專利名稱：一種a型肉毒毒素檢測(cè)試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種A型肉毒毒素檢測(cè)試 紙條。
背景技術(shù)：
肉毒毒素(Botulinum neurotoxin, BoNT )是由厭氧的肉毒梭菌 (Clostridium botulinum)產(chǎn)生的一種毒性極強(qiáng)的蛋白類毒素，其中A、 B、 E型肉毒毒素可引起人類肉毒中毒，我國報(bào)道由肉毒毒素致病者大多數(shù)為 A型。各型肉毒毒素分子量均約150 000D;由二硫鍵鏈接重鏈和輕鏈組 成，包括一條重鏈(H，約100kD)和一條輕鏈(L，約50kD)， H鏈包含了 N-末端(約50kD)和C-末端(約50kD),輕鏈通過二石充鍵與重鏈的N-末端 連接。其中A型肉毒毒素的研究最為深入，其應(yīng)用也最為廣泛。從對(duì)A型 毒素的研究來推斷，肉毒毒素分子是一種酸性蛋白質(zhì)，各型毒素的等電 點(diǎn)(pl)在5.3~6. l之間。肉毒毒素是已知毒素中毒力最強(qiáng)(天然物質(zhì)中 最強(qiáng))的神經(jīng)麻痹毒素，比氰化鉀毒力大1萬倍，其小鼠LD50介于0. 1 ~
lng/kg體重，少至0.1-1 jug的毒素就可導(dǎo)致成人中毒死亡，純化的肉 毒毒素lmg能殺死2億只小鼠。BoNT可以經(jīng)消化道攝入、呼吸道吸入、 傷口或眼睛等吸收而導(dǎo)致人類肉毒中毒。此外，該毒素凈皮一些國際恐怖 和極端組織利用來制造恐慌。自"9ar，恐怖襲擊事件后，美英等西方國 家便把BoNT列為最有可能被使用的生物恐怖劑之一。因此，了解和認(rèn)識(shí) BoNT檢測(cè)方法對(duì)于及早采取應(yīng)對(duì)措施具有十分重要的醫(yī)學(xué)和軍事意義。
現(xiàn)階段檢測(cè)方法則根據(jù)肉毒毒素所具有的理化特性、生化特性和免 疫原性發(fā)展出的多種檢測(cè)法，其中以免疫檢測(cè)法為主。免疫檢測(cè)法大多 是依賴于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)方法，包括多克隆和/或單克隆為基礎(chǔ)的 放射免疫法或酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，免疫層析試驗(yàn)和電化學(xué)發(fā)光生 物傳感器等。盡管免疫檢測(cè)法發(fā)展迅速，但經(jīng)典的小鼠致死試驗(yàn)仍是檢 測(cè)肉毒毒素的金標(biāo)準(zhǔn)。目前肉毒毒素中毒的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，檢出污染物中存在肉毒毒素并鑒 定出毒素型別是確定肉毒中毒的關(guān)鍵。肉毒毒素檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是經(jīng)典的
小鼠致死試驗(yàn)，其檢出極限可達(dá)10-20 pg,但該實(shí)-瞼也存在許多缺點(diǎn)， 主要表現(xiàn)在耗時(shí)長、工作量大、需要大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等。國內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn) 室都曾在血清學(xué)檢測(cè)方法上做過大量研究，如酶聯(lián)免疫分析(ELISA)、 放射免疫分析、肽鏈內(nèi)切酶聯(lián)免疫檢測(cè)等，這些方法在克服耗時(shí)性、需 要特殊設(shè)備以及檢驗(yàn)靈敏度和特異性矛盾等方面存在或多或少的缺陷， 從而限制了這些方法的推廣應(yīng)用，至今還沒有哪種方法能真正替代經(jīng)典 的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

