專利名稱：生物靶標的免疫磁性捕獲和成像的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般地涉及檢測生物分析物例如細胞、孢子(spore)或細菌。更特別地，本 發(fā)明涉及免疫磁性分離以及熒光檢測這樣的生物分析物，其可以廣泛的濃度范圍存在，并 且可位于復雜的生物或環(huán)境樣品基質中。B.相關領域的描述對生物細胞進行研究、表征和統(tǒng)計總是依賴于成像工具的使用，其允許對肉眼無 法直接看到的事物進行觀察。自從1665年羅伯特虎克(The Cell-A molecular approach ； Geoffrey Μ. Cooper. ASM Press. 1997)首次報道了對細胞的科學觀察，顯微術領域便成就 了細胞生物學領域。從基礎的早期明視場光學顯微鏡到最近的掃描電子顯微鏡，細胞生物 學家們利用了這些技術日益提高的放大倍率和分辨力。如今，這些功能強大的顯微鏡與數 字成像的整合更加擴大了這一領域的范圍?，F在，顯微術可與功能強大的圖像處理技術結 合，以用于快速且自動化地分析多種樣品。盡管顯微鏡的成像能力已經過幾個世紀的發(fā)展，然而樣品制備通常仍是成像前單 獨進行的工作。通常，將樣品中的目的靶標元件(細胞的細胞核或細胞的膜等)進行染色 或著色，以使其能夠進行觀察。尚沒有整合的設備可分析所需的所有步驟，例如樣本制備、 靶細胞成像和表征，以及然后在樣品分析后成像腔室的再生。顯微鏡玻璃載玻片和蓋玻片 由于使用簡便且成本低廉仍被廣泛用于承載樣品。許多芯片式實驗室(lab-on-a-chip)技 術使用某種形式的顯微術(明視場或熒光顯微術)和成像方法作為檢測器；但常常缺少緊 湊型成像腔室的整合性。在這方面，許多芯片式實驗室裝置仍處于其起步階段。掃描電子 顯微鏡(SEM)儀器同樣缺乏樣品制備自動化，每個樣品均需要在分析前單獨地裝載到樣品 臺上并用金屬包被。因此，顯微術系統(tǒng)通量較低。樣品制備、將樣品置于焦平面上以及定位 于目的區(qū)域仍然是耗時費力的工作。對細胞(大小、形狀)進行表征以及對細胞表面標志物進行表征可通過流式細胞 術來實現。20世紀70年代末以來，流式細胞術已協(xié)助科學家實現對多種細胞類型的分析， 并較之其它基于細胞的技術提供了諸多優(yōu)勢，包括速度、細胞生存力和細胞功能的保持以 及同時測量多個細胞參數。流式細胞術的吸引人之處在于熒光技術的靈活性和靈敏度，以及該技術的 高速性和強大的數據整合能力。流式細胞術是目前分選和分析細胞的黃金標準方 法(Bioinformatics Market Research 2006Report#06_030 “ influencing brand preference in the flow cytometry market")。盡管流式細胞儀改善了細胞分析的通 量，然而它們價格昂貴而且操作技術復雜。即使最便宜的流式細胞儀型號其價格也超過10 萬美元，而更高端型號的價格則超過30萬美元。此外，流式細胞儀需要訓練有素的操作人 員，并且他們對光學校準中的偏移非常敏感。因此，這些儀器的整個購買和操作成本使許多實驗室無法承受，特別是那些位于資源匱乏國家的實驗室。另外，流動系統(tǒng)通常被設計為一 次測量單個顆粒，因此收集多個顆粒的圖像需要更長的時間。發(fā)明概述在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于固定和檢測樣品中生物靶標的方法，其包 括(a)將樣品與磁性捕獲劑相接觸，所述磁性捕獲劑針對可能存在于樣品中的生物靶標上 的特定表位具有特異性親和力；(b)將所述樣品與第一標記試劑相接觸，所述第一標記試 劑針對所述生物靶標上的特定表位具有特異性親和力；(C)將樣品等分試樣引入腔室中； (d)向所述腔室施加磁場以吸引磁性捕獲劑至腔室表面；(e)對通過與磁性捕獲劑結合而 被固定在腔室表面上并通過與標記試劑結合而被標記的生物靶標進行檢測和計數；以及 (f)對經固定且經標記的生物靶標進行檢測和計數。在一些實施方案中，所述方法還包括確 定是否有統(tǒng)計學顯著數目的經標記生物靶標被固定于腔室表面上，以及將另外一份或多份 樣品引入腔室中直至有統(tǒng)計學顯著數目的經標記生物靶標被固定于腔室表面上。在一些實 施方案中，所述方法還包括確定固定于腔室表面上的經標記生物靶標的數目是否超過最大 閾值，如果超過最大閾值的話，則清洗成像腔室并向腔室引入一份或多份更小的樣品等分 試樣直至固定于腔室表面上的經標記生物靶標的數目為統(tǒng)計學顯著的同時低于最大閾值。 在一些實施方案中，所述方法還包括記錄所檢測生物靶標的數目。所述磁性捕獲劑和標記試劑可以對同一表位或不同表位具有特異性親和力?？梢?在將樣品弓I入腔室之前或者在將樣品弓I入腔室之后使樣品與磁性捕獲劑接觸?？梢栽趯?品引入腔室之前或者在將樣品引入腔室之后使樣品與標記試劑接觸。在本發(fā)明的某些方 面中，可以將樣品與另外的磁性捕獲劑(例如，針對與第一捕獲劑不同的表位具有特異性 親和力的第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第二十、第五十或更多的磁 性捕獲劑)接觸。所述不同的表位可位于所述第一捕獲劑所識別之表位的同一生物靶標 上，或者可位于不同的生物靶標上。在本發(fā)明的一些方面中，可以將樣品與另外的標記試劑 (例如，針對生物靶標上的特定表位具有特異性親和力的第二、第三、第四、第五、第六、第 七、第八、第九、第十或更多標記試劑)接觸，其中所述另外的標記試劑通過不同于所述第 一標記試劑之標記物的標記物進行標記。在一些實施方案中，所述第一標記試劑與所述第 二、第三、第四、第五等標記試劑針對存在于不同生物靶標群上的不同表位具有特異性親和 力。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了用于固定和檢測樣本中一個或多個生物靶標群 和/或亞群的方法，其包括(a)將樣品與磁性捕獲劑相接觸，所述磁性捕獲劑針對可能存 在于樣品中的生物靶標群上的特定表位具有特異性親和力；(b)將所述樣品與第一標記試 劑相接觸，所述第一標記試劑針對所述生物靶標群上的特定表位具有特異性親和力；(C) 將所述樣品與第二標記試劑相接觸，所述第二標記試劑針對生物靶標群中第一生物靶標亞 群上的特定表位具有特異性親和力；(d)將所述樣品與第三標記試劑相接觸，所述第三標 記試劑針對生物靶標群中第二生物靶標亞群上的特定表位具有特異性親和力；(e)將樣品 等分試樣引入腔室中；(f)向所述腔室施加磁場以吸引磁性捕獲劑至腔室表面；(g)對通過 與磁性捕獲劑結合而被固定在腔室表面上并通過與所述第一標記試劑結合而被標記的生 物靶標進行檢測和計數；(h)對用所述第一、第二和第三標記試劑之每一種標記的經固定 生物靶標進行檢測和計數。在一些實施方案中，所述方法還包括確定是否有統(tǒng)計學顯著數目的經標記生物靶標被固定于腔室表面上，以及將另外一份或多份樣品引入腔室中直至有 統(tǒng)計學顯著數目的經標記生物靶標被固定于腔室表面上。在一些方面中，所述方法還包括將所檢測出的生物靶標數與樣品中的生物靶標數 建立關聯。這種關聯可包括例如確定樣品中生物靶標的濃度和/或確定樣品中生物靶標的 總數。當測定兩種或更多種不同的生物靶標時，所述方法還可包括確定生物靶標之第一群 或亞群與生物靶標之第二群或亞群的比值。所述方法還可包括計算第一生物靶標亞群在生 物靶標群中的百分比。所述方法還可包括計算第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第 九、第十或更多細胞亞群在細胞群中的百分比。在一些實施方案中，所述方法還包括在成像腔室中檢測和計數生物靶標之前的清 洗步驟，以除去未被磁場固定的樣品組分。所述清洗步驟可以在樣品加載過程中每次檢測 和計數之前進行，也可以僅在最后的檢測和計數步驟之前進行。所述生物靶標可以是任何感興趣的生物靶標。在一些特定的實施方案中，所述生 物靶標是細胞。所述細胞可以是例如真核細胞或原核細胞。真核細胞包括但不限于哺乳動 物細胞、魚類細胞、兩棲動物細胞、鳥類細胞、爬行動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞或真菌細 胞。在本發(fā)明的一些方面中，所述細胞是淋巴細胞、白細胞或單核細胞。所述原核細胞可以 是例如細菌細胞或細菌芽孢，或本領域技術人員已知的任何其它生物分析物。當所述生物 靶標是細胞時，被捕獲劑和標記試劑所檢測的表位優(yōu)選是位于細胞表面上的表位。例如，如 果生物靶標是T細胞，則表位可以是⑶3、⑶4、⑶8、⑶45、⑶38和/或⑶70中的一種或多 種。所述生物靶標可以存在于樣品中。樣品可以是含有細胞或懷疑含有細胞的任何組 合物。在本發(fā)明的一些方面中，所述樣品可以是從對象(例如人)獲得的體液(包括但不 限于全血、血清、唾液、尿液、精液)。在本發(fā)明的一些方面中，所述對象患有或懷疑患有疾 病。