專利名稱：：人α2巨球蛋白ELISA檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
：本實用新型涉及生物
技術領域：
，尤其涉及一種用于檢測人a2巨球蛋白的試劑
背景技術：
：ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實驗)是將抗原、抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用原理有機地結合起來的一種敏感性高、特異性強、重復性好的實驗診斷方法，可敏感地檢測體液中微量的特異性蛋白。在測定時，受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面包被的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法去除固相載體上的游離反應物，再依次加入酶標記的抗原或抗體及底物溶液，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。a2巨球蛋白(a2MG)由肝細胞與單核吞噬細胞系統(tǒng)合成，是血漿中分子量最大的蛋白質。正常情況下a2巨球蛋白是不會從腎小球濾過膜漏出的。當尿液中有ci2巨球蛋白出現(xiàn)，即使是微量的，也提示腎病病情進一步加重，尤其有助于腎小球病變的分析。傳統(tǒng)的對a2巨球蛋白的檢測設備或檢測方法，包括火箭電泳法、免疫散射比濁法、放射性免疫擴散法(RID)和全自動生化分析儀等，有很多弊端。其中，全自動生化分析儀，價格昂貴，一次性投資大，且靈敏度不高，對于極微量a2巨球蛋白的檢測準確度不高；火箭電泳法操作比較復雜，并且由于其是通過測量火箭峰的高度或面積來進行定量，所以誤差較大，并且穩(wěn)定性也較差，臨床使用較少；免疫散射比濁法是臨床比較普遍的檢測方法，但只能測定ug/ml以上的含量，很難檢測到尿液中微量的a2巨球蛋白，并且需要配備使用大型生化分析儀；而RID法雖然靈敏度較高，但是由于采用放射性同位素，因而不可避免地存在同位素試劑有效期短、放射性污染和操作受限等弊端。
實用新型內容本實用新型要解決的技術問題是提供一種人a2巨球蛋白ELISA檢測試劑盒，來檢測尿液中人a2巨球蛋白，特別是尿液中極微量人a2巨球蛋白的檢測，并且操作簡便、成本低。為了解決上述技術問題，本實用新型提供的技術方案是一種人a2巨球蛋白ELISA檢測試劑盒，包括酶標板，所述酶標板包括固相載體和包被層，所述固相載體為設置有多個微孔的微孔板，所述包被層附著在所述固相載體的微孔表面，所述包被層是由小鼠抗人a2巨球蛋白單克隆抗體和牛血清白蛋白依次涂布在微孔上形成的。優(yōu)選的，所述固相載體為96孔聚苯乙烯試劑板(PS)。優(yōu)選的，所述固相載體為48孔聚苯乙烯試劑板(PS)。本實用新型試劑盒的酶標板微孔上涂布了由小鼠抗人a2巨球蛋白單克隆抗體和牛血清白蛋白組成的包被層，使得本實用新型試劑盒對人a2巨球蛋白的檢測質量指標非常好，即靈敏度、特異性和準確度都較高；另外，本實用新型試劑盒還具有操作簡便，成本低，試劑穩(wěn)定，對環(huán)境污染小，試驗廢物易于處理等優(yōu)點?？傊緦嵱眯滦驮噭┖羞m用于尿液中微量人a2巨球蛋白的檢測。圖1為本實用新型人a2巨球蛋白ELISA檢測試劑盒一具體實施例酶標板結構示意圖。圖2為圖1所示酶標板剖視圖。固相載體1，固相載體上的微孔2，包被層3。具體實施方式以下結合附圖和具體實施例對本實用新型作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好的理解本實用新型并能予以實施，但所舉實施例不作為對本實用新型的限定。如圖1所示，本實用新型人a2巨球蛋白ELISA檢測試劑盒一具體實施例酶標板結構示意圖，固相載體1上有微孔2，其中固相載體1采用96孔聚苯乙烯試劑板(PS)，當然也可采用48孔聚苯乙烯試劑板(PS)或其他材料。如圖2所示，圖1所示實施例的酶標板剖視圖，包被層3附著在微孔2上。包被層是由小鼠抗人a2巨球蛋白單克隆抗體和牛血清白蛋白依次涂布在微孔上形成的。該具體實施例的試劑盒制備方法是先將作為固相載體的96孔聚苯乙烯試劑板(PS)置于紫外光下輻照2小時，使試劑板板活化；在試劑板微孔上包被一定濃度的小鼠抗人a2巨球蛋白單克隆抗體，4t:過夜，經洗板及牛血清封閉處理后制成包被好的酶標板，以備標本檢測。該具體實施例的試劑盒使用方法是依次以生物素化兔抗人a2巨球蛋白多克隆抗體，親和素化辣根過氧化物酶(HRP)作為檢測試劑A及B，以3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)及硫酸分別作為底物及終止液，完成人a2巨球蛋白(a2MG)ELISA試劑盒的使用。下面通過兩個實驗來檢測該具體實施例的試劑盒的質量指標。實驗1:應用人a2巨球蛋白ELISA試劑盒以及大型自動生化分析儀分別定量檢測人定值(15.lng/ml，36.5ng/ml，77.lng/ml)尿液標本。1、人a2巨球蛋白(a2MG)ELISA試劑盒方法操作①將試劑盒平衡至室溫。