的奶制樣品進行測量，同樣按照步驟(4)、 (5)進行，獲得樣品通入前后的傳感器差值； 9)將傳感器響應(yīng)值代入回歸曲線方程，預(yù)測出樣品的抗生素濃度值。(5)對傳感器表面進行重建，NaOH溶液(0.1mol/L)10分鐘，對待測的另一種抗生
素鏈霉素溶液進行預(yù)處理，將抗體變?yōu)殒溍顾貑慰寺】贵w，而氨芐青霉素-BSA偶聯(lián)物變
為鏈霉素-BSA偶聯(lián)物。 鏈霉素溶液的測量方法與(4)相同，步驟2)中配置的溶液濃度改為0， 50ng/ml，100ng/ml， 200ng/ml， 300ng/ml， 400ng/ml，艮卩約為0， 0.25MRL， 0.5MRL， 1MRL，1.5MRL， 2MRL。
鏈霉素的MRL為200ppb。 本發(fā)明傳感器表面重建所用溶液還可以是鹽酸溶液或弱酸弱堿溶液或高離子強度電解質(zhì)溶液，用以破壞抗原抗體的結(jié)合。 本發(fā)明為了敘述的準確和方便，在實施例中均以氨芐青霉素和鏈霉素為例進行詳細描述，但本發(fā)明同樣適用于其他抗生素，如青霉素類和氨基糖苷類的其他抗生素、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等抗生素的精確檢測和定性分析，因此上述內(nèi)容均在本發(fā)明保護范圍之內(nèi)。 盡管本發(fā)明的組合和方法已通過詳細實施過程進行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本申請所述的方法進行拼接或改動，或增減某些附加方法，更具體地說，所有相類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，他們都被視為包括在本發(fā)明精神、范圍和內(nèi)容之中。
權(quán)利要求
一種檢測乳品中多種抗生素殘留的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)對傳感器表面進行修飾，采用分子標記物的抗體或特異性吸附蛋白進行配體固定；(2)對乳品樣品采取預(yù)處理，對樣品中的抗生素進行兩次競爭抑制，包括首先，向樣品中加入適量的待測抗生素的單克隆/多克隆抗體進行一段時間的孵化，使得樣品中的抗生素與其抗體充分反應(yīng)，其中抗體為過量；其次，繼續(xù)向樣品中加入適量的被分子探針標記的待測抗生素，進行一段時間孵化，樣品中剩余的抗體又與新加入的被分子標記的抗生素反應(yīng)，其中分子探針標記的抗生素相對上步中加入的抗體量為過量；(3)測量環(huán)節(jié)將預(yù)處理后的樣品通入傳感器表面，使被分子標記的抗生素-抗體復(fù)合物和被分子標記的抗生素被吸附，通過測量分子標記的抗生素-抗體復(fù)合物間接測量樣品中抗生素的含量；(4)對傳感器表面進行重建，對其它抗生素預(yù)處理，進行另一種抗生素測量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測乳品中多種抗生素殘留的方法，其特征在于，所述分子標記物為多肽或蛋白質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測乳品中多種抗生素殘留的方法，其特征在于，所述步驟(3) 測量環(huán)節(jié)包括如下步驟(1) 通入磷酸鹽或者鹽酸鹽或者硼酸鹽緩沖液作為測量基準；(2) 用緩沖液配置不同所測抗生素濃度的溶液；(3) 按照權(quán)利要求1步驟(1)所述方法，對配置的溶液進行預(yù)處理；(4) 將預(yù)處理后的溶液通入傳感器一段時間，再通入緩沖液沖洗，記錄通入溶液前后的傳感器響應(yīng)差值；(5) 對傳感器的表面進行重建，并通入緩沖液沖洗；(6) 依次通入其他濃度的溶液，均記錄傳感器響應(yīng)值；(7) 將各個濃度下的傳感器響應(yīng)繪制工作曲線，并進行二次多項式曲線擬合，獲得回歸曲線的方程；(8) 對于未知抗生素濃度的奶制樣品進行測量，同樣按照步驟(4)、 (5)進行，獲得樣品通入前后的傳感器差值；(9) 將傳感器響應(yīng)值代入回歸曲線方程，預(yù)測出樣品的抗生素濃度值。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測乳品中多種抗生素殘留的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白或卵清蛋白或匙孔血藍蛋白等。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測乳品中多種抗生素殘留的方法，其特征在于，所述步驟(4) 中傳感器表面的重建是通入一定濃度的酸或堿或高離子強度電解質(zhì)溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測乳品中多種抗生素殘留的方法，通過對傳感器表面進行特定修飾，采用分子標記物的抗體或特異性吸附蛋白進行配體固定；對乳品樣品采取一系列預(yù)處理，對樣品中的抗生素進行兩次競爭抑制，將預(yù)處理后的樣品通入傳感器表面，使被分子標記的抗生素-抗體復(fù)合物和被分子標記的抗生素被吸附，通過測量分子標記的抗生素-抗體復(fù)合物間接測量樣品中抗生素的含量；并對傳感器表面進行重建，對其它抗生素預(yù)處理，進行另一種抗生素測量。本發(fā)明實現(xiàn)了同一傳感器對多種抗生素的檢測，大大節(jié)省了傳感器的使用數(shù)量和傳感器配體固定所需的時間，促進了基于表面等離子體共振的抗生素殘留檢測技術(shù)的推廣和實際應(yīng)用的發(fā)展。
文檔編號G01N33/02GK101692080SQ20091030819
公開日2010年4月7日 申請日期2009年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月12日
發(fā)明者劉瑾, 張婉潔, 徐可欣, 蘇洋, 賈大超 申請人:天津大學(xué)