例如，所述對象可能患有由細菌或病毒感染引起的疾病。在一個實施方案中，所述對象 已被或懷疑被HIV感染。在本發(fā)明的另一些方面中，所述樣品是環(huán)境樣品，例如土壤、水或 空氣樣品，或者是在人周圍發(fā)現的其它物質。所述捕獲劑可以是抗體、適配體(aptamer)、核酸探針(例如但不限于DNA或 RNA)、蛋白質或者與目的生物靶標特異性結合的任何其它天然或合成的分子。所述捕獲劑 通過與磁性顆粒偶聯而具有磁性響應。例如，所述捕獲劑可與羧基官能化的磁性顆粒偶聯。 所述磁性顆?？梢允谴判缘?、順磁性的或超順磁性的。可在生物靶標周圍使用多單位的捕 獲劑，從而產生能被設備之磁場吸引的磁性復合物。所述捕獲劑策略可包括捕獲大于目的 生物靶標群的生物靶標群。所述標記試劑可以是抗體、適配體、核酸探針(例如但不限于DNA或RNA)、蛋白質 或者與目的靶標分析物特異性結合的任何其它天然或合成的分子。所述標記試劑可被檢測 設備所檢測到，因為它們與報告分子(例如熒光分子或本領域已知的其它生物標記物)相 偶聯。被捕獲劑和磁場捕獲的某些生物靶標不必要由任意標記試劑所顯示。標記試劑(也可稱為“報告物”)是輔助檢測出與其相連之分子的分 子。直接報告分子包括熒光團、生色團和放射團(radiophore)。非限制性的熒光 團實例包括紅色熒光方酸菁染料(squarine dye)(例如，2，4_雙[1，3，3_三甲 基-2-亞吲哚啉基甲基]cyclobutenediylium-l，3-dioxolate(2，4-Bis[l，3，3-trimethyl-2-indolinylidenemethyl]eyelobutenediylium-1,3-dioxolate))> 紅外染料(例如，2，4_雙[3，3- 二甲基-2-(1Η-苯并[e]亞吲哚啉基甲基)] eyelobutenediylium-1,3-dioxolate (2,4-Bis[3,3-dimethy1-2- (ΙΗ-benz[e] indolinylidenemethyl) ] cyclobutenediylium-1, 3-dioxolate))或澄色焚光方酸菁 染料(例如 2，4-雙[3，5- 二甲基-2-吡咯]cyclobutenediylium-l，3-diololate(2， 4-Bi s [3,5-dimethy1-2-pyrroly1]eyelobutenediylium-1,3-diololate))。 焚 光團的另一些非限制性實例包括量子點(quantum dot)、Alexa FlllOr 染 料、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY -FL、
BODIPY -R6G、BODIPY -TMR、BODIPY -TRX、—cadeBlue 、
CyDye (包括但不限于Cy2 、Cy3 和Cy5 )、DNA嵌入染料、6-FAM 、熒光素、HEX 、 6-JOE, Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue 、REG、藻膽蛋白(包括但不限于藻紅蛋白和別藻藍蛋白)、Rhodamine Green , RhodamineRed , ROX 、TAMRA 、ΤΕΤ 、四甲基羅丹明或Texas Red ?？墒褂眯盘柗糯笤噭?(例如酪胺(PerkinElmer))來增強熒光信號。間接報告分子包括生物素，其必須與另一分 子例如鏈霉親和素_藻紅蛋白結合以用于檢測。還可使用成對的標記物，例如熒光共振能 量轉移對或染料-淬滅劑對。本發(fā)明還提供了試劑盒，其提供了可用于本文公開之方法中的各種組分。在一個 實施方案中，所述試劑盒可包含一種或多種磁性捕獲劑以及一種或多種標記試劑。在一些 方面中，所述試劑盒包含針對生物靶標上特定表位具有特異性親和力的磁性抗體以及針對 生物靶標上特定表位具有特異性親和力的標記試劑。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于對生物靶標進行免疫捕獲和成像的系統(tǒng)。 在一些方面中，所述系統(tǒng)包含成像系統(tǒng)、適于引入成像系統(tǒng)的標記試劑和磁性捕獲劑、針 對生物靶標上特定表位具有特異性親和力的標記試劑和磁性捕獲劑、將磁場選擇性地引入 成像系統(tǒng)的磁體(其用于固定磁性捕獲劑以及與磁性捕獲劑結合的任何生物靶標和標記 試劑)。應當理解，本文所述的任何方法或組合物的實施可與本文所述的任何其它方法或 組合物相關聯。權利要求中使用的術語“或”用于指“和/或”，指明僅擇一選擇或者備選方案之間 互相排斥除外，然而本公開內容支持擇一選擇以及“和/或”的定義。在本申請中，術語“約”用于表示數值包含由于測定該數值所應用的裝置或方法所 導致的標準差。根據現行專利法，無數量詞修飾的詞語當與“包括/包含”一起在說明書和權利要 求中使用時，是指一個(種)或多個(種)，特別指明除外。根據以下的詳細描述，本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點將顯而易見。然而，應該理 解，該詳細描述和具體實施例(即本發(fā)明的具體實施方案)僅通過舉例說明的方式給出，因 為根據該詳細描述，在本發(fā)明精神和范圍內的各種變化和改動對于本領域技術人員來說均 是顯而易見的。


以下附圖構成了本申請說明書的一部分，其進一步說明本發(fā)明的某些方面。通過參 考這些附圖中的一幅或多幅并結合本文中具體實施方案的詳細描述，可更好地理解本發(fā)明。圖1A、1B和IC顯示流體處理系統(tǒng)的框圖。圖2顯示成像裝置之光學構造的框圖。圖3顯示成像系統(tǒng)的框圖。圖4顯示成像系統(tǒng)的框圖。圖5顯示成像系統(tǒng)的框圖。圖6是成像系統(tǒng)側視圖的示意圖。圖7示意在樣品加載期間不同時間點的成像系統(tǒng)視野。圖8A、8B和8C示意從三個檢測通道獲得的圖像。圖9是采用分類通道獲取的倒像，其顯示經標記的珠。圖10是采用報告通道獲取的倒像，其顯示經標記的⑶4+細胞和經標記的珠。圖11是一系列倒像，其顯示隨著向成像腔室引入額外的樣品等分試樣，視野中目 標物密度的增加。圖12是一系列倒像，其顯示高濃度樣品的成像。等分試樣1的濃度過大以至于不 能很好地進行分析。在徹底清洗成像腔室后，將第二等分試樣(其量為等分試樣1的三分 之一)加載到腔室中。等分試樣2的濃度過大以至于不能很好地進行分析。在又一次徹底 清洗成像腔室后，將第三等分試樣(其量為第一等分試樣的六分之一)加載到腔室中。等 分試樣3使得腔室中的目標物濃度適于進行進一步處理。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于對存在于復雜基質樣品中的具有統(tǒng)計學顯著數目的生物細胞或 其它目的生物分析物進行標記、分離、檢測和/或計數的方法和系統(tǒng)。從樣品混合物中分離 目的生物靶標通過免疫磁性分離來實現。將針對目的生物靶標上特定表位具有特異性親和 力的磁性捕獲劑與生物靶標結合，以使其具有磁性響應。當向設備的成像腔室引入樣品后， 所述捕獲復合物(生物靶標-磁性捕獲劑)將被磁場所吸引并位于成像系統(tǒng)焦平面中的腔 室表面上。優(yōu)選地，將其余的樣品(非磁性的)從成像腔室中洗去。所述方法可利用成像 系統(tǒng)(例如本文所述的成像系統(tǒng))以及專利申請序列號No. 11/757，841(名稱為“Systems and methods forperforming measurements of one or more materials”，其已通過弓|用 并入本文中)所述的設備來實施。還使用檢測試劑(例如熒光標記的抗體)在樣品中直接標記生物靶標。對生物靶 標的標記允許使用設備的光學和成像功能對所捕獲的生物靶標進行觀察。由于設備具有多 重能力(多種激發(fā)光源和多個檢測通道)，使得鑒定多種生物靶標群成為可能，例如具有多 種標記物的生物靶標(該生物靶標屬于多個群或亞群)或具有獨特標記物的不同生物靶標 (每種生物靶標屬于獨特的群或亞群)。對經分離且經標記的生物靶標進行計數通常通過將熒光目標物區(qū)別于成像腔室 中的暗背景并通過應用圖像處理算法來實現，從而基于尺寸、半徑、圓度和其它相關測量值 來鑒定以及計數生物靶標。向成像腔室中引入樣品可進行實時監(jiān)測。所述設備的這種功能使得能夠調整樣品量，從而分離出具有統(tǒng)計學顯著數目的生物靶標。與一般樣品相比，向成像腔室中加載的含 有低濃度生物靶標的樣品的量更大?；蛘?，含有高濃度生物靶標的樣品的加載量更小。當 完成樣品加載步驟后，使用圖像處理算法對所有靶向的生物靶標群進行計數。需要的話，在 分析結束時，撤除磁場以便于對成像腔室進行徹底的清洗和再生?？扇缦掠嬎銟悠分猩锇袠说臐舛韧ㄟ^了解設備中所加載樣品的總體積、視野 面積與成像腔室總面積的比值以及捕獲效率來對成像腔室視野中的生物靶標計數。一旦生 物靶標被加載至成像腔室中，由于磁場的存在，它們將被捕獲。