專利名稱：基于倏逝照明和熒光的分子診斷系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及照明檢測系統(tǒng)和方法，特別是在分子診斷領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
檢測系統(tǒng)中使用的照明的一個實例是熒光，并且使用熒光檢測的實例是在核酸測 試(NAT)中。這是用于檢測疾病的遺傳傾向的分子診斷中的核心要素，其用于確定RNA表 達水平或者識別造成感染的病原體(比如細菌和病毒)。熒光的檢測可以用于定性確定特定靶DNA樣本的存在性并且用于定量確定樣本 中存在的DNA的量。本發(fā)明涉及用來檢測熒光的設(shè)備以及使用方法。在典型的分子診斷實驗中，對生物樣本(bio-sample)進行篩選(screen)以便檢 測特定生物成分(“靶”)，例如基因或蛋白質(zhì)。這通過檢測靶到捕獲探針的選擇性結(jié)合(稱 為雜化)的發(fā)生來完成，所述捕獲探針附接到固體表面。雜化步驟之后典型地為其中所有 未結(jié)合的靶分子被沖走的清洗步驟，并且最后執(zhí)行檢測步驟。所述檢測基于附接到靶分子的熒光標記的熒光檢測。熒光檢測需要非常靈敏且是 表面特定的，以便最小化生物背景。理想地，熒光檢測需要能夠進行單熒光標記檢測，同時 該過程保持時間有效。在不久的將來，所述檢測需要在醫(yī)院或者被設(shè)置用于診斷的實驗室之外執(zhí)行。這 要求設(shè)備能夠在相對較短的時間內(nèi)進行靈敏的測量。生物傳感器中熒光檢測的缺陷之一是該生物背景信號。在典型的實驗中，需要檢 測結(jié)合到表面的分子的熒光。然而，表面鄰近的生物成分可能產(chǎn)生大的背景信號。因此，需 要相對較長的測量時間以便補償背景。減輕該問題的一種標準方法是使用共焦濾波，使得 來自小體積的激發(fā)被成像到使用的檢測器上。然而，使用共焦光學系統(tǒng)的問題同樣是檢測過程的長度，因為點聚焦(spot focus)需要跨樣本的感興趣區(qū)域掃描以便確?？煽啃院挽`敏性。該問題的一種提出的解決方案是執(zhí)行線掃描熒光檢測。焦線跨樣本掃描，從而可 以縮減檢測時間。然而，共焦濾波在沿著激發(fā)線的軸的方向上不是最佳的。這具有以下直 接結(jié)果檢測的表面熒光受相對較大的背景信號影響并且靈敏度降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用在醫(yī)護點診斷中的分析系統(tǒng)和方法，其中可以實現(xiàn)高 的測量速度，而沒有靈敏度和/或表面特異性的重大損失。本發(fā)明由獨立權(quán)利要求限定。從屬權(quán)利要求限定了有利的實施例。依照本發(fā)明，提供了 一種照明檢測系統(tǒng)。利用依照本發(fā)明的系統(tǒng)，允許在不遭受靈敏度的損失的情況下實現(xiàn)增大速度的線 掃描檢測的強度。線聚焦用于增大的掃描速度使得線方向上的共焦性降低。因此，這種類 型的檢測的靈敏度降低。為了補償該效應(yīng)，并入了倏逝激發(fā)。利用倏逝激發(fā)給出增強的表面特異性，從而實現(xiàn)檢測的靈敏度增強。本發(fā)明因而組合了線掃描(縮減分析時間)和倏 逝激發(fā)(降低背景信號)的優(yōu)點。這允許實現(xiàn)以上概述的醫(yī)護點診斷應(yīng)用。關(guān)聯(lián)的輻射處理裝置優(yōu)選地包括用于產(chǎn)生環(huán)形束形狀的束定形變換器。該環(huán)形束 形狀可以用來利用激發(fā)輻射產(chǎn)生樣本的倏逝激發(fā)。特別地，當聚焦束時，如果光具有超過臨 界角的到樣本的入射角，那么將在樣本中存在全內(nèi)反射，并且只有近場倏逝光將進入樣本 以激發(fā)樣本。束定形元件可以例如從激發(fā)輻射源的輸出的平面平行圓形截面波前產(chǎn)生環(huán)形 束形狀。然而，所述截面不必是圓形的，并且可以是例如橢圓形、矩形或者甚至正方形。