實(shí)用新型內(nèi)容
本實(shí)用新型的目的在于提供一種方便、快捷地檢測(cè)A型肉毒毒素的抗 原試紙。該試紙的工作原理是利用特異性抗原-抗體的結(jié)合，用膠體金 標(biāo)記抗體，與待檢抗原結(jié)合后，使與試紙結(jié)合的捕獲抗體顯色。
本實(shí)用新型試紙?jiān)跈z測(cè)A型肉毒毒素的同時(shí)，可利用金標(biāo)免疫分析儀
進(jìn)行的半定量檢測(cè)方法。
本實(shí)用新型一種方便、快捷地檢測(cè)A型肉毒毒素的檢測(cè)試紙，它包含
(1)反應(yīng)支持物； (2 )吸水墊；
(3 )硝酸纖維膜，該膜包被有A型肉毒毒素的多克隆抗體條帶和質(zhì) 控羊抗兔IgG的條帶；
(4 )金標(biāo)抗體保護(hù)膜，其中含有膠體金標(biāo)記的A型肉毒毒素單克隆抗體。
本實(shí)用新型涉及的上述A型肉毒毒素的檢測(cè)試紙，它還包含樣品墊， 該樣品墊的材料選用聚脂膜、玻璃纖維或?yàn)V紙纖維。
本實(shí)用新型涉及的上述A型肉毒毒素的檢測(cè)試紙，其中反應(yīng)支持物 選用PVC板。
本實(shí)用新型涉及的上述A型肉毒毒素的檢測(cè)試紙，其中吸水墊選用 濾油紙。
本實(shí)用新型涉及的上述A型肉毒毒素的檢測(cè)試紙，其中金標(biāo)抗體保 護(hù)膜的材料選用聚脂膜、玻璃纖維或?yàn)V紙纖維，其上均勻涂布有膠體金標(biāo)記的A型肉毒毒素單克隆抗體。
另一方面，本實(shí)用新型涉及的上述A型肉毒毒素的檢測(cè)試紙，其中， 吸水墊、硝酸纖維膜、金標(biāo)抗體保護(hù)膜、樣品墊和反應(yīng)支持物按照附圖1 所示方式構(gòu)成；反應(yīng)支持物5位于底層，硝酸纖維膜2位于反應(yīng)支持物5 上的中部，該膜的T處是A型肉毒毒素單克隆抗體包被的檢測(cè)條帶，并 且C處是羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶；金標(biāo)抗體保護(hù)膜3位于硝酸纖維 膜上部的一側(cè)并與之部分重疊，該膜含有膠體金標(biāo)記的A型肉毒毒素單 克隆抗體；吸水墊1位于硝酸纖維膜2上部的相對(duì)于金標(biāo)抗體保護(hù)膜3 而言的另一側(cè)并與2部分重疊；樣品墊4位于2上與1相反的一側(cè)并與3 部分重疊。
又一方面，本實(shí)用新型涉及的上述A型肉毒毒素的檢測(cè)試紙，以吸 水墊一側(cè)為起始端，樣品墊一側(cè)為末端，A型肉毒毒素單克隆抗體的檢測(cè) 條帶位于接近末端，羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶接近于起始端。
再一方面，A型肉毒毒素單克隆抗體的條帶與羊抗兔IgG包被的質(zhì)控 條帶之間的距離適宜是硝酸纖維膜長度的25%- 75%長，優(yōu)選40% - 60% , 更優(yōu)選45 - 55 %,最優(yōu)選50%。
本實(shí)用新型A型肉毒毒素檢測(cè)試紙的制備方法，該方法包括 (1)用隔流噴金劃線機(jī)以一定噴膜速度噴涂A型肉毒毒素的多克隆 抗體和質(zhì)控羊抗兔IgG兩個(gè)條帶的硝酸纖維膜；
在該噴涂包被膜的步驟中，噴膜速度優(yōu)選是10-100mm/s,更優(yōu)選是 45 - 55mm/s，最優(yōu)選是50mm/s;所述A型肉毒毒素的單克隆抗體(由軍 事醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所提供)的濃度為0.1-10 mg/ml更優(yōu)選是0.5-2.5 mg/ml，最優(yōu)選為lmg/ml，單克隆抗體的稀釋液可以為PBS;質(zhì)控羊抗兔 IgG可以購自鼎國生物技術(shù)公司，其濃度為0.1-10 mg/ml更優(yōu)選是 0. 5-2. 5 mg/ml,最優(yōu)選為lmg/ml;