對于一個特定的應用，所述 系統(tǒng)和方法需要具有如下特征，即設備對于目的生物靶標的捕獲效率是已知的。此外，所述 成像腔室也需要具有如下特征，即成像視野相對于腔室總表面積的比例是已知的。所述圖 像處理算法使得能夠對視野內的細胞進行計數，并且所述算法將根據所檢測到的細胞數來 執(zhí)行加載額外的樣品或者執(zhí)行清洗程序。捕獲效率表示腔室中捕獲的生物靶標占腔室中所加載之生物靶標總數的百分比。 有許多因素影響捕獲效率。當生物靶標是細胞時，這些因素可包括目的細胞表面上可用的 受體(或標志物)的數目；結合到表面的磁性顆粒的數目、捕獲試劑(例如抗體)針對特定 受體的親和力以及孵育時間和試劑濃度；磁場強度；腔室的大小和深度；樣品的粘度；以及 樣品通過腔室時的速度。有兩個獨立的目標與捕獲效率相關一最大化和進行表征。使捕獲效率最大化將 使得能夠使用較小的樣品量。這對于定性測定(其目標是檢測樣品中是否存在某一細胞、 細菌或孢子，而并非對樣品中的濃度進行定量，例如檢測環(huán)境樣品中的炭疽芽孢)來說會 降低檢出限。通過將樣品加載到較小的成像腔室中，在視野中存在目的分析物的概率提高， 則檢出限得以改善。對于定量測定來說，其目標不僅是檢測是否存在某一靶標，還是對樣品 中靶標物的濃度進行定量。在這種情形中，需要對捕獲效率進行表征并使之保持一致，以便 能使所檢出的靶標(例如細胞)數與樣品中實際的靶標(例如細胞)數量相關聯?？赏ㄟ^ 如下方式對捕獲效率進行表征和測量使用含有已知量生物靶標(例如特定的細胞群)的 標準樣品，將所述樣品加載至成像腔室中，并測量可被檢出的生物靶標數。然后，可將所檢 出的生物靶標數與生物靶標的實際數目進行比較以計算捕獲效率?；诔Ｒ?guī)的“增加體積(the added volumes) ”分析方法，替代性的方法包括制備 樣品等分試樣，并在進行任何樣品處理步驟之前向每個等分試樣加入已知量的生物靶標。 對每個等分試樣中生物靶標的測量使得能夠得到標準曲線，該標準曲線涵蓋了屬于其固有 參數的捕獲效率(以及在樣品處理步驟中或來自樣品的任何其它變化)。對樣品中生物靶 標的測量值繼而可外推至該標準曲線，從而計算樣品中的細胞濃度。這種方法對于如下情 形中的樣品特別有意義，即所述樣品中的細胞濃度非常低，即使加載全部樣品也不足以捕 獲到具有統(tǒng)計學顯著數目的細胞。通過加入已知量的細胞并制作標準曲線，該方法能夠測 量比常規(guī)方法所定義之閾值濃度低的樣品。所述成像腔室也對有效捕獲生物靶標的能力產生影響，對其的設計針對具體應用 而定。對于總樣品量很小以及可供捕獲之生物靶標的潛在數量很低的應用，需要盡可能高 的捕獲效率并且可使用盡可能小尺寸的成像腔室。成像腔室的寬度和長度較小意味著所捕 獲的生物靶標將分散于較小的成像表面上，這將增加視野內的細胞密度。此外，薄的腔室將 使生物靶標接受的磁場力梯度較小并且會使所有樣品均更接近于磁體。生物靶標越接近磁體，磁場的引力會越強，捕獲效率也將越高。對于樣品量可能非常大以及足以進行定量響應 的應用，可以將成像腔室設計成較大的尺寸，從而在同一時間內處理更多的樣品，而無需增 加樣品引入速度。對于大小不同的細胞、孢子或細菌的檢測，可以改變和優(yōu)化所述儀器的放大倍率 分析物越大，所需的放大倍率越低。檢測靶標的限制因素是整個光路的分辨率。為了使圖 像處理算法能夠鑒定目標并根據其大小、形狀或半徑有效地進行表征，所述目標的大小優(yōu) 選為至少5X5像素。所述圖像處理算法根據視野的原始圖像確定生物靶標的數目。相對于背景信號， 將視野中的每一個熒光目標物鑒定出來。然后，對每個目標的大小(像素的長和寬)、圓度 (定義為目標周長的平方除以(4X π X目標面積)的比值)和/或其它認為必要的目的測 量值(直徑、面積、半徑等)進行表征。使用這種方法，任意大小和形狀的非特異性熒光目 標物將被排除在從總計數之外。所有其余的目標物則計入生物靶標數中。一旦開始進行檢測和計數過程，就可能要不斷重復該過程，直到計算出樣品中的 細胞終濃度。這樣，所計數的靶標(例如珠、細胞或其它生物靶標)數目可超出某一閾值，因 而被認為是統(tǒng)計學顯著的。常使用的閾值下限是30，因為正態(tài)分布的統(tǒng)計分析可以在樣品 量大于30時進行。但是，也可以使用其它閾值下限(例如35、40、45或50)，從而盡可能地 使圖像處理和測量誤差的影響最小。作為上限，閾值可以定義為預定的靶標數(例如100、 200、300、400、500或1000個靶標)。閾值還可根據視野中存在的雙聯體數來定義隨著視 野中靶標數的增加，兩個靶標重疊的概率將增加，于是雙聯體的出現更加頻繁。當雙聯體的 出現頻率不再與所加載樣品量呈線性關系時，剛可視為已達到閾值上限。當靶標數低于閾值下限時，所述圖像處理算法會在再次計數之前指示加載額外的 樣品。這一過程將重復進行，直到視野中的靶標數到達預先設定的閾值下限但仍低于閾值 上限時?；蛘撸诟鞔斡嫈抵g徹底清洗成像腔室，可以將分別計數的數目保存，繼而進行 加和，直至達到閾值下限。如果超過閾值上限，則可以將磁場從成像腔室撤除，對成像腔室 進行清潔(例如，利用旁通管路倒入驅動/清洗流體并流過腔室)，然后將更小的樣品等分 試樣加載至成像腔室。最后的計數步驟將作為其它進一步計算細胞濃度的依據。雖然最小閾值和最大閾值策略因其簡便性而具有吸引力，但是也可以定義和實施 另一些策略或另一些條件，以確定所檢測目標的數目是否足夠。例如，可同時測量所計數目 標的大小(而非通過定義閾值上限)來獲得最大計數。高濃度的樣品會導致大量靶標目標 的顯著重疊。多個無法分辨的重疊目標會被計數為單一目標，而其大小會被表征為大的聚 集體。因此，對超過特定大小的目標計數以及定義這些大目標的最大數目也可用于鑒定濃 度過高的樣品。由于使用了例如精確的注射泵從而將樣品推入樣品環(huán)并將其注射入主驅動流體 管路，因此加載到腔室中的樣品總體積是可知的。這種雙管路方法使得能夠對樣品進行實 時稀釋，從而減慢樣品的引入并且降低了樣品的粘度，從而改善了捕獲效率。所述驅動流體 含有能夠稀釋樣品的緩沖溶液。所述驅動流體可以與清洗緩沖液是同一緩沖液。通過將樣 品管路與主驅動流體管路合并，所述驅動流體將有效地稀釋樣品并將其運送至成像腔室。 改變樣品并入主驅動流體管路的速度將會得到不同的稀釋系數。這使得能夠有效地加載不 同體積的樣品，特別是小體積的樣品。
如果同時分析生物靶標的多個群和/或亞群，則可使用多種熒光標記物或其它報 告分子以區(qū)分不同的生物靶標群和/或亞群。對于每個所用的檢測通道以及對于生物靶標 的每個群和/或亞群，重復先前段落中所述的計算。在每次計算中，生物靶標的捕獲效率可 以相同或不同。在任何情況下(如在單獨(single-plex)模式中)，捕獲效率需要表征為使 得能夠計算樣品中生物靶標的濃度。為了驗證所述系統(tǒng)的持續(xù)穩(wěn)定性，可以在分析樣品之前使用并測試一系列對照。 這樣的對照可包括一系列熒光磁性微球，例如LuminexMagPlex珠。所述一系列對照通過制 備具有不同含量磁石制備的微球來構建。為了區(qū)分它們，系列中的每個微球可使用例如標 準Luminex染色方法來進行獨特編碼。本領域技術人員還可以使用其它的編碼技術(例如 但不限于大小差異、光散射特征、光發(fā)射、光吸收)來制備不同的微球系列。而后，每個系列 將通過其編碼和預期的捕獲效率進行定義，并且可以校準所述儀器從而使實際捕獲效率與 預期捕獲效率相匹配。所述微球對照系列還可用于表征生物靶標的磁化作用。通過比較靶標的捕獲效率 與微球對照的捕獲效率，可通過所述對照的磁石含量來估計靶標周圍的磁石含量。隨后，可 對孵育時間進行優(yōu)化以確保靶標周圍具有足夠的磁石含量，同時仍使整個測定在合理的時 間內完成。A.成像系統(tǒng)圖1-6示意可進行本發(fā)明方法的多種設備。值得注意的是，這些圖并非按比例繪 制。特別地，為了強調某些元件的特征，附圖中這些元件的比例被夸大了。使用同樣的附圖 標記來標識那些在多幅圖中出現并且配置類似的元件。需要進一步注意的是，對這些設備 的描述只是示例性的，并出于教導本領域技術人員以一般方式實施本發(fā)明的目的。根據本 說明書，實施進一步修改和替代性實施方案對于本領域技術人員來說是顯而易見的。圖1A、1B、1C和2中所示的實施方案一般性地涉及配置用于將一種或多種材料從 一個或多個容器轉移到測量裝置的成像空間(imagingvolume)的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含三個主 要組成部分流體處理、光學配置和顆粒固定化子系統(tǒng)。圖IA-C顯示三種配置中的流體處 理子系統(tǒng)的功能組件，而圖2則示意光學子系統(tǒng)的功能組件。在圖IA-C的流體處理子系統(tǒng)中，樣品從樣品儲存容器12轉移到測量裝置的成像 腔室10中。所述成像空間可被配置為成像腔室10，其還可具有本領域已知的任何合適的配 置。儲存容器12可被配置為Vacutainer管、離心管、注射器、微量滴定板或本領域已知的 任何其它合適的樣品容器。所述系統(tǒng)還包含雙向泵14，其配置用于將流體吸入儲庫，之后再將流體從儲庫排 出并進入腔室10的成像空間。泵14可具有本領域已知的任何合適的配置。如本文進一步 所述，由于生物靶標在暴露期間是基本上被固定的，因此不需要無脈沖流動(例如由昂貴 的注射泵獲得的無脈沖流動)。在泵14和樣品閥18之間的管16的長度可構成足夠用的 儲庫。這樣的儲庫常稱作“樣品環(huán)(sample loop)”。該管還可具有任何合適的配置。樣品 閥18的功能是當從樣品儲存容器12吸氣時將樣品探頭15與儲庫(樣品環(huán)16)連接起來， 以及當分配時將儲庫與成像腔室10連接起來。樣品閥18可包括本領域已知的任何合適的 閥。泵閥20用在儲庫(樣品環(huán)16)的泵末端。在圖IA中，泵閥20連接到驅動溶液儲存
