專利名稱：一種檢測克倫特羅和沙丁胺醇的檢測卡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種檢測克倫特羅和沙丁胺醇的檢測卡。
背景技術(shù)：
克倫特羅(CL)與沙丁胺醇(SAL)都屬于苯乙醇胺類J3-興奮劑，臨床醫(yī)學(xué)中 主要用于擴(kuò)張支氣管和增加肺通氣量，可治療支氣管哮喘、阻塞性肺炎、平滑肌痙 攣和休克等癥，在獸醫(yī)臨床中用作牛、馬的產(chǎn)道松弛劑，如SAL用于平喘，CL作為
子宮松馳劑等。近年來，克倫特羅與沙丁胺醇作為飼料添加劑，在畜牧業(yè)非法使用 的情況越來越嚴(yán)重。
多數(shù)國家都禁止在動(dòng)物生產(chǎn)過程中使用克倫特羅與沙丁胺醇。有些國家執(zhí)行最 高殘留量(MRLs)限制，如英國規(guī)定的MRLs為0. 5ng/g，荷蘭規(guī)定的MRLs為lng/g。 我國明確規(guī)定禁止CL、 SAL及其制劑在食品動(dòng)物的飼養(yǎng)過程中使用。
目前檢測克倫特羅與沙丁胺醇的方法主要有高效液相色譜法(HPLC-UV)、氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)法(GC-UV)、液-質(zhì)聯(lián)機(jī)(LC-MS-MS)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)等。這些方 法的前處理利用液一液分配，常規(guī)的SPE柱凈化和分離，都在不同程度地存在著處 理過程繁瑣、凈化效果差、有機(jī)溶劑浪費(fèi)多、所需時(shí)間長等缺點(diǎn)。
實(shí)用新型內(nèi)容
本實(shí)用新型的目的是提供一種檢測克倫特羅和沙丁胺醇的檢測卡。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型的技術(shù)方案如下 一種檢測克倫特羅和/或沙丁
胺醇的檢測卡，其特征在于它包括底板、反應(yīng)膜、樣品墊、結(jié)合物釋放墊和吸水
墊；
沿樣品液流動(dòng)方向，底板l分為三個(gè)區(qū)域加樣區(qū)、反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)和吸水墊設(shè) 置區(qū)；反應(yīng)膜2設(shè)于反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)上；所述加樣區(qū)上，遠(yuǎn)離所述反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)處設(shè) 有樣品墊3;所述加樣區(qū)上，靠近所述反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)處設(shè)有結(jié)合物釋放墊4;所述 結(jié)合物釋放墊上包被有膠體金標(biāo)記的克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物；所述吸水墊設(shè)置
區(qū)上設(shè)有吸水墊5;所述反應(yīng)膜上設(shè)有T線6和C線7， T線包被有克倫特羅特異性
抗體，c線包被有載體蛋白抗體。
所述T線和所述C線可互相平行且與樣品液流動(dòng)方向垂直。所述T線可靠近所述結(jié)合物釋放墊，所述C線可靠近所述吸水墊。
所述檢測卡還可包括固定膜8。所述樣品墊和所述結(jié)合物釋放墊上可覆蓋有所 述固定膜，固定膜上與所述樣品墊對應(yīng)的區(qū)域設(shè)有樣品孔9。所述吸水墊上可覆蓋 有所述固定膜。所述固定膜為防水材質(zhì)的，用于固定檢測卡的各個(gè)組件，避免樣品 或試劑與外界環(huán)境中的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，影響檢測卡的檢測效果。
為了保證樣品液流動(dòng)的連續(xù)性，所述樣品墊和所述結(jié)合物釋放墊可設(shè)有2mra的 重疊區(qū)，所述結(jié)合物釋放墊和所述反應(yīng)膜可設(shè)有2mm的重疊區(qū)，所述吸水墊和所述 反應(yīng)膜可設(shè)有2mm的重疊區(qū)。
沿樣品液流動(dòng)方向，所述樣品墊的長度可為18mm，所述結(jié)合物釋放墊的長度可 為6mm，所述反應(yīng)膜的長度可為20mra，所述吸水墊的長度可為20咖。所述T線距離 所述結(jié)合物釋放墊的垂直距離可為6mm;所述C線距離所述吸水墊的垂直距離可為 6mm;所述T線和所述C線的垂直距離可為5mm。
所述反應(yīng)膜、所述樣品墊、所述結(jié)合物釋放墊和所述吸水墊可通過雙面膠固定 在所述底板上，在它們與底板之間可設(shè)有高分子材料制成的背襯膜(隔離膜)，用 以阻止粘合劑中的有機(jī)溶劑對包被蛋白和包被抗體的破壞。
所述檢測卡具體可為長80mm，寬5ram的條狀。
所述載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、 血蘭蛋白(KLH)等。
所述克倫特羅特異性抗體可為克倫特羅單克隆抗體或克倫特羅多克隆抗體。所 述載體蛋白抗體可為人血清白蛋白(HSA)多克隆抗體。
對于一個(gè)檢測卡來說，具體可用15-20 nm的膠體金標(biāo)記克倫特羅-載體蛋白偶 聯(lián)物。