(2 )制備一種含有膠體金標(biāo)記的A型肉毒毒素單克隆抗體的玻璃纖 維膜，將膠體金標(biāo)記的A型肉毒毒素單克隆抗體均勻涂布在聚脂膜、玻 璃纖維膜或?yàn)V紙纖維膜(購自Milipore公司)上；
(3)所述A型肉毒毒素的單克隆抗體(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所提 供)穩(wěn)定膠體金的適當(dāng)抗體量為5-25ug,優(yōu)選抗體量為10-20ug,更 優(yōu)選的抗體量為12-18ug，最優(yōu)選抗體量為16. 8ug,該抗體可以用5mM本實(shí)用新型所述試紙?jiān)跈z測(cè)A型肉毒毒素中的應(yīng)用(見圖2)。首先 將標(biāo)本放入裝有稀釋液的小瓶?jī)?nèi)，將試紙"4"處(即末端處)插入瓶?jī)?nèi)， 樣品中的液體吸起上行， 一般10-15分鐘后判讀結(jié)果，試紙直至觀察完 結(jié)果后方可取出。
如果標(biāo)本中含有A型肉毒毒素抗原，則標(biāo)本中的A型肉毒毒素抗原 將與試紙上膠體金標(biāo)記的A型肉毒毒素單克隆抗體形成相應(yīng)的復(fù)合物， 液體上行并將與硝酸纖維膜上的A型肉毒毒素多克隆抗體結(jié)合，并且顯 示顏色，形成紅色線條，即在"T"處形成紅色條帶。無論是否含有相對(duì) 應(yīng)的抗原，膠體金標(biāo)記單克隆抗體繼續(xù)向上展開并與在硝酸纖維膜上的 羊抗兔IgG形成紅色沉淀線，即在"C"處形成紅色條帶。此線是質(zhì)控線， 如膠體金失效，此線就不會(huì)出現(xiàn)，說明試紙失效。陽性結(jié)果會(huì)出現(xiàn)2條 紅色沉淀線，陰性結(jié)果出現(xiàn)1條紅色沉淀線，如不出現(xiàn)線條說明試紙失 效。
在本實(shí)用新型的技術(shù)方案中，采用了純化的A型肉毒毒素多克隆抗 體和羊抗兔IgG,將兩者分別固相于硝酸纖維膜上，同時(shí)利用膠體金標(biāo)記 的A型肉毒毒素單抗，基于膜層析雙抗體夾心法的原理，從而成功地快 速簡(jiǎn)便檢測(cè)出標(biāo)本中的A型肉毒毒素。


圖IA本實(shí)用新型試紙的正面示意圖。 圖IB本實(shí)用新型試紙的側(cè)面示意圖。
圖1A和1B中，l吸水墊；2硝酸纖維膜(A:包被A型肉毒毒素多 克隆抗體條帶，C:包被羊抗兔IgG的質(zhì)控條帶)；3:含有膠體金標(biāo)記A 型肉毒毒素單克隆抗體的玻璃纖維膜；4:樣品墊；5:反應(yīng)支持物。
圖2:檢測(cè)結(jié)果示意圖；T、 C兩條線陽性；C一條線陰性；無效。
圖3:檢測(cè)結(jié)果示意圖；圖中，l.A型天然肉毒毒素50 pg/m, 2. A 型天然肉毒毒素IO ng/ml， 3 .A型天然肉毒毒素15 pg/ml， 4. PBS。
圖4:檢測(cè)結(jié)果示意圖；圖中1為A型天然肉毒毒素，2為E型天然 肉毒毒素。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本實(shí)用新型，但不用來限制本實(shí)用新型的范圍。
實(shí)施例l、 A型肉毒毒素多克隆抗體的制備
(1 )抗A型肉毒毒素多克隆抗體的制備
用純化的rBoNT/A蛋白200 jn g與等體積的福氏完全佐劑充分混勻， 首免新西蘭純種大耳白兔。兩周后用0.5 mg蛋白和等體積福氏不完全佐 劑加強(qiáng)免疫1次；隔三周后再用0. 5 mg蛋白和等體積福氏不完全佐劑加 強(qiáng)免疫l次；此后每周耳緣靜脈采血，間接ELISA測(cè)定效價(jià)。如還需再 進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每次免疫間隔兩周，最后一次免疫一周后大量采血。