11容器和清洗溶液儲存容器。這種配置可用于需要使用不同組成之驅動溶液和清洗溶液的情 況下。然而，驅動溶液和清洗溶液可使用同樣的溶液，在該情況下，可以使用一個儲存容器。 圖IB和IC顯示泵閥20連接到驅動/清洗溶液儲存容器。圖IC顯示旁通管路(by-pass line) 17，其允許在引入部分樣品后清洗成像腔室10，而不必使用儲存有剩余樣品的樣品環(huán) 16。因此，旁通管路實現了依次加載來自樣品環(huán)16中相同樣品的等分試樣，從而適應于不 同的樣品濃度，以擴展本方法的可用范圍。如果沒有旁通管路17，則清洗而后將額外的樣 品加載至成像腔室10中涉及徹底沖洗樣品環(huán)16，然后再一次從樣品儲存容器12獲取樣品 以重新加載樣品環(huán)16。盡管這種方法是可用的，但相比采用旁通管路來說其是低效且浪費 的。泵閥20可包括本領域已知的任何合適的閥。在一些替代性的實施方案中，可以將所述 泵閥和清洗閥合并為單個閥。泵14也可配置用來將成像腔室10中的一種或多種材料和任 何其它流體運送至廢物容器24。廢物容器24可具有本領域已知的任何合適的配置。運行圖IA-C示意的流體處理子系統(tǒng)有三種主要模式來將樣品加載至成像腔室 10，即包括樣品清洗的加載程序、不包括樣品清洗的加載程序和重復加載程序。在圖IA所 示的流體處理子系統(tǒng)中，不包括樣品清洗的加載程序一般如下進行清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。5)移動磁體262使其遠離成像腔室10。6)推入驅動溶液使其穿過腔室，以清潔腔室10。7)樣品閥18，由位置1移向位置2。8)推入驅動溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。加載樣品1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置2。5)放低探頭15使之進入樣品儲存容器12。6)將樣品加載至樣品環(huán)16中。7)抬高探頭15并拔出，直到樣品閥18中具有空氣并且全部樣品均在樣品環(huán)16 中。8)樣品閥18，由位置1移向位置3。9)移動磁體262使其靠近成像腔室10。10)將樣品從樣品環(huán)16推入成像腔室10中，捕獲磁性捕獲劑以及與其結合的任何 生物靶標和檢測試劑(捕獲復合物)。11)獲取固定的捕獲復合物的圖像。清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。
2)加載驅動溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。5)移動磁體262使其遠離成像腔室10。6)推入驅動溶液使其穿過腔室10，以清潔腔室。7)樣品閥18，由位置1移向位置2。8)推入驅動溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。在圖IA所示的流體處理子系統(tǒng)中，包括樣品清洗的加載程序一般如下實施清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。5)移動磁體262使其遠離腔室10。6)推入驅動溶液使其穿過腔室10，以清潔腔室。7)樣品閥18，由位置1移向位置2。8)推入驅動溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。預加載清洗溶液1)泵閥20移向位置b。2)加載清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。5)推入清洗溶液使其穿過腔室。6)樣品閥18，由位置1移向位置2。7)推入清洗溶液使其穿過探頭15 (用清洗溶液預加載樣品環(huán)16和探頭15)。加載樣品1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置2。5)放低探頭15使之進入容器12。6)將樣品加載至樣品環(huán)16中。7)抬高探頭15并拔出，直到樣品閥中具有空氣并且全部樣品均在樣品環(huán)16中。8)樣品閥18，由位置1移向位置3。9)移動磁體262使其靠近腔室10。10)將樣品從樣品環(huán)16推入腔室10，捕獲磁性捕獲劑以及與其結合的任何生物靶 標和檢測試劑(捕獲復合物)。11)在樣品之后將清洗溶液推入樣品環(huán)16中，流過捕獲 合物從而“清洗”所述捕 獲復合物。
12)獲取固定的捕獲復合物的圖像。清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。5)移動磁體262使其遠離腔室10。6)推入驅動溶液使其穿過腔室10，以清潔腔室。7)樣品閥18，由位置1移向位置2。8)推入驅動溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。在圖IA所示的流體處理子系統(tǒng)中，所述重復加載程序一般如下實施清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。5)移動磁體262使其遠離腔室10。6)推入驅動溶液使其穿過腔室10，以清潔腔室。7)樣品閥18，由位置1移向位置2。8)推入驅動溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。預加載清洗溶液1)泵閥20移向位置b。2)加載清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。5)推入清洗溶液使其穿過腔室。6)樣品閥18，由位置1移向位置2。7)推入清洗溶液使其穿過探頭15 (用清洗溶液預加載樣品環(huán)16和探頭15)。加載樣品1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置2。5)放低探頭15使之進入容器12。6)將樣品加載至樣品環(huán)16中。7)抬高探頭15并拔出，直到樣品閥中具有空氣并且全部樣品均在樣品環(huán)16中。8)樣品閥18，從位置1移向位置3。9)移動磁體262使其靠近腔室10。10)將樣品從樣品環(huán)16推入腔室10，捕獲磁性捕獲劑以及與其結合的任何生物靶標和檢測試劑(捕獲復合物)。11)在樣品之后將清洗溶液推入樣品環(huán)16中，流過捕獲復合物從而“清洗”所述捕 獲復合物。12)獲取固定的捕獲復合物的圖像。13)使用圖像分析算法處理圖像并確定是否需要進一步加載樣品。如果需要進一 步加載樣品，則再次從步驟1啟動加載樣品程序。如不需要進一步加載樣品，則進行“清潔 系統(tǒng)”程序。清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。5)移動磁體262使其遠離腔室10。6)推入驅動溶液使其穿過腔室10，以清潔腔室。7)樣品閥18，由位置1移向位置2。8)推入驅動溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。在圖IB所示的流體處理子系統(tǒng)中，不包括樣品清洗的加載程序一般如下實施清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移動至位置3。5)移動磁體262使其遠離成像腔室10。6)推入驅動/清洗溶液使其穿過腔室，以清潔腔室10。7)樣品閥18，由位置1移向位置2。8)推入驅動/清洗溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。加載樣品1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，從位置1移向位置2。5)放低探頭15使之進入樣品儲存容器12。6)將樣品加載至樣品環(huán)16中。7)抬高探頭15并拔出，直到樣品閥18中具有空氣并且全部樣品均在樣品環(huán)16中8)樣品閥18，從位置1移向位置3。9)移動磁體262使其靠近成像腔室10。10)將樣品從樣品環(huán)16推入成像腔室10，捕獲磁性捕獲劑以及與其結合的任何生 物靶標和檢測試劑(捕獲復合物)。11)獲取固定的捕獲復合物的圖像。