所述底板可由不吸水的韌性材料制成，如硬質(zhì)塑料、不吸水硬紙，具體可為PVC 板材。所述樣品吸收墊可由玻璃纖維棉或玻璃棉制成。所述結(jié)合物釋放墊可由玻璃 纖維或玻璃棉制成。所述吸水墊可為厚濾紙、無紡布或其他吸水性材料。所述反應(yīng) 膜可為硝酸纖維素膜(NC膜)。所述保護(hù)膜可為PE材質(zhì)的保護(hù)膜。
本實(shí)用新型的檢測原理當(dāng)樣品溶液中含有克倫特羅(或沙丁胺醇)時(shí)，在擴(kuò) 散過程中，樣品中的克倫特羅(或沙丁胺醇)通過競爭結(jié)合抑制了膠體金-克倫特 羅-載體蛋白偶聯(lián)物同T線上的克倫特羅特異性抗體結(jié)合，T線無法顯色，而C線的 載體蛋白抗體可與膠體金-克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物中的載體蛋白特異結(jié)合，C線即顯示紅棕色(紫紅色)印跡。當(dāng)樣品中不含克倫特羅(或沙丁胺醇)或其含量低 于檢測卡檢測限時(shí)，膠體金-克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物可與T線上的克倫特羅特異 性抗體結(jié)合，T線顯示紅棕色(紫紅色)印跡，液體滲透到C線時(shí)，C線上的抗載
體蛋白抗體可與膠體金-克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物特異結(jié)合，C線顯示紅棕色印跡
(紫紅色)。
本實(shí)用新型的檢測克倫特羅和沙丁胺醇的檢測卡具有以下的特點(diǎn) (1)交叉反應(yīng)。檢測卡上的膠體金-克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物和克倫特羅特 異性抗體結(jié)合時(shí)具有很高的特異性，在實(shí)際檢測中，可以同時(shí)檢測克倫特羅和沙丁 胺醇藥物，其檢測檢測限見表l。
表l交叉反應(yīng)與檢測限
藥物名稱檢測限Pg/L (kg)交叉反應(yīng)
克倫特羅2100%
沙丁胺醇2100%
(2) 操作簡便，結(jié)果顯示快速。檢測過程中無需其他試劑，將待檢樣品液滴 加檢測卡上，IO分鐘即可以判定檢測結(jié)果。
(3) 對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時(shí)快速檢測大批樣
O
(4) 結(jié)果判定簡單明了。克倫特羅和沙丁胺醇檢測檢測卡以肉眼可見的紅棕 色檢測印跡作為判定標(biāo)準(zhǔn)。 一條印跡表示被檢樣品中含有克倫特羅和沙丁胺醇，兩 條印跡表示被檢樣品中不含克倫特羅和沙丁胺醇。
(5) 制備工藝簡單，成本低。
(6) 應(yīng)用價(jià)值高。檢測卡操作簡單，人人可以操作，可以判定結(jié)果陰陽性。 本實(shí)用新型具有較高的應(yīng)用價(jià)值和較大的經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益，將在食品和飼料的克
倫特羅和沙丁胺醇的檢測中發(fā)揮重要作用。

圖1為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本實(shí)用新型，但并不限定本實(shí)用新型。下述實(shí)施 例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
如圖1所示，本實(shí)用新型提供的檢測克倫特羅和/或沙丁胺醇的檢測卡，包括底板l、反應(yīng)膜2、樣品墊3、結(jié)合物釋放墊4和吸水墊5。反應(yīng)膜2、樣品墊3、 結(jié)合物釋放墊4和吸水墊5通過雙面膠固定在底板1上，在它們與底板1之間設(shè)有 高分子材料制成的背襯膜(隔離膜)，用以阻止粘合劑中的有機(jī)溶劑對包被蛋白和 包被抗體的破壞。沿樣品液流動(dòng)方向，底板分為加樣區(qū)、反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)和吸水墊設(shè) 置區(qū)。反應(yīng)膜2設(shè)于反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)上。所述加樣區(qū)上，遠(yuǎn)離所述反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)處設(shè) 有樣品墊3，靠近所述反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)處設(shè)有結(jié)合物釋放墊4。結(jié)合物釋放墊4上包 被有膠體金標(biāo)記的克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物。吸水墊設(shè)置區(qū)上設(shè)有吸水墊5。為了 保證樣品液流動(dòng)的連續(xù)性，樣品墊3和結(jié)合物釋放墊4設(shè)有2mra的重疊區(qū)，結(jié)合物 釋放墊4和反應(yīng)膜2設(shè)有2mra的重疊區(qū)，吸水墊5和反應(yīng)膜2設(shè)有2mm的重疊區(qū)。 反應(yīng)膜2上設(shè)有T線6和C線7， T線6包被有克倫特羅特異性抗體，C線7包被有 載體蛋白抗體，T線6和C線7互相平行且與樣品液流動(dòng)方向垂直，T線6靠近結(jié) 合物釋放墊4， C線7靠近吸水墊5。樣品墊3和結(jié)合物釋放墊4上覆蓋有固定膜8， 固定膜8上與樣品墊3對應(yīng)的區(qū)域設(shè)有樣品孔9。吸水墊5上覆蓋有固定膜8。固 定膜為防水材質(zhì)的，用于固定試劑盒的各個(gè)組件，避免樣品或試劑與外界環(huán)境中的 物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，影響檢測卡的檢測效果。沿樣品液流動(dòng)方向，樣品墊3的長度為 18mm，結(jié)合物釋放墊4的長度為6mm，反應(yīng)膜2的長度為20mm，吸水墊5的長度為 20隨。T線6距離所述樣品吸收區(qū)的垂直距離為6mm， C線7距離所述吸水墊設(shè)置區(qū) 的垂直距離為6mm， T線6禾Q C線7的垂直距離為5mm。
