專利名稱：氨基酸與肉毒堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及氨基酸與肉毒堿定量檢測試劑盒，具體涉 及一種串聯(lián)質(zhì)譜檢測先天代謝性疾病患兒血液樣本中氨基酸與肉毒堿的試劑盒。
背景技術(shù)：
氨基酸和肉毒堿是參與人體生理代謝的重要物質(zhì)，這類物質(zhì)在人體內(nèi)正常代謝保 持一定的水平。這類物質(zhì)的濃度改變往往提示人體代謝途徑發(fā)生異常。通過檢測這些物質(zhì) 的濃度，結(jié)合臨床表現(xiàn)，幫助臨床疾病的判斷。串聯(lián)質(zhì)譜定量技術(shù)的基本原理利用同位素取代的方法，將待分析物(包括氨基 酸和肉毒堿)中的氫原子、碳原子或氮原子用氘原子或碳13原子置換，形成與待分析物分 子結(jié)構(gòu)一致而分子量相差1-9的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與樣品中的待分析物一起被送入到串 聯(lián)質(zhì)譜儀中被檢測到。被分析物的濃度與通過串聯(lián)質(zhì)譜檢測到的離子豐度成正比。而高分 辨的串聯(lián)質(zhì)譜又可以將相差1-9個(gè)質(zhì)子大小的分子區(qū)分開。根據(jù)已知濃度的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的離 子豐度和被分析物的離子豐度，就可以得到被分析物的濃度。先天代謝性疾病是由于先天代謝的酶缺乏而導(dǎo)致。這些先天代謝異常疾病通常在 出生后會(huì)有一段時(shí)間的無癥狀期，之后會(huì)出現(xiàn)急性癥狀(如嘔吐、昏迷、肝衰竭)或其它癥 狀。先天代謝性疾病種類多，缺乏特異性臨床癥狀及早期可靠的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，早期診 斷十分困難。目前尚無有效的手段進(jìn)行早期確診。串聯(lián)質(zhì)譜檢測是近幾年興起的技術(shù)，具 有準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，已廣泛用于蛋白分子結(jié)構(gòu)研究、生物小分子定性定量檢測等 諸多領(lǐng)域，在檢測與應(yīng)用領(lǐng)域是目前的研究熱點(diǎn)之一。建立快速可靠的篩查和診斷新生兒先天代謝性疾病的新方法已成為可能并被嘗
試o
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供氨基酸與肉毒堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測試劑盒，該試劑盒由氨 基酸和肉毒堿同位素標(biāo)準(zhǔn)品、衍生化溶液、萃取溶液、復(fù)溶液、流動(dòng)相、96孔反應(yīng)板、包裝盒 體、襯墊和操作說明書組成，襯墊設(shè)有容器孔，分別放置同位素標(biāo)準(zhǔn)品、衍生化溶液、萃取溶 液、復(fù)溶液和流動(dòng)相，96孔反應(yīng)板單獨(dú)排列放置。其中氨基酸和肉毒堿同位素標(biāo)準(zhǔn)品含有12種氨基酸和8種肉毒堿，衍生化溶液含 丁醇，萃取溶液含甲醇和水，復(fù)溶液含乙腈和水，流動(dòng)相含乙腈、水或甲酸。所有溶液必須用 0. 22 iim膜過濾預(yù)處理。其中氨基酸內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品為 肉毒堿內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品為 本試劑保存于2-8°C。本實(shí)用新型試劑盒使用方法一、干血片的制作新生兒在出生后喂飽母乳48小時(shí)后進(jìn)行血樣采集。用穿刺針 進(jìn)行足跟采血，滴在S&S 903濾紙片上，讓血液均勻擴(kuò)散，并在室溫下風(fēng)干4小時(shí)以上，及時(shí) 送檢，如不能及時(shí)送檢，套入有封口的塑料袋內(nèi)密封后放2-8°C冰箱保存。二、實(shí)驗(yàn)操作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)萃取工作溶液準(zhǔn)備依據(jù)本次實(shí)驗(yàn)標(biāo)本量計(jì)算內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)萃取工作溶液的量，按1 200濃度將濃縮的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)用萃取溶液稀釋，注意充分混勻。