清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，從位置1移向位置3。5)移動磁體262使其遠離成像腔室10。6)推入驅動/清洗溶液使其穿過腔室10，以清潔腔室。7)樣品閥18，從位置1移向位置2。8)推入驅動/清洗溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。在圖IB所示的流體處理子系統(tǒng)中，包括樣品清洗的加載程序一般如下實施清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。5)移動磁體262使其遠離腔室10。6)推入驅動/清洗溶液使其穿過腔室10，以清潔腔室。7)樣品閥18，由位置1移向位置2。8)推入驅動溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。加載樣品1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置2。5)放低探頭15使之進入容器12。6)將樣品加載至樣品環(huán)16中。7)抬高探頭15并拔出，直到樣品閥中具有空氣并且全部樣品均在樣品環(huán)16中。8)樣品閥18，由位置1移向位置3。9)移動磁體262使其靠近腔室10。10)將樣品從樣品環(huán)16推入腔室10，捕獲磁性捕獲劑以及與其結合的任何生物靶 標和檢測試劑(捕獲復合物)。11)在樣品之后將驅動/清洗溶液推入樣品環(huán)16中，流過捕獲復合物從而“清洗” 所述捕獲復合物。12)獲取固定的捕獲復合物的圖像。清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。
5)移動磁體262使其遠離腔室10。6)推入驅動/清洗溶液使其穿過腔室10，以清潔腔室。7)樣品閥18，由位置1移向位置2。8)推入驅動溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。在圖IB所示的流體處理子系統(tǒng)中，重復加載程序一般如下實施清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。5)移動磁體262使其遠離腔室10。6)推入驅動/清洗溶液使其穿過腔室10，以清潔腔室。7)樣品閥18，由位置1移向位置2。8)推入驅動/清洗溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。加載樣品1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置2。5)放低探頭15使之進入容器12。6)將樣品加載至樣品環(huán)16中。7)抬高探頭15并拔出，直到樣品閥中具有空氣并且全部樣品均在樣品環(huán)16中。8)樣品閥18，由位置1移向位置3。9)移動磁體262使其靠近腔室10。10)將樣品從樣品環(huán)16推入腔室10，捕獲磁性捕獲劑以及與其結合的任何生物靶 標和檢測試劑(捕獲復合物)。11)在樣品之后將驅動/清洗溶液推入樣品環(huán)16中，流過捕獲復合物從而“清洗” 所述捕獲復合物。12)獲取固定的捕獲復合物的圖像。13)使用圖像分析算法處理圖像并確定是否需要進一步加載樣品。如果需要進一 步加載樣品，則再次從步驟1啟動加載樣品程序。如不需要進一步加載樣品，則進行“清潔 系統(tǒng)”程序。清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。5)移動磁體262使其遠離腔室10。6)推入驅動/清洗溶液使其穿過腔室10，以清潔腔室。
7)樣品閥18，由位置1移向位置2。8)推入驅動/清洗溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。在圖IC所示的流體處理子系統(tǒng)中，不包括樣品清洗的加載程序一般如下實施清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。5)移動磁體262使其遠離成像腔室10。6)推入驅動/清洗溶液使其穿過腔室，以清潔腔室10。7)樣品閥18，由位置1移向位置2。8)推入驅動/清洗溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。加載樣品1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，從位置1移向位置2。5)放低探頭15使之進入樣品儲存容器12。6)將樣品加載至樣品環(huán)16中。7)抬高探頭15并拔出，直到樣品閥18中具有空氣并且全部樣品均在樣品環(huán)16 中。8)樣品閥18，從位置1移向位置3。9)移動磁體262使其靠近成像腔室10。10)將樣品從樣品環(huán)16推入腔室10，捕獲磁性捕獲劑以及與其結合的任何生物靶 標和檢測試劑(捕獲復合物)。11)獲取固定的捕獲復合物的圖像。清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，從位置1移向位置3。5)移動磁體262使其遠離成像腔室10。6)推入驅動/清洗溶液使其穿過腔室10，以清潔腔室。7)樣品閥18，從位置1移向位置2。8)推入驅動/清洗溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。在圖IC所示的流體處理子系統(tǒng)中，包括樣品清洗的加載程序一般如下實施清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。
3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。5)移動磁體262使其遠離腔室10。6)推入驅動/清洗溶液使其穿過腔室10，以清潔腔室。7)樣品閥18，由位置1移向位置2。8)推入驅動溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。加載樣品1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置2。5)放低探頭15使之進入孔12。6)將樣品加載至樣品環(huán)16中。7)抬高探頭15并拔出，直到樣品閥中具有空氣并且全部樣品均在樣品環(huán)16中。8)樣品閥18，由位置1移向位置3。9)移動磁體262使其靠近腔室10。10)將樣品從樣品環(huán)16推入腔室10，捕獲磁性捕獲劑以及與其結合的任何生物靶 標和檢測試劑(捕獲復合物)。11)泵閥20移向位置a。12)加載驅動/清洗溶液。13)泵閥20移向位置b。14)推入驅動/清洗溶液使其穿過旁通管路17，并流過成像腔室10中的捕獲復合 物以“清洗”所述捕獲復合物。15)獲取固定的捕獲復合物的圖像。清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。5)移動磁體262使其遠離腔室10。6)推入驅動/清洗溶液使其穿過腔室10，以清潔腔室。7)樣品閥18，由位置1移向位置2。8)推入驅動溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。在圖IC所示的流體處理子系統(tǒng)中，重復加載程序一般如下實施清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。