當(dāng)待測樣品為肉類時(shí)，可先用如下方法進(jìn)行處理取4g勻漿組織樣本(肉泥 /去脂肪)于離心管中，加入0.5mL去離子水，蓋緊管蓋；將裝有樣本的離心管放 入85'C水浴鍋中加熱10 min，取出離心管冷卻至室溫。
當(dāng)待測樣品為尿液時(shí)，可直接進(jìn)行檢測。
使用時(shí)，取出檢測卡，開封后平放于桌面，吸取離心管中的上清液(或待檢尿 樣上清液)逐滴加入4滴于樣品孔中；10min判斷結(jié)果，20 rain后的結(jié)果無效。 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品，卡中C線位置顯示一條紫紅色印跡；陰性樣品，卡中T/C 線顯示兩條紫紅色印跡，沒有紫紅色印跡顯示表明檢測卡已經(jīng)失效。
檢測卡中用到的材料均可采用常規(guī)方法制備，舉例如下 一、克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物
可通過戊二醛法或重氮化法將克倫特羅和載體蛋白偶聯(lián)，得到克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物。
二、 克倫特羅特異性抗體
克倫特羅特異性抗體可為克倫特羅單克隆抗體或克倫特羅多克隆抗體。
1、 可采用如下方法制備克倫特羅鼠單克隆抗體
(1) 動(dòng)物免疫程序
采用BALB/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以克倫特羅-載體蛋白為免疫原，免疫劑量為 50-100ug/只。首次免疫時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背 部皮下多點(diǎn)注射；間隔2周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加 強(qiáng)免疫一次；第四次免疫后腹腔加強(qiáng)免疫一次，腹腔加強(qiáng)免疫3天后取脾細(xì)胞。
(2) 細(xì)胞融合與克隆化
步驟(1)得到的小鼠脾細(xì)胞，按(4-8) : 1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合， 采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行 克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
(3) 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇
取處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，用凍存液制成1X106-5Xl(f個(gè)/mL的細(xì)胞懸 液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37。C水浴中 速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
(4) 單克隆抗體的制備與純化
采用體內(nèi)誘生法，將BALB/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只， 7-14天后腹腔注射步驟(3)的雜交瘤細(xì)胞5Xl()5-106個(gè)/只，7-10天后采集腹水。 經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，得到克倫特羅-載體蛋白的單克隆抗體。小瓶 分裝，-2(TC保存。
2、 可采用如下方法制備克倫特羅兔多克隆抗體
采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以克倫特羅-載體蛋白為免疫原，免疫劑量 為lmg/kg b. w.。首次免疫時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸 背部皮下多點(diǎn)注射；間隔3-4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化， 加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7-10d后采血，測 定血清抗體效價(jià)，頸動(dòng)脈放血，經(jīng)硫酸銨分級沉淀得到純化的多克隆抗體。
三、 載體蛋白抗體
載體蛋白抗體可為載體蛋白單克隆抗體或載體蛋白多克隆抗體。如可以BSA作為免疫抗原免疫動(dòng)物，得到BSA的多克隆抗體。
四、金標(biāo)蛋白
(1) 用檸檬酸三鈉法制備膠體金
在沸騰的100ml的1%氯金酸水溶液中加入2-4ml的0. 5-5%檸檬酸三鈉溶液， 獲得直徑15-20nm的膠體金。
(2) 金標(biāo)蛋白的制備