事實 上，如下文進一步闡述的，只要滿足臨界角要求以便獲得倏逝激發(fā)，那么任何形狀都可以。關(guān)聯(lián)的輻射處理裝置優(yōu)選地還包括用于從環(huán)形束產(chǎn)生束形狀的線形成元件，所述 束形狀由聚焦裝置映射到激發(fā)線。這提供了允許僅在一個方向上掃描以便實現(xiàn)2D樣本區(qū) 域上的掃描的線照明。該線形成元件可以例如包括圓柱透鏡或相位板。輻射收集裝置優(yōu)選地用于收集來自樣本的發(fā)光輻射，即熒光輻射和/或磷光輻 射。優(yōu)選地，使用熒光輻射檢測，因為這是最靈敏的并且基于即時過程。所述系統(tǒng)可以用來分析可以被激發(fā)的任何樣本。這樣的樣本包括為固體、液體或 氣體的所有種類的材料，如果它們附接到表面的話。優(yōu)選地，樣本包括部位或腔室形式的分 析表面，所述部位或腔室可以攜帶或包含待分析的化學物質(zhì)。這樣的腔室可以是所有體積 的反應(yīng)容器。優(yōu)選地，所述系統(tǒng)包括寡或多核苷酸(例如DNA或RNA)分析系統(tǒng)。這樣的系 統(tǒng)包括基于這樣的材料的復制的系統(tǒng)并且包括例如聚合酶鏈反應(yīng)復制或者其他復制技術(shù)。所述聚焦裝置和輻射收集裝置可以共享激發(fā)/收集透鏡。這簡化了所述系統(tǒng)，鑒 于穩(wěn)定性以及醫(yī)院外的現(xiàn)場使用，這是所希望的。制造成本也將降低。依照本發(fā)明，還提供了一種使用照明檢測系統(tǒng)測量來自樣本的分析輻射的方法。 該方法尤其提供了上面關(guān)于所述設(shè)備解釋的優(yōu)點。


現(xiàn)在，將參照附圖詳細地描述本發(fā)明的實例，在附圖中圖1用來說明倏逝激發(fā)的原理；圖2示出了本發(fā)明的分析設(shè)備；圖3示出了光如何被定形以便產(chǎn)生倏逝場；圖4示出了用在圖2的系統(tǒng)中的束定形裝置的第一實例；以及圖5示出了用在圖2的系統(tǒng)中的束定形裝置的第二實例。
具體實施例方式本發(fā)明涉及一種輻射分析設(shè)備和方法，其將線掃描檢測與倏逝激發(fā)組合。利用倏 逝激發(fā)給出增強的表面特異性，從而實現(xiàn)熒光檢測的靈敏度增強，并且這使得更高速度的 線掃描方法能夠被采用。首先，將參照圖1解釋倏逝激發(fā)的原理。在該實例中，輻射是光學輻射或光。檢測 的輻射是熒光輻射。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當知道，也可以使用諸如UV輻射之類的其他類型的 輻射。激光器形式的輻射激發(fā)源用來提供激光束10，該激光束從高折射率介質(zhì)nl (例如玻璃)聚焦到低折射率介質(zhì)n2(例如水)。對于小于臨界角θ 0的角度而言，光將透射進入 介質(zhì)η2。然而，束定形裝置12可以用來阻擋入射束的中心部分，使得沒有光透射進入介質(zhì) η2。這消除了介質(zhì)η2的大部分激發(fā)。對于大于臨界角θ 0的角度而言，在所述兩種介質(zhì)之 間的界面處發(fā)生全內(nèi)反射，并且倏逝波可以傳播到低折射率介質(zhì)η2中，其具有作為傳播距 離(ζ)的函數(shù)的衰減的場幅度I (Ζ，θ 1)。由于該倏逝波在ζ方向上迅速衰減，因而它可以 用來探測僅僅那些在具有nl和n2的層之間的界面的表面附近存在的實體或分子。當利用(短波長)激光激發(fā)時，熒光分子將開始在所有方向上輻射光。熒光的波 長將長于激發(fā)波長。該實例配置中的束定形裝置可以是中心二向色掩模，其被設(shè)置成對于熒光波長是 透明的，從而最大化收集效率。圖2示出了本發(fā)明實例的熒光掃描儀的基本部件。待研究的樣本14由襯底 (substrate) 16限制在給定體積中，從而形成微流體部分。透鏡包括如下面解釋的浸沒流體 17。諸如激光器之類的源產(chǎn)生的激發(fā)光10用來激發(fā)熒光。光由光學裝置處理，該光學裝置 在這個實例中包括束變換元件18和線形成元件20 (圓柱透鏡或相位板)。處理的激發(fā)光由二向色鏡22定向到樣本，但是可以使用分束器。