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5)移動磁體262使其遠離腔室10。6)推入驅動/清洗溶液使其穿過腔室10，以清潔腔室。7)樣品閥18，由位置1移向位置2。8)推入驅動/清洗溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。加載樣品1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置2。5)放低探頭15使之進入孔12。6)將樣品加載至樣品環(huán)16中。7)抬高探頭15并拔出，直到樣品閥中具有空氣并且全部樣品均在樣品環(huán)16中。8)樣品閥18，由位置1移向位置3。9)移動磁體262使其靠近腔室10。10)將樣品從樣品環(huán)16推入腔室10，捕獲磁性捕獲劑以及與其結合的任何生物靶 標和檢測試劑(捕獲復合物)。11)泵閥20移向位置a。12)加載驅動/清洗溶液。13)泵閥20移向位置b。14)推入驅動/清洗溶液使其穿過旁通管道17，并流過成像腔室10中的捕獲復合 物以“清洗”所述捕獲復合物。15)獲取固定的捕獲復合物的圖像。16)使用圖像分析算法處理圖像并確定是否需要進一步加載樣品。如果需要進一 步向腔室10加載樣品，則在樣品環(huán)16中仍存有額外樣品的情況下再次從步驟10啟動加載 樣品程序，或者在需要首先向樣品環(huán)16中加載樣品的情況下再次從步驟1啟動加載樣品程 序。如果腔室10中不需要另外的樣品，則進行“清潔系統(tǒng)”程序。清潔系統(tǒng)1)泵閥20移向位置a。2)加載驅動/清洗溶液。3)泵閥20移向位置C。4)樣品閥18，由位置1移向位置3。5)移動磁體262使其遠離腔室10。6)推入驅動/清洗溶液使其穿過腔室10，以清潔腔室。7)樣品閥18，由位置1移向位置2。8)推入驅動/清洗溶液使其穿過探頭15，以清潔探頭。使用樣品清洗和樣品被“清洗”的重復加載程序的優(yōu)勢在于，從溶液中除去不與生 物靶標結合的檢測試劑。為了便于操作，一些測定中不包括清洗步驟，當測量來自生物靶標 的測定響應時，這通常導致較高的“背景”信號。圖2泛泛地示意了光學子系統(tǒng)8。子系統(tǒng)8包括磁性元件262，其位于與系統(tǒng)中光學部件相對的成像腔室10 —側。磁性元件262可包括本領域已知的任何合適的磁性元件， 例如永久磁鐵或可用于產生適當磁場的電磁鐵。在這方面，使用由位于腔室一側的磁性元 件262產生的磁場，與磁性捕獲復合物結合的生物靶標可基本上被固定于成像腔室10。雖 然圖2中顯示磁性元件262與成像腔室10挨著，但是磁性元件可以與成像腔室10偶聯、整 合于成像腔室10中或者與成像腔室10間隔開。此外，雖然圖2顯示了一個磁性元件位于 成像腔室附近，應理解，所述系統(tǒng)可包括多于一個的磁性元件。通過測量裝置獲取信號之后，可去除磁場(例如，通過使用螺線管來移除永久磁 鐵來實現，或者通過調節(jié)電磁鐵的開關來實現)，繼而生物靶標可離開成像腔室10。最簡單的成像腔室10設計為這樣的成像腔室，其在靠近磁性元件的一側具有相 對平滑的內表面，從而當磁體262將珠拉至該內表面時，所述珠隨機地沿內表面分布。然 而，成像腔室10還可如下設計當施加磁場時，成像腔室10在特定點“把持”捕獲復合物， 如本文所詳述地。當捕獲復合物固定于腔室10之后，運行照明模塊(LED 44,46)以激發(fā)檢測試劑， 在本實施方案中檢測試劑標記有熒光團。圖像傳感器(CCD) 72捕獲圖像，并對圖像進行處 理(參見例如，美國專利申請序列號No. 11/534，166，名稱為“Methods and Systems for Image DataProcessing”，由Roth于2006年9月21日提交，其已通過引用并入本文中)。 磁體262釋放樣品，然后清潔設備。根據本發(fā)明，所述圖像傳感器72相對于LED 44、46、腔室10和磁體262的位置可 進行調整以用于對生物靶標成像。在這一實施方案中，檢測試劑具有獨特的特征，即與該檢 測試劑連接的染料(其吸收和再次發(fā)射無方向偏好(針對所有角度均一致)的光子)。選 擇LED 44、46的照明位置和成像傳感器((XD 72)的位置以優(yōu)化圖像傳感器((XD 72)的視 野(field of view, F0V)中與生物靶標結合的任何檢測試劑的“角空間(angle space)”。 由于磁體262位于腔室10的背面，因此照明和成像系統(tǒng)可用的角空間是磁鐵上方的半球 體。照明光學部件(LED 44、46)的光照角空間覆蓋面越大，則成像過程中對檢測試劑的作 用越強。類似地，收集角度(數值孔徑)與光照角空間相比越高，則成像透鏡52 (圖2)可 收集并傳輸至成像感應器72 (CCD檢測器)的通量越大。因而，必須對分配給成像傳感器的 角度和照明系統(tǒng)的角度作出平衡。為了降低制造成本，所述成像透鏡52數值孔徑的實用范圍是0. 3左右，以實現4 倍放大。對于更高的放大倍率，可以增加成像透鏡52的數值孔徑，同時維持同樣的成本。 影響透鏡52成本的其它因素還有視野和波段寬度。數值孔徑為0. 3時大約相當于35度全對于照明模塊(例如LED 44,46)的放置，其限制可能是LED的亮度以及激發(fā)濾光 鏡47的成本。LED的光學擴展量(etendue)將決定需要何種檢測試劑角空間以提供通過視 野(FOV)的最大LED通量。(光學擴展量是光源的面積乘以光源的立體角它定義了發(fā)射 通量的幾何特征。)如果FOV相對較大，則需要較低的角空間，因此可使用更多LED。根據本發(fā)明的所述系統(tǒng)的另一實施方案如圖3所示。在該實施方案中，將樣品從 儲存容器12轉移至成像空間10。該系統(tǒng)還包括一個雙向泵14，其配置用于將流體吸入儲 庫，以及之后將流體從儲庫排出至成像空間中。泵14可具有本領域已知的任何合適的配 置。如本文進一步所述，由于捕獲復合物在暴露期間基本上被固定，因此本發(fā)明所述的系統(tǒng)實施方案不需要無脈沖流動(例如可由昂貴的注射泵獲得的無脈沖流動)。在泵14和樣品 閥18之間的管16的長度可構成足夠用的儲庫。這樣的儲庫常稱作“樣品環(huán)”。在儲庫的泵 端使用泵閥20從而允許新鮮的水(或其它合適的試劑)從儲存容器22流向成像空間。泵 閥20可包括本領域已知的任何合適的閥。值得注意的是，所述樣品閥和泵閥可合并為單個 閥(未顯示)。泵14還可配置用來將成像空間10中的一種或多種材料和任何其它流體轉 移至廢物容器24。廢物容器24可具有本領域已知的任何合適的配置。圖4所示系統(tǒng)的另一實施方案，其配置用于將一種或多種材料從一個或多個儲存 容器轉移至測量裝置的成像空間。在該配置中，所述系統(tǒng)包括泵26，其配置用于將流體從樣 品容器12直接吸入至成像空間10中，然后排出至廢物容器24。泵26可包括本領域已知的 任何合適的泵，例如蠕動泵。成像空間10、樣品容器12和廢物容器24可如上述進行配置。 可以在樣品容器12和清洗流體容器22和成像空間10之間配置任選的閥28，用于根據是否 將樣品轉移至成像空間或者將清洗液轉移至成像空間(例如，是否進行清洗功能)來改變 位置。閥28可包括本領域已知的任何合適的閥。此外，儲存容器22可如上進行配置。圖 4中所示的實施方案不同于圖3中所示的實施方案，因為前者中不包括臨時儲庫，而且少一 個閥，并使用配置用于僅單向轉移流體的泵。圖5顯示系統(tǒng)的另一實施方案，其被配置用于將一種或多種材料從一個或多個儲 存容器轉移至測量裝置的成像空間。該實施方案的配置與圖4中所示之實施方案的配置類 似，不同僅在于圖4所示實施方案中的樣品/清洗閥28被替換為閥30和閥32這兩個閥。 閥30和閥32可包括本領域已知的任何合適的閥。例如，閥30和閥32可包括開/關型的 閥，其分別被配置用于使流體從儲存容器12和22分開或同時地轉移至成像空間10。儲存 容器12和22及成像空間10可如本文所述進行配置。以這種方式提供分開的清洗和樣品通路(S卩，一條通路從儲存容器12至成像空間 10，另一分開的通路從儲存容器22至成像空間10)使得實現圖4所示實施方案的所有方面 成為可能，并且增加了如下能力，即隨著樣品被轉移至成像空間10，將清洗流體和/或一種 或多種試劑與待測量樣品混合。隨著樣品被轉移至成像空間將清洗流體和/或一種或多 種試劑與樣品混合可用于進行樣品稀釋，從而使成像空間中的捕獲復合物分散地更開(例 如，在成像腔室表面上分得更開)。圖6示意如下系統(tǒng)的一個實施方案，所述系統(tǒng)配置用于在測量裝置的成像空間中 對一種或多種材料進行成像。這一系統(tǒng)的實施方案包括檢測器34、36和38。檢測器34、36 和38可以是CCD照像機或本領域已知的任何其它合適的成像裝置。每個所述檢測器可具 有同樣的配置或不同的配置。每個所述檢測器可配置為檢測不同波長或波段的光(例如， 在由成像腔室10所定義的成像空間中的捕獲復合物40發(fā)出的熒光)。此外，每個所述檢測 器可配置為生成成像腔室10中捕獲復合物40的圖像或“捕獲熒光圖片”。所述系統(tǒng)還包括光源44和46，其配置用于發(fā)射具有不同波長或不同波段的光(例 如，其中一個光源可配置用于發(fā)射紅光，而另一光源可配置用于發(fā)射綠光)。由光源44和 46發(fā)射的光可包括例如紫外線、可見光、近紅外波長光譜中任意部分的光。光源44和46可 包括LED或本領域已知的任何其它合適的光源。光源44和46被安放在成像腔室10周圍 的上方。此外，光源被安放在成像腔室的上方使得每個光源以不同方向將光發(fā)射至成像腔 室10中的捕獲復合物40。