心臟或頸動(dòng)脈或腹股靜脈采血后于37 。C放置l h, 4 。C過夜，使血 塊收縮。小心吸出析出的血清。在4。C下2500 g離心血塊30 min，取上 清液即血清部分與此前析出的血清混合。4 。C 1500 g離心全部分離的血 清部分。將血清分裝凍存于-70 。C。 (2 )抗rBoNT/A多克隆抗體的純化
方法利用正辛酸-硫酸銨分步沉淀法純化抗體。
具體實(shí)施例取1份血清加入4份60 mM pH 4. 0的醋酸緩沖液，用 NaOH調(diào)節(jié)pH為4. 5。以每毫升稀釋液中加入70 pl正辛酸的比例，f茲力 攪拌30 min。 4 °C10000 r/min離心30 min，棄沉淀，耳又上清液通過濾 紙過濾，加入5倍體積的PBS,調(diào)節(jié)pH為7. 4，然后置冰浴中，按照每 毫升混合液加O. 27 g碌L酸銨，繼續(xù)石茲力攪拌30 min, 9000 r/min， 4 。C 離心15min,收集沉淀物，溶于PBS中，透析至無NH4+, -70 。C保存， 并經(jīng)SDS-PAGE鑒定其純度。
實(shí)施例2、 A型肉毒毒素單克隆抗體的制備
(1)抗rBoNT/A單克隆抗體的制備
A型雜交瘤細(xì)胞均由河北省科學(xué)院生物科學(xué)研究所制備，拿到雜交瘤 細(xì)胞后，首先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)起細(xì)胞后，用間接ELISA法測(cè)定細(xì)胞培 養(yǎng)上清與天然毒素是否結(jié)合，選兩抹鑒定為陽性且細(xì)胞生長狀態(tài)良好的 雜交瘤細(xì)胞抹進(jìn)行亞克隆篩選。再選取穩(wěn)定性和效價(jià)均較高的兩抹細(xì)胞 林用以大量制備單克隆抗體。利用細(xì)胞培養(yǎng)上清來進(jìn)行單克隆抗體的亞 型鑒定，采用的是美國Roche公司Mouse Monclonal Antibody IsotypingKit。
Balb/c小鼠用石蠟油腹部注射致敏一周后，小鼠注射O. 5 ml約含l x 106個(gè)雜交瘤細(xì)胞的生理鹽水懸液。l-2周后待小鼠腹部明顯變大，精 神狀態(tài)不好時(shí)，拉頸處死取腹水。于12000 rpm離心10 min以去除油狀不 溶物，將腹水分裝凍存于-20 'C。 (2)抗rBoNT/A單克隆抗體的純化
用HiTrapTM Protein G HP和AKTAdesignTM System純化小鼠腹水。 首先，將腹水用binding buffer以適當(dāng)比例稀釋，用0.45 pm濾器過濾 后備用。用10倍^主體積的binding buffer以5 ml/min的洗速平衡5 ml的 蛋白G柱后將備用樣品上柱純化，上樣速度設(shè)為1 ml/min。此后，用binding buffer沖平直至流出液的紫外吸收值低于30即流出液中不再有蛋白。換 elution buffer進(jìn)行洗脫，從紫外吸收值高于100時(shí)開始收集，低于80時(shí) 收集完畢，收集洗脫液的試管中預(yù)先加入10%的1 M, pH 9. O的Tris-HCl, 使pH恢復(fù)至7. 0左右，以免抗體失去活性。用elution buffer沖洗柱子 至紫外吸收值低于30時(shí)改用純水沖洗l O個(gè)柱體積后，再用2 0%乙醇沖洗5 個(gè)柱體積，最終要將柱子浸泡于20%乙醇中并于4 。C保存。將純化后的單 抗用5 mM PB于磁力攪拌下4 。C透析4 h后，分裝，-70 。C保存?zhèn)溆茫?經(jīng)SDS-PAGE鑒定其純度為13. 52mg/ml。