用O. lraol/L的K2C03調(diào)膠體金pH至8.5，測得最佳蛋白標(biāo)記濃度后，將待標(biāo)記 的克倫特羅-載體蛋白加入膠體金溶液中，攪拌30分鐘，加入1XBSA，繼續(xù)攪袢 15分鐘，加入O. 5%PEG8000，接著攪拌15分鐘。4°C 4000g離心15min，除去未 結(jié)合的金顆粒。然后4t: 12000g離心20分鐘，去上清，沉淀用PBS溶解，再次離 心20分鐘，獲得純化的金標(biāo)蛋白。
權(quán)利要求1、一種檢測克倫特羅和/或沙丁胺醇的檢測卡，其特征在于它包括底板、反應(yīng)膜、樣品墊、結(jié)合物釋放墊和吸水墊；沿樣品液流動(dòng)方向底板(1)分為三個(gè)區(qū)域加樣區(qū)、反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)和吸水墊設(shè)置區(qū)；反應(yīng)膜(2)設(shè)于反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)上；所述加樣區(qū)上，遠(yuǎn)離所述反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)處設(shè)有樣品墊(3)；所述加樣區(qū)上，靠近所述反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)處設(shè)有結(jié)合物釋放墊(4)；所述結(jié)合物釋放墊上包被有膠體金標(biāo)記的克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物；所述吸水墊設(shè)置區(qū)上設(shè)有吸水墊(5)；所述反應(yīng)膜上設(shè)有T線(6)和C線(7)，T線包被有克倫特羅特異性抗體，C線包被有載體蛋白抗體。
2、 如權(quán)利要求1所述的檢測卡，其特征在于所述T線和所述C線互相平行且 與樣品液流動(dòng)方向垂直；所述T線靠近所述結(jié)合物釋放墊，所述C線靠近所述吸水墊。
3、 如權(quán)利要求2所述的檢測卡，其特征在于所述檢測卡還包括固定膜(8);所述樣品墊和所述結(jié)合物釋放墊上覆蓋有所述固定膜，固定膜上與所述樣品墊對應(yīng)的區(qū)域設(shè)有樣品孔(9);所述吸水墊上覆蓋有所述固定膜。
4、 如權(quán)利要求3所述的檢測卡，其特征在于所述樣品墊和所述結(jié)合物釋放墊 有2mm的重疊區(qū)，所述結(jié)合物釋放墊和所述反應(yīng)膜有2mm的重疊區(qū)，所述吸水墊和所 述反應(yīng)膜有2mm的重疊區(qū)。
5、 如權(quán)利要求4所述的檢測卡，其特征在于沿樣品液流動(dòng)方向，所述樣品墊 的長度為18mm，所述結(jié)合物釋放墊的長度為6ram，所述反應(yīng)膜的長度為20腿，所述吸 水墊的長度為20mm。
6、 如權(quán)利要求5所述的檢測卡，其特征在于所述T線距離所述結(jié)合物釋放墊 的垂直距離為6ram;所述C線距離所述吸水墊的垂直距離為6mra;所述T線和所述C 線的垂直距離為5mm。
7、 如權(quán)利要求6所述的檢測卡，其特征在于所述反應(yīng)膜、所述樣品墊、所述 結(jié)合物釋放墊和所述吸水墊與所述底板之間設(shè)有隔離膜。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一所述的檢測卡，其特征在于所述載體蛋白為牛 血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蘭蛋白。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種檢測克倫特羅和沙丁胺醇的檢測卡。本實(shí)用新型包括底板、反應(yīng)膜、結(jié)合物釋放墊、樣品墊和吸水墊；底板(1)分為加樣區(qū)、反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)和吸水墊設(shè)置區(qū)；反應(yīng)膜(2)設(shè)于反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)上；加樣區(qū)上，遠(yuǎn)離反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)處設(shè)有樣品墊(3)，靠近反應(yīng)膜設(shè)置區(qū)處設(shè)有結(jié)合物釋放墊(4)；結(jié)合物釋放墊上包被有膠體金標(biāo)記的克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物；吸水墊設(shè)置區(qū)上設(shè)有吸水墊(5)；反應(yīng)膜上設(shè)有T線(6)和C線(7)，T線包被有克倫特羅特異性抗體，C線包被有載體蛋白抗體。本實(shí)用新型具有以下的特點(diǎn)10分鐘內(nèi)顯示結(jié)果；能同時(shí)檢測大批樣品；結(jié)果判定簡單；制備工藝簡單、成本低。本實(shí)用新型具有較高的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益。
文檔編號G01N33/566GK201429616SQ20092010888
公開日2010年3月24日 申請日期2009年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月10日
發(fā)明者史為民, 吳小平, 江海洋, 王戰(zhàn)輝 申請人:北京維德維康生物技術(shù)有限公司