萃取用打孔器從血片上打下血斑，放入到96孔U型底微孔板相應(yīng)孔的位置，用多孔移 液器或連續(xù)移液器以90 y L/孔，加入預(yù)先配制好的含內(nèi)標(biāo)萃取溶液。封上粘性膜進(jìn)行恒溫 振蕩，溫度設(shè)定為30°C，頻率為750rpm/分鐘，振蕩30分鐘。每孔取60 y L轉(zhuǎn)移到V型96 孔微孔板對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)，放96孔氮?dú)獯蹈蓛x上進(jìn)行吹干，條件設(shè)定上部45°C，流量50L/min， 下部45°C，流量25L/min ；時(shí)間為10-15分鐘。衍生目測V型底微孔板已經(jīng)吹干，每孔加50 ii L的衍生化試劑3N-HCl-n-Butan0l。封 上熱封膜恒溫靜置，溫度設(shè)定為60°C，放置30分鐘。揭去熱封膜，放96孔氮?dú)獯蹈蓛x上進(jìn) 行吹干，條件設(shè)定上部45°C，流量50L/min，下部45°C，流量25L/min ；時(shí)間為10-15分鐘。復(fù)溶取出完全吹干的V型底微孔板，每孔加入75 y L的復(fù)溶液，用鋁膜包起，恒溫振蕩， 溫度設(shè)定為27°C，頻率為750rpm/分鐘，振蕩10分鐘。三、上機(jī)測定。四、定量結(jié)果報(bào)告根據(jù)儀器設(shè)定程序自動(dòng)得到各種氨基酸和肉毒堿的濃度。本實(shí)用新型的有益之處是該試劑盒運(yùn)用串聯(lián)質(zhì)譜方法實(shí)現(xiàn)了一次測定能對(duì)幾十 種物質(zhì)的定性和定量分析。有效地解決了以往一次測定只得到一種分析物的問題，對(duì)多種 代謝性疾病進(jìn)行聯(lián)合篩查檢測，提高了篩查檢測的效率和檢出率，為代謝性疾病的早期檢 測提供依據(jù)。

圖1為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為苯丙氨尿癥患者質(zhì)譜分析圖譜。圖3為正常人的質(zhì)譜分析圖譜。圖4為丙酸血癥患者質(zhì)譜分析圖譜。[0034]圖5為正常人的質(zhì)譜分析圖譜。圖6為楓糖尿癥患者質(zhì)譜分析圖譜。圖7為正常人的質(zhì)譜分析圖譜。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于 說明目的，而不用于限制本實(shí)用新型范圍。實(shí)施例1參見圖1，試劑盒由氨基酸和肉毒堿同位素標(biāo)準(zhǔn)品1、衍生化溶液2、萃取溶液3、復(fù) 溶液4、流動(dòng)相5、96孔反應(yīng)板6、包裝盒體7、襯墊8和操作說明書9組成，襯墊8設(shè)有容器 孔，分別放置同位素標(biāo)準(zhǔn)品1、衍生化溶液2、萃取溶液3、復(fù)溶液4和流動(dòng)相5，96孔反應(yīng)板 6單獨(dú)排列放置。本試劑盒保存于2-8°C。其中氨基酸和肉毒堿同位素標(biāo)準(zhǔn)品含有12種氨基酸和8種肉毒堿，衍生化溶液含 丁醇，萃取溶液含甲醇和水，復(fù)溶液含乙腈和水，流動(dòng)相含乙腈、水或甲酸。所有溶液必須用 0. 22 iim膜過濾預(yù)處理。氨基酸內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品為 肉毒堿內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品為 實(shí)施例2應(yīng)用實(shí)施例1試劑盒對(duì)5000余例新生兒血樣標(biāo)本進(jìn)行檢測。累計(jì)檢測出苯丙酮 尿癥患兒4例，丙酸血癥患兒2例，楓糖尿癥患兒2例。苯丙酮尿癥患兒及正常人的質(zhì)譜分 析圖譜結(jié)果分別參見圖2、3，丙酸血癥患兒及正常人的質(zhì)譜分析圖譜結(jié)果分別參見圖4、5， 楓糖尿癥患兒及正常人的質(zhì)譜分析圖譜結(jié)果分別參見圖6、7。試劑材料實(shí)施例1所描述試劑盒(960T)；標(biāo)本全省收集的新生兒血斑；檢測方法1.按1 :200濃度將濃縮的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)用萃取溶液稀釋；2.用打孔器從血片上打下血斑，放入到96孔U型底微孔板相應(yīng)孔的位置，用多孔 移液器或連續(xù)移液器以90 u L/孔，加入預(yù)先配制好的含內(nèi)標(biāo)萃取溶液。