實(shí)施例3、 A型肉毒毒素的檢測(cè)試紙
參見附圖1，反應(yīng)支持物為6. 2cm x 0. 4cmPCV板；吸水墊為2cm x 0. 4cm的濾油紙；1. 8cm x 0. 4cm的硝酸纖維膜依次包被羊抗兔IgG， A 型肉毒毒素多克隆抗體(lmg/ml，稀釋液為PBS );含有0. 4cm x 0. 4cm 膠體金標(biāo)記的A型肉毒毒素單克隆抗體(16. 8ug，用5mMPB稀釋)， 玻璃纖維膜；金標(biāo)抗體(其標(biāo)金PH為7. 5，濃度為0. 2mg/nd )保護(hù)膜為 2. 7cm x 0. 4cm的玻璃纖維；即形成了 A型肉毒毒素抗原檢測(cè)試紙。
實(shí)施例4、 A型肉M素的試紙檢測(cè)方法
參見圖2，使用A型肉毒毒素試紙的檢測(cè)方法包括 將標(biāo)本放入裝有稀釋液的小瓶?jī)?nèi)，將實(shí)施例3-5中的任一試紙"4" 處插入瓶?jī)?nèi)，樣品中的液體吸起上行，10分鐘判讀結(jié)果，直至觀察完結(jié)果后方可取出試紙
如含有A型肉毒毒素抗原，則與試紙上膠體金標(biāo)記的A型肉毒毒素 單抗形成相應(yīng)的復(fù)合物，上行與包被在硝酸纖維膜上的流A型肉毒毒素 多抗結(jié)合，形成紅色線條，即在"A"處形成紅色條帶。
無論是否含有相對(duì)應(yīng)的抗原，膠體金標(biāo)記McAb繼續(xù)向上爬行與包被 在膜上的羊抗兔IgG形成紅色沉淀線，即在"C"處形成紅色條帶。此線 是質(zhì)控線，如膠體金失效，此線就不會(huì)出現(xiàn)，說明試紙失效。 陽性結(jié)果會(huì)出現(xiàn)2條紅色沉淀線，陰性結(jié)果出現(xiàn)l條紅色沉淀線，如不出 現(xiàn)線條說明試紙失效。如若肉眼無法辨別T處紅色條帶，可利用金標(biāo)免疫 分析儀進(jìn)行半定量檢測(cè)。
實(shí)施例5、 DJM-3定量金標(biāo)免疫分析儀半定量檢測(cè)
1、 可先用檢測(cè)法檢測(cè)A型肉毒毒素試紙條20個(gè)陰性值，利用金標(biāo)儀檢 測(cè)試其T/C的比值平均計(jì)算出A型肉毒毒素試紙條的定閾值。
2、 其次利用定閾值來用金標(biāo)儀機(jī)器檢測(cè)A型肉毒毒素試紙條能達(dá)到的最 低濃度。
3、 判讀結(jié)果時(shí)大于或等于定閾值為陽性，小于定閾值為陰性。
試驗(yàn)例1、膠體金免疫層析試紙敏感性檢測(cè)
以天然肉毒毒素溶液(濃度為50 ng/ml、 10 pg/ml、 5 pg/ml )進(jìn) 行檢測(cè)，以不含肉毒毒素的PBS溶液樣品為空白對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果見附圖3。 結(jié)果顯示A型免疫層析條檢測(cè)靈敏度為5 pg/ml。
試驗(yàn)例2、膠體金免疫層析試紙?zhí)禺愋詸z測(cè)
優(yōu)化檢測(cè)帶、質(zhì)控帶蛋白濃度和膠體金探針濃度以及層析條的特征 后，以樣品稀釋液(PBS)處理A型天然肉毒毒素素使其濃度均為50 jug/ml 以進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如附圖4所示，可見檢測(cè)條對(duì)于檢測(cè)無關(guān)毒素?zé)o非特異 現(xiàn)象出現(xiàn)。
本實(shí)用新型能夠基于一份標(biāo)本和一個(gè)試紙，快速方便地檢測(cè)出標(biāo)本 中的A型肉毒毒素抗原，能夠一次性的捕獲出A型肉毒毒素，節(jié)省了大量人力物力，方便、快速、簡(jiǎn)捷，不需特殊儀器設(shè)備，不需專業(yè)培訓(xùn)， 結(jié)杲清晰易辨，操作簡(jiǎn)單，易于推廣，適合基層，適合于突發(fā)事件的大