激發(fā)光隨后借助于激發(fā)透鏡26聚焦到樣本中，所述激發(fā)透鏡可以相對于樣本移 動。誘導的熒光(作為提供到樣本中的倏逝激發(fā)光的結(jié)果)由收集透鏡收集并且定向 到檢測器28，所述收集透鏡在這個實例中是與激發(fā)透鏡26相同的部件。任何反射的激光(全內(nèi)反射的光)由二向色鏡或分束器22再次反射，而熒光亮度 穿過該鏡/分束器。帶通濾波器30提供進一步的濾波以便阻止激發(fā)光，并且該濾波的光由將樣本成 像到檢測器28上的成像透鏡32聚焦到檢測器28上?？梢允褂迷S多不同類型的檢測器，例 如光子倍增管和雪崩光電二極管檢測器。可以使用像素化檢測器。圖2示出了穿過束定形元件18之前(32)和之后(34)的激發(fā)光的強度剖面 (profile) 0激發(fā)光的強度剖面從圓形平面平行波前變換到環(huán)形截面。光環(huán)的尺寸與透鏡 26的物理尺寸匹配，使得光在穿過透鏡26之后在生物樣本介質(zhì)14中變成倏逝的。光由整個光學系統(tǒng)聚焦到襯底/生物樣本表面上。線形成元件20 (圓柱透鏡/相位板)通過干擾波前在一個方向(例如圓柱透鏡的 作用方向)上的傳播從小的斑點改變光聚焦。透鏡26的焦平面內(nèi)的原始斑點于是變成線。 該線在一個方向上是衍射受限的并且其長度通過圓柱透鏡/相位板20產(chǎn)生的發(fā)散/會聚給出。對于圓柱透鏡的實例而言，環(huán)形圈(annular ring)在等于圓柱透鏡的焦距的距離 處變換成線。在該透鏡與焦距之間，光截面的形狀連續(xù)地從環(huán)形圈通過橢圓環(huán)過渡到線。圓 柱透鏡具有比從圓柱透鏡20到聚焦透鏡26的距離長得多的焦距。因此，當進入聚焦透鏡 時，束的形狀是稍微橢圓的環(huán)形圈。將希望的線寬(其由聚焦透鏡產(chǎn)生)作為參數(shù)，可以計算圓柱透鏡的強度(焦距) 以及隱含地由其引入的角偏差。該偏差例如僅僅大約幾度。因此，圓柱透鏡用作線形成元件，但是光學信號在線形成之前被(聚焦透鏡)進一步處理。聚焦透鏡的輸出是聚焦在樣本表面處的線。線的使用允許僅僅在一個方向上掃描以便覆蓋樣本的二維區(qū)域。該線可以例如具 有大約100微米的長度以及大約0. 7微米的衍射極限寬度。檢測時間可以縮減和/或掃描 速度可以降低。當樣本運動時，掃描速度的降低是特別希望的，因為關(guān)聯(lián)的加速可能干擾樣 本的微流體性質(zhì)。在圖2示出的實施例中，圓柱透鏡/相位板20置于二向色鏡22與變換激發(fā)束的 光學元件18之間。在實踐中，圓柱透鏡/相位板可以改為置于二向色鏡22與透鏡26之間 或者光學元件18之前。束變換器18也可以置于不同的位置。然而，它優(yōu)選地置于二向色 分束器的上游，因為在這種情況下，產(chǎn)生的熒光可以被收集而不受束變換器影響。激發(fā)線的光場在生物樣本介質(zhì)中是倏逝的，同時緊緊聚焦到襯底/生物樣本表面 上。結(jié)果，它僅僅選擇性地激發(fā)襯底/生物樣本表面上的熒光團。反射的激發(fā)光(來自襯底/生物樣本表面)可以用于聚焦和/或跟蹤反饋環(huán)。該 二次光路在圖2中未示出，并且將不詳加描述，因為常規(guī)的用于激發(fā)/收集透鏡26的主動 聚焦和跟蹤裝置可以與組合主動聚焦/跟蹤的本發(fā)明的倏逝線激發(fā)的使用組合使用。圓柱透鏡20的強度或者相位板產(chǎn)生的波前失真優(yōu)選地是有限的，使得線的側(cè)向 延伸處于透鏡的場內(nèi)，即波前失真保持在希望的值以下。為了創(chuàng)建倏逝激發(fā)場，優(yōu)選地使用浸沒透鏡(immersion lens)?？梢允褂靡卜Q為 “近場”的固體浸沒類型透鏡，或者液體浸沒類型。在襯底/生物樣本界面處獲得倏逝場的條件由下式給出
權(quán)利要求