所述系統(tǒng)還包括分別與光源44和46偶聯的濾光鏡48和50。濾光鏡48和50可 以是帶通濾光鏡或本領域已知的任何其它合適的光譜濾光鏡。以這種方式，所述系統(tǒng)可使 用光源44和46以及濾光鏡48和50并依次使用不同波長或不同波段的光來照射所述捕獲 復合物。所述系統(tǒng)還可包括位于照明“環(huán)”中心(或大致為中心)的透鏡52。透鏡52可包 括本領域已知的任何合適的折射光學元件。透鏡52配置用于通過一個或多個光學元件將 從捕獲復合物散射的光和/或發(fā)出的熒光成像于一個或多個單色CCD檢測器(例如，檢測 器34、36和38)上，所述光學元件可包括一個或多個二色濾光鏡(dichroic filter)以及 一個或多個光學帶通濾光鏡。例如，從透鏡52發(fā)出的光射向二色濾光鏡54，所述二色濾光 鏡可包括本領域已知的任何合適的二色光學元件。二色濾光鏡54配置用于反射一個波長 或波段的光并使其它波長或波段的光通過。被二色濾光鏡54反射的光射向濾光鏡56，后者 可以是帶通濾光鏡或其它合適的光譜濾光鏡。從濾光鏡56發(fā)出的光射向檢測器34。從透鏡52投射的光也可射向二色濾光鏡58，其可包括本領域已知的任何合適的 二色光學元件。二色濾光鏡58可配置用于反射一個波長或波段的光并使其它波長或波段 的光通過。從二色濾光鏡58透射的光射向濾光鏡60，其可以是帶通濾光鏡或其它合適的光 譜濾光鏡。從濾光鏡60發(fā)出的光射向檢測器36。被二色濾光鏡58反射的光射向濾光鏡 62，其可以是帶通濾光鏡或其它合適的光譜濾光鏡。從濾光鏡62發(fā)出的光射向檢測器38。 此外，盡管圖6中所示的系統(tǒng)包含兩個光源，但是應理解，所述系統(tǒng)可包含任何合適數目的 光源。另外，盡管圖6中所示的系統(tǒng)包含三個檢測器(其配置用于使不同波長或波段的從 捕獲復合物散射的光和/或發(fā)出的熒光成像)，但是可以理解，所述系統(tǒng)可包含兩個或多個 檢測器。例如，所述系統(tǒng)可包含兩個或更多個CCD檢測器(以及任選地固定濾光鏡)，其可 被用于同時測量分類通道和報告通道，從而提供更高的測量通量。因此，圖6中所示的系統(tǒng)配置用于生成代表捕獲復合物40以若干目的波長之熒光 發(fā)射的多個或一系列圖像。此外，所述系統(tǒng)可配置用于向處理器(即處理引擎(processing engine))提供代表捕獲復合物之熒光發(fā)射的多個或一系列數字圖像。所述系統(tǒng)可以包括或 不包括所述處理器(未顯示)。所述處理器可配置用于獲取(例如，接收)來自檢測器34、 36和38的圖像數據。例如，所述處理器可通過本領域已知的任何合適方式(例如，通過將 檢測器之一與所述處理器偶聯的傳輸介質(未顯示)來實現，通過將檢測器之一與所述處 理器偶聯的一個或多個電子組件(未顯示)例如模擬-數字轉換器來實現，等等)與檢測 器34、36和38偶聯)。所述處理器可配置用于處理和分析這些圖像，從而例如對捕獲的生物靶標進行分 類和計數。此信息可由處理器以任何合適的格式(例如針對每個捕獲復合物各波長熒光 強度條目的數據陣列)輸出。具體來說，所述處理器可配置用于執(zhí)行處理和分析圖像之方 法的一個或多個步驟。通過系統(tǒng)(例如圖6所示的系統(tǒng))處理和分析圖像之方法的實例 已在美國專利申請序列號 No. 11/534，166 (名稱為 “Methods and Systems forlmage Data Processing”，由Roth于2006年9月21日提交)中舉例說明，其已通過引用并入本文中。 本文所述的系統(tǒng)還可如本發(fā)明申請所述進行配置。此外，本文所述的方法可包括本發(fā)明申 請所述任何方法的任何步驟。例如，在一個實施方案中，所述處理器可配置用于分析圖像以檢測和計數生物靶標(例如細胞)，其通過與捕獲試劑(例如磁性抗體)結合而被固定于腔室表面上并通過與 檢測試劑(例如經標記的抗體)結合而被標記，并用于確定是否有統(tǒng)計學顯著數目的經標 記生物靶標固定于腔室的表面上。配置處理器，使其在沒有統(tǒng)計學顯著數目之經標記生物 靶標固定于腔室表面上時提示向腔室添加更多額外的樣品。所述處理器重復檢測、計數、確 定以及樣品添加過程，直至有統(tǒng)計學顯著數目的經標記生物靶標被固定于腔室的表面上。 然后，所述處理器執(zhí)行另外的圖像處理和分析。如上所述，配置處理器，使其沒有統(tǒng)計學顯 著數目之經標記生物靶標固定于腔室表面上時提示向腔室添加更多額外的樣品。所述處理 器可通過提示(例如通過有聲或可視信號)使用者手動注入或操控泵從而向腔室運送額外 的樣品來提示向腔室添加更多額外的樣品?；蛘?，所述泵可以受處理器控制，從而使泵在接 收來自處理器之信號向腔室運送額外的樣品。所述處理器可以是這樣的處理器，例如常包含于典型的個人計算機、大型計算機 系統(tǒng)、工作站等中的處理器。一般地，術語“計算機系統(tǒng)”可廣泛地定義為涵蓋具有一個或 多個處理器的設備，所述處理器執(zhí)行來自存儲介質的指令。所述處理器可使用任何其它 合適的功能性硬件來執(zhí)行。例如，所述處理器可包括具有固件中之固定程序的數字信號處 理器(digital signal processor, DSP)、現場可編禾呈 Π 陣歹Ij (fieldprogrammable gate array, FPGA)或采用高級編程語言(例如超高速集成電路(Very high speed integrated circuits, VHSIC)硬件描述語言(VHDL))順序邏輯“編寫”的其它可編程邏輯器件 (programmablelogic device,PLD)。在另一實例中，在處理器上可執(zhí)行的、用于執(zhí)行上文引 用之專利申請中所述的計算機執(zhí)行方法中一個或多個步驟的程序指令(未顯示)可使用高 級語言(例如C# (需要時包括C++的部分)、ActiveX控件、JavaBeans, Microsoft基礎類 (Microsoft FoundationClasses/'MFC"))或根據需要使用其它技術或方法進行編碼。所述 程序指令可通過多種方式中的任意方式來執(zhí)行，包括基于程序的技術、基于組件的技術和/ 或面向對象的技術等。執(zhí)行例如上文引用之專利申請中所述的方法的程序指令可包含在計算機可讀介 質中，例如只讀存儲器、隨機存取存儲器、磁盤或光盤、或磁帶。B.抗體制備和表征抗體的方法是本領域所熟知的。簡言之，通過使用包含目的多肽的免 疫原免疫動物并從該免疫動物中收集抗血清來制備多克隆抗體。許多動物物種都可用于生 產抗血清。通常，用于生產抗血清的動物是非人動物，包括兔、小鼠、大鼠、倉鼠、豬、山羊或 馬。因為兔的血量相對較大，所以兔是生產多克隆抗體的優(yōu)選選擇。通過使用非特異性免疫應答刺激劑(稱為“佐劑”)可加強特定免疫原組合物的 免疫原性。示例性的佐劑包括完全弗氏佐劑(一種含有滅活結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的非特異性免疫應答刺激劑)、不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。生產多克隆抗體所使用的免疫原組合物的量根據免疫原的性質以及用于免疫的 動物而有所不同。可使用多種途徑(皮下、肌內、皮內、靜脈內和腹膜內)來施用免疫原?？?通過在免疫后多個時間點對免疫動物取血樣來監(jiān)測多克隆抗體的產生。還可施加第二(加 強)注射。重復加強免疫和測效價過程，直至達到合適的效價。當獲得期望的免疫原性水 平時，可對免疫動物放血，分離并儲存血清和/或可使用該動物產生單克隆抗體。通過使用眾所周知的技術(例如美國專利4，196，265中所述的技術，其已通過引用并入本文中)很容易制備單克隆抗體。通常，該技術包括用選定的免疫原組合物對合適 的動物進行免疫。所述免疫組合物以有效刺激抗體產生細胞的方式進行施用。嚙齒類動物 (例如小鼠和大鼠)常被用于單克隆抗體生產。免疫后，選擇具有產生抗體之潛能的體細胞(特別是B淋巴細胞(B細胞))用 于單克隆抗體生產步驟。這些細胞可取自活檢的脾、扁桃體或淋巴結，或者取自外周血樣 品。脾細胞和外周血細胞是優(yōu)選的，選擇前者是因為它們富含處于分裂中的漿母細胞期 (dividingplasmablast stage)的抗體產生細胞，而選擇后者是因為外周血便于獲取。通 常，對一組動物進行免疫，并將抗體效價最高之動物的脾取出，用注射器對脾進行勻漿以獲 得脾淋巴細胞。通常，免疫小鼠的脾臟包含約5 X IO7 2 X IO8個淋巴細胞。然后，將來自免疫動物的產生抗體的B淋巴細胞與永生的骨髓瘤細胞(一般與被 免疫的動物屬于同一物種)融合。適用于產生雜交瘤之融合方法的骨髓瘤細胞系優(yōu)選為不 產生抗體、具有較高的融合效率并且具有酶缺陷(這使其不能在僅支持期望融合細胞(雜 交瘤)生長的特定選擇培養(yǎng)基中生長)。制備產生抗體的脾或淋巴結細胞以及骨髓瘤細胞的雜交體的方法通常包括在促 進細胞膜融合的試劑(化學試劑或電試劑)存在下，將體細胞與骨髓瘤細胞按2 1的比 例混合，然而該比例可以從約20 1至約1 1的范圍變化。通常，融合方法以低頻率產 生有活力的雜交體。但是，這并不是問題，因為通過在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)即可將有活力的融 合雜交體從未融合的親本細胞(特別是未融合的骨髓瘤細胞，其通常會繼續(xù)無限分裂)中 區(qū)分出來。