批量現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，適合流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)A型肉毒毒素的感染診斷起到輔 助作用。
權(quán)利要求1、一種檢測(cè)試紙，其特征在于，它包含(1)反應(yīng)支持物；(2)吸水墊；(3)硝酸纖維膜，該膜包被有A型肉毒毒素多克隆抗體條帶和質(zhì)控羊抗兔IgG的條帶；(4)金標(biāo)抗體保護(hù)膜，其中含有膠體金標(biāo)記的A型肉毒毒素單克隆抗體。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙，其特征在于，它還包含樣品墊。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試紙，其特征在于，所述反應(yīng)支持物(5)位于 底層，所述硝酸纖維膜(2)位于反應(yīng)支持物(5)上的中部，該膜的T處是A 型肉毒毒素單克隆抗體包被的檢測(cè)條帶，并且C處是羊抗兔IgG包被的 質(zhì)控條帶；所述金標(biāo)抗體保護(hù)膜(3)位于硝酸纖維膜上部的一側(cè)并與之部 分重疊，該膜含有膠體金標(biāo)記的A型肉毒毒素單克隆抗體；所述吸水墊 (1)位于硝酸纖維膜(2)上部的相對(duì)于金標(biāo)抗體保護(hù)膜(3)而言的另一側(cè) 并與硝酸纖維膜(2)部分重疊；所述樣品墊(4)位于硝酸纖維膜(2)上與吸 水墊(1)相反的一側(cè)并與金標(biāo)抗體保護(hù)膜(3)部分重疊。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試紙，其特征在于，所述吸水墊一側(cè)為起始端， 所述樣品墊一側(cè)為末端，A型肉毒毒素多克隆抗體的條帶位于接近末端， 羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶接近于起始端。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種檢測(cè)試紙，它包含反應(yīng)支持物；吸水墊；硝酸纖維膜，該膜包被有A型肉毒毒素多克隆抗體條帶和質(zhì)控羊抗兔IgG的條帶；金標(biāo)抗體保護(hù)膜，其中含有含有膠體金標(biāo)記的A型肉毒毒素單克隆抗體。本實(shí)用新型試紙能夠基于一份標(biāo)本和一個(gè)試紙，快速方便地檢測(cè)出標(biāo)本中的A型肉毒毒素抗原，能夠一次性的捕獲出A型肉毒毒素，節(jié)省了大量人力物力，方便、快速、簡(jiǎn)捷，不需特殊儀器設(shè)備，不需專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易辨，操作簡(jiǎn)單，易于推廣，適合基層，適合于突發(fā)事件的大批量現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，適合流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)A型肉毒毒素的感染診斷起到輔助作用。
文檔編號(hào)G01N33/577GK201373876SQ200920105709
公開日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2009年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日
發(fā)明者孫曉紅, 張曉龍, 宇 楊, 靜 王, 王景林, 謝士嘉 申請(qǐng)人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院