一種照明檢測系統(tǒng)，包括激發(fā)輻射源和關(guān)聯(lián)的輻射處理裝置(18，20)，其用于提供激發(fā)輻射；聚焦裝置(26)，其用于將激發(fā)輻射聚焦到樣本(14)的分析區(qū)域上；輻射收集裝置(26)，其用于收集來自樣本的分析區(qū)域且由所述激發(fā)產(chǎn)生的分析輻射；以及檢測器(28)，其用于檢測收集的分析輻射，其中聚焦的激發(fā)輻射包括激發(fā)線，該激發(fā)線在樣本中是倏逝的。
2.如權(quán)利要求1所述的照明檢測系統(tǒng)，其中輻射處理裝置(18，20)包括用于產(chǎn)生環(huán)形 束形狀(34)的束定形元件(18)。
3.如權(quán)利要求2所述的照明檢測系統(tǒng)，其中束定形元件(18)從激發(fā)輻射源的輸出的平 面平行圓形截面波前(32)產(chǎn)生環(huán)形束形狀(34)。
4.如權(quán)利要求2或3所述的照明檢測系統(tǒng)，其中輻射處理裝置(18，20)包括用于從環(huán) 形束產(chǎn)生束形狀的線形成元件(20)，所述束形狀由聚焦裝置映射到激發(fā)線。
5.如權(quán)利要求4所述的照明檢測系統(tǒng)，其中線形成元件(20)具有比線形成元件(20) 與聚焦裝置(26)之間的距離更長的焦距。
6.如權(quán)利要求4或5所述的照明檢測系統(tǒng)，其中線形成元件(20)包括圓柱透鏡或相位板。
7.如前面任一權(quán)利要求所述的照明檢測系統(tǒng)，其中輻射收集裝置(26)用于收集發(fā)光 輻射形式的分析輻射。
8.如前面任一權(quán)利要求所述的照明檢測系統(tǒng)，包括生物成分篩選系統(tǒng)。
9.如前面任一權(quán)利要求所述的照明檢測系統(tǒng)，其中聚焦裝置(26)和輻射收集裝置 (26)共享激發(fā)/收集透鏡(26)。
10.如前面任一權(quán)利要求所述的照明檢測系統(tǒng)，其中檢測器(28)包括像素化光檢測ο
11.一種使用照明檢測系統(tǒng)測量來自樣本的分析輻射的方法，包括 產(chǎn)生激發(fā)輻射；處理該激發(fā)輻射；將處理的激發(fā)輻射聚焦，從而在樣本的分析區(qū)域處提供在樣本中倏逝的激發(fā)線； 收集來自分析區(qū)域的由所述激發(fā)產(chǎn)生的分析輻射；以及 檢測收集的分析輻射。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中收集分析輻射包括收集來自樣本的發(fā)光輻射。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，包括生物成分篩選方法。
14.如權(quán)利要求11-13中任何一項所述的方法，其中所述激發(fā)輻射處理包括從激發(fā)輻 射源的輸出的平面平行圓形截面波前產(chǎn)生環(huán)形束形狀。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述激發(fā)輻射處理包括使用線形成元件從環(huán)形束 產(chǎn)生束形狀，該束形狀由聚焦裝置映射到激發(fā)線。
全文摘要
一種照明檢測系統(tǒng)包括激發(fā)輻射源和關(guān)聯(lián)的輻射處理裝置以及用于將來自輻射處理裝置的激發(fā)輻射聚焦到樣本的分析區(qū)域上的聚焦裝置。輻射收集裝置收集來自樣本的分析區(qū)域的由所述激發(fā)產(chǎn)生的輻射，并且檢測器檢測收集的輻射。聚焦的激發(fā)輻射包括激發(fā)線，該激發(fā)線在樣本中是倏逝的。這組合了線掃描(縮減分析時間)和倏逝激發(fā)(降低背景信號)的優(yōu)點并且于是允許提高醫(yī)護點應(yīng)用的測量速度和精度。
文檔編號G01N21/55GK101939635SQ200980104107
公開日2011年1月5日 申請日期2009年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月4日
發(fā)明者D·J·W·克倫德, M·I·博姆法, M·M·J·W·范赫彭 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司