②加樣分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul，余孔分別加標準品(a2MG)或定值樣品100ul，覆膜，37t:放置2小時。標準品濃度分別為100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml，3.12ng/ml，1.56ng/ml。③棄去液體，甩干，每孔加檢測試劑A工作液100ul，覆膜，37t:放置1小時。④棄去孔內液體，洗板3次，甩干，每孔加檢測液試劑B工作液100ul，覆膜，37t:放置1小時。⑤棄去孔內液體，洗板5次，甩干。每孔加TMB溶液90ul，37。C避光顯色30分鐘。依序每孔加終止溶液50ul，用酶聯(lián)儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。2、大型自動生化分析儀檢測同一上述尿液標本按照儀器要求，上樣，運行儀器，儀器自動打出結果。3、結果見表1[0024]表l，應用人a2巨球蛋白(a2MG)ELISA試劑盒對樣本1(15.lng/ml)、樣本2(36.5ng/ml)和樣本3(77.lng/ml)的檢測結果。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>[0026]而應用生化分析儀檢測上述樣本均顯示低于檢測限，不能得出有效結果。實驗2:臨床上會有部分病人尿中a2巨球蛋白含量較高，超過該試劑盒檢測限，此時需將樣本做適當稀釋。本實驗即應用人a2巨球蛋白(a2MG)ELISA試劑盒以及大型自動生化分析儀分別定量檢測人定值(0.53ug,/ml，3.24ug/ml)尿液標本。操作方法同實驗l，但用ELISA方法進行檢測時需對標本分別進行20和100倍稀釋。結果見表2表2:應用人a2巨球蛋白ELISA試劑盒和生化儀檢測法對樣本1(0.53ug/ml)和樣本2(23.24ug/ml)進行檢測的結果。[0030]<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從表1數(shù)據可見，應用ELISA方法能夠檢測到尿液中極微量的a2巨球蛋白，并且準確度、精密度較高，檢測結果較穩(wěn)定，而生化分析儀對于尿液中微量的a2巨球蛋白檢測靈敏度不夠，不能得到有效結果。從表2數(shù)據可見，當尿液中a2巨球蛋白含量較高，超出試劑盒檢測限時，樣本需要進行稀釋，從實驗結果來看，稀釋對ELISA結果并未造成明顯影響，說明該系統(tǒng)穩(wěn)定性及回收率較高，也適用于高含量樣本的檢測，此時生化分析儀也可檢測，結果與ELISA結果沒有顯著性差異。由此可見，針對臨床患者a2巨球蛋白含量變化較大的情況，ELISA檢測方法與生化分析儀法比較，其適用范圍更廣。另夕卜，經過對人a2巨球蛋白ELISA檢測試劑盒一系列的質量指標檢測，包括靈敏度、精密度、特異性、回收率及線性測定，表明該試劑盒檢測效果好。與比濁法lug/ml的最低檢測限相比，其檢測人尿液標本時最低檢測限為0.39ng/ml，極大地提高了靈敏度；同時由于采用的是雙抗體夾心法，特異性較高；并且回收率為85110%，準確度較高；操作簡便，不需要大型自動生化分析儀。相對于放射免疫測定(RIA)技術，該試劑盒具有試劑穩(wěn)定，對環(huán)境污染小，試驗廢物易于處理等優(yōu)點。因此該試劑盒適用于尿液中微量人a2巨球蛋白的檢測，對于腎功能損傷的早期診斷有重要的臨床價值。以上所述實施例僅是為充分說明本實用新型而所舉的較佳的實施例，本實用新型的保護范圍不限于此。本
技術領域：
的技術人員在本實用新型基礎上所作的等同替代或變換，均在本實用新型的保護范圍之內。本實用新型的保護范圍以權利要求書為準。權利要求一種人α2巨球蛋白ELISA檢測試劑盒，包括酶標板，所述酶標板包括固相載體和包被層，其特征在于所述固相載體為設置有多個微孔的微孔板，所述包被層附著在所述固相載體的微孔表面，所述包被層是由小鼠抗人α2巨球蛋白單克隆抗體和牛血清白蛋白依次涂布在微孔上形成的。2.如權利要求1所述的人a2巨球蛋白ELISA檢測試劑盒，其特征在于所述固相載體為96孔聚苯乙烯試劑板。3.如權利要求1所述的人a2巨球蛋白ELISA檢測試劑盒，其特征在于所述固相載體為48孔聚苯乙烯試劑板。專利摘要本實用新型提供了一種人α2巨球蛋白ELISA檢測試劑盒，包括酶標板，其中酶標板又包括固相載體和包被層，固相載體為設置有多個微孔的微孔板，包被層附著在固相載體的微孔表面，包被層是由小鼠抗人α2巨球蛋白單克隆抗體和牛血清白蛋白依次涂布在微孔上形成的。使用本實用新型檢測人α2巨球蛋白時的靈敏度、特異性和準確度都較高；操作簡便，不需要大型自動生化分析儀。該試劑盒適用于尿液中微量人α2巨球蛋白的檢測，對于腎功能損傷的早期診斷有重要的臨床價值。文檔編號G01N33/577GK201477100SQ20092016359公開日2010年5月19日申請日期2009年7月6日優(yōu)先權日2009年7月6日發(fā)明者何峰容,李華淵,汪景,章秀波申請人:武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司