封上粘性膜進(jìn)行恒 溫振蕩，溫度設(shè)定為30°C，頻率為750rpm/分鐘，振蕩30分鐘。每孔取60 y L轉(zhuǎn)移到V型 96孔微孔板對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)，放96孔氮?dú)獯蹈蓛x上進(jìn)行吹干，條件設(shè)定上部45°C，流量50L/ min，下部45°C，流量25L/min ；時(shí)間為10-15分鐘；3.目測V型底微孔板已經(jīng)吹干，每孔加50 ii L的衍生化試劑3N-HCl-n-Butan0l。 封上熱封膜恒溫靜置，溫度設(shè)定為60°C，放置30分鐘。揭去熱封膜，放96孔氮?dú)獯蹈蓛x上 進(jìn)行吹干，條件設(shè)定上部45°C，流量50L/min，下部45°C，流量25L/min ；時(shí)間為10-15分 鐘；4.取出完全吹干的V型底微孔板，每孔加入75 y L的復(fù)溶液，用鋁膜包起，恒溫振 蕩，溫度設(shè)定為27°C，頻率為750rpm/分鐘，振蕩10分鐘；5.上機(jī)測定，根據(jù)儀器設(shè)定程序自動(dòng)得到各種氨基酸和肉毒堿的濃度。[0055]圖2和圖3中，代表苯丙氨酸的峰與代表苯丙氨酸內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的峰分別表示的是樣 本中的苯丙氨酸和苯丙氨酸內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的離子豐度，與他們的濃度成正比。在正常人圖譜中， 樣本的苯丙氨酸與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品相比其濃度低，在正常范圍內(nèi)；在本丙酮尿癥患者的圖譜中，樣 本的苯丙氨酸與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品相比其濃度高出很多，超出正常范圍。本實(shí)用新型是結(jié)合試劑盒進(jìn)行描述的，然而在閱讀了本實(shí)用新型的上述內(nèi)容后， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本實(shí)用新型作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附 權(quán)利要求書所限定的范圍。
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權(quán)利要求一種氨基酸與肉毒堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測試劑盒，其特征是由氨基酸和肉毒堿同位素標(biāo)準(zhǔn)品(1)、衍生化溶液(2)、萃取溶液(3)、復(fù)溶液(4)、流動(dòng)相(5)、96孔反應(yīng)板(6)、包裝盒體(7)、襯墊(8)和操作說明書(9)組成，襯墊(8)設(shè)有容器孔，分別放置同位素標(biāo)準(zhǔn)品(1)、衍生化溶液(2)、萃取溶液(3)、復(fù)溶液(4)、流動(dòng)相(5)，96孔反應(yīng)板(6)單獨(dú)排列放置。
專利摘要本實(shí)用新型一種提供氨基酸與肉毒堿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測試劑盒，由氨基酸和肉毒堿同位素標(biāo)準(zhǔn)品、衍生化溶液、萃取溶液、復(fù)溶液、流動(dòng)相、96孔反應(yīng)板、包裝盒體、襯墊和操作說明書組成，襯墊設(shè)有容器孔，分別放置同位素標(biāo)準(zhǔn)品、衍生化溶液、萃取溶液、復(fù)溶液、流動(dòng)相，96孔反應(yīng)板單獨(dú)排列放置。本實(shí)用新型的試劑盒運(yùn)用串聯(lián)質(zhì)譜方法實(shí)現(xiàn)一次測定能對(duì)幾十種物質(zhì)的定性和定量分析。有效地解決了以往一次測定只得到一種分析物的問題，對(duì)多種代謝性疾病進(jìn)行聯(lián)合篩查檢測，提高了篩查檢測的效率和檢出率，為代謝性疾病的早期檢測提供依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK201607442SQ20092029469
公開日2010年10月13日 申請日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者尚世強(qiáng), 趙正言, 黃成剛 申請人:浙江大學(xué)