所述選擇培養(yǎng)基一般是包含阻止核苷酸在該組織培養(yǎng)基中從頭合成的試劑的培 養(yǎng)基。示例性的試劑包括氨基喋呤、甲氨蝶呤和偶氮絲氨酸。氨基喋呤和甲氨蝶呤阻止嘌 呤和嘧啶的從頭合成，而偶氮絲氨酸僅阻止嘌呤的合成。當使用氨基喋呤或甲氨蝶呤時，向 培養(yǎng)基補充次黃嘌呤和胸苷作為核苷酸的來源(HAT培養(yǎng)基)。當使用偶氮絲氨酸時，向培 養(yǎng)基補充次黃嘌呤。這種培養(yǎng)方式提供了一群雜交瘤，從該雜交瘤群中可選出特異性的雜交瘤。通常， 通過在微量滴定板中培養(yǎng)經過單克隆稀釋的細胞來選擇雜交瘤，隨后(約兩至三周后)測 試各克隆上清液的期望反應性。所述測定應靈敏、簡便和快速，例如放射免疫測定、酶免疫 測定、細胞毒性測定、空斑測定、斑點免疫結合測定等。然后，對選定的雜交瘤進行連續(xù)稀釋，并克隆成單獨的抗體產生細胞系，該克隆繼 而可無限繁殖從而提供單克隆抗體?？赏ㄟ^兩種基本方式利用該細胞系生產單克隆抗體。 可將一種雜交瘤樣品注射入(通常注射入腹膜腔中)組織相容性的動物類型中，該動物提 供了最初融合的體細胞和骨髓瘤細胞。該經注射動物產生分泌由融合細胞雜交體產生之特 異性單克隆抗體的腫瘤。然后，可利用所述動物的體液(例如血清或腹水)來提供高濃度 的單克隆抗體。所述單獨的細胞系也可在體外培養(yǎng)，其中單克隆抗體被自然地分泌到培養(yǎng) 基中，從該培養(yǎng)基中可容易地獲得高濃度的單克隆抗體。需要時，可使用過濾、離心和多種 色譜方法(例如HPLC或親和層析)對任一方法生產的單克隆抗體進一步純化。C.適配體適配體是這樣的核酸序列，其通過重復多輪篩選以結合不同的分子靶標(例如小 分子、蛋白質、核酸以及細胞、組織和生物體)來設計。適配體提供了與抗體相當的分子識 別性能。此外，適配體提供了優(yōu)于抗體的優(yōu)勢，因為它們可以完全在體外進行改造，很容易通過化學合成而生產并且具有理想的儲存特性。適配體通常通過SELEX(指數富集配體的 系統(tǒng)進化，Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment)方法及其變 型形式產生。SELEX方法描述于例如美國專利No. 5，270, 163和5，475，096中(二者均通過 引用并入本文中)。D.試劑盒本發(fā)明所述的任何組合物均可包含在試劑盒中。例如，所述試劑盒可包含本發(fā)明 的經適當分裝的磁性抗體和/或經標記抗體組合物，以可用于分離、分開或檢測靶細胞或 靶細胞群。其還可包含一種或多種緩沖液，例如雜交緩沖液或清洗緩沖液。所述試劑盒的 組分可以在水性介質中或以凍干形式進行包裝。所述試劑盒的容器裝置一般包括至少一 個小瓶/管、試管、燒瓶、瓶、注射器或其它容器裝置，其中可放置組分(優(yōu)選經適當分裝的 組分)。當試劑盒中包含多于一種組分時，所述試劑盒一般還包含第二、第三或其它另外的 容器，其中可單獨放置所述另外的組分。然而，也可將各組分的不同組合包含于一個小瓶/ 管中。本發(fā)明的試劑盒還典型地包括包含抗體的裝置，以及用于市售的處于密閉狀態(tài)(in close confinement)的任何其它試劑容器。這樣的容器可包括厚紙板或者注塑或吹塑的塑 性容器，其中放置所需的小瓶/管、瓶等。當所述試劑盒的組分以一種或多種液體溶液的形式提供時，該液體溶液可以是水 溶液，特別優(yōu)選地為無菌水溶液。然而，所述試劑盒的某些組分可以干燥粉末的形式提供。當試劑和/或組分以干 燥粉末的形式提供時，該粉末可通過加入適當溶劑重溶。應料想到，所述溶劑還可以另一種 容器方式提供。試劑盒還可包含使用該試劑盒組分的說明。說明可包括能夠實現的變通方式。E.實施例以下實施例表明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。本領域技術人員應理解，在所述實施例 中公開的技術體現了本發(fā)明人發(fā)現的代表性技術，其在本發(fā)明的實施中效果良好，因而可 被認為構成實現本發(fā)明的優(yōu)選方式。然而，本領域技術人員應理解，根據本發(fā)明的公開內 容，可以在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下對所公開的特定實施方案進行多種改動而 仍然得到類似的或相近的結果。實施例1.⑶4細胞計數在本實施例中，磁性捕獲抗體是抗CD4抗體，其捕獲所有CD4淋巴細胞以及所有 CD4單核細胞。檢測抗體是綴合有熒光標記的同樣抗體或另一種抗CD4抗體。實時分析過 程監(jiān)測成像腔室中的CD4細胞群。在樣品加載步驟結束時，被計數的所有CD4細胞對應于 被所述捕獲抗體捕獲并被所述檢測抗體標記的所有CD4淋巴細胞和CD4單核細胞。收集全血樣品并儲存于含有2mM EDTA (作為抗凝劑)的BDVacutainer (BD Biosciences#366452)中。將20 μ L樣品移至1. 5mL離心管中。將5yL磁性抗CD4捕獲 抗體(IMag 抗人CD4顆粒-BDBiosciences，貨號557767)直接加入含有20 μ L血樣的離 心管中。將5μ L經藻紅蛋白(phyCOerythrin，PE)標記的抗⑶4檢測抗體(R-PE綴合的小 鼠抗人單克隆抗體-BD Biosciences貨號555347地直接加入含有20 μ L血樣的離心管中。 使用移液器適當混合樣品。將該樣品靜置孵育20分鐘。使用ImL PBS/BSA溶液(預包裝 的PBS/BSA:Sigma P3688)稀釋該樣品，并將所述樣品注入成像腔室中。
一開始引入樣品，便啟用設備的磁場。連續(xù)觀察樣品以及引入新的樣品等分試樣， 使得能夠決定是繼續(xù)加載更多樣品等分試樣還是結束該步驟。一旦完成加載步驟，即對成 像腔室視野中的細胞進行計數，并根據樣品加載體積、視野大小與磁場控制下成像腔室之 表面的大小的比值以及設備的捕獲效率來計算每微升樣品中的細胞數。實施例2.通過減法策略對⑶4淋巴細胞計數在本實施例中，磁性捕獲抗體是抗CD4抗體，其捕獲所有CD4淋巴細胞以及所有 ⑶4單核細胞。檢測抗體混合物包含綴合有一種熒光標記物(標記物1)的抗⑶4抗體以 及綴合有另一種熒光標記物(標記物2)的抗CD14抗體。實時分析過程監(jiān)測成像腔室中的 CD4細胞群。在樣品加載步驟結束時，被計數的所有CD4細胞對應于樣品中被所述捕獲抗體 捕獲的所有CD4淋巴細胞和CD4單核細胞。被計數的所有CD14細胞僅對應于樣品中被所 述捕獲抗體捕獲的單核細胞群。CD4淋巴細胞數被計算為從總CD4數中扣除單核細胞數。收集全血樣品并儲存于含有2mM EDTA (作為抗凝劑)的BDVacutainer (BD Biosciences#366452)中。將20 μ L樣品移至1. 5mL離心管中。將5yL磁性抗CD4捕獲 抗體直接加入到盛有20μ L血液樣品的離心管中。將5yL標記有熒光分子(其與讀取設 備相容)的抗⑶4檢測抗體也直接加入含有20 μ L血樣的離心管中。將5μ L標記有熒光 分子(其與前一熒光分子不同且也與讀取設備相容)的抗CD14檢測抗體也直接加入含有 20yL血樣的離心管中。使用移液器適當混合樣品。將該樣品靜置孵育20分鐘。使用ImL PBS/BSA溶液(預包裝的PBS/BSA :Sigma P3688)稀釋該樣品，并轉移至于讀取裝置的注射 器。將所述樣品的等分試樣注入成像腔室中?！_始引入樣品，便啟用設備的磁場。連續(xù)觀察樣品(使用針對⑶4熒光標記物 的檢測通道)以及引入新的樣品等分試樣，使得能夠決定是繼續(xù)加載更多樣品等分試樣還 是結束該步驟。一旦完成加載步驟，便使用所述沒備的兩個檢測通道依次進行對成像腔室 視野中CD4和CD14細胞的計數。根據樣品加載體積、視野大小與磁場控制下成像腔室之表 面的大小的比值以及設備的捕獲效率來計算每微升樣品中的細胞數。實施例3.測量⑶3細胞、⑶4細胞和⑶8細胞的臨床相關計數在本實施例中，磁性捕獲抗體是抗CD3抗體，其捕獲所有淋巴細胞。檢測抗體混合 物包含綴合有一種熒光標記物(標記物1)的抗⑶3抗體、綴合有另一種熒光標記物(標記 物2)的抗⑶4抗體以及綴合有第三種熒光標記物(標記物3)的抗⑶8抗體。實時分析過 程監(jiān)測成像腔室中的⑶3細胞群。圖7示意使用“標記物1”檢測通道的成像系統(tǒng)視野，其檢 測在時間點T1、T2、. . . Tn和T最終)的⑶3群(即所有淋巴細胞)。重復進行對捕獲細胞 的檢測和計數，直到成像處理算法計量的細胞數超過特定閾值。一旦視野內的細胞數達到 所定義的閾值，則結束樣品加載程序。在樣品加載步驟結束時，對針對三種熒光團之一的三 個檢測通道中的每一個進行讀數。針對熒光標記物1的標記物1檢測通道將計數所有CD3 細胞，其對應于所有淋巴細胞，如圖8Α所示。所述標記物2檢測通道將計數淋巴細胞中的 ⑶4亞群，如圖8Β所示。最后，所述標記物3檢測通道將計數淋巴細胞中的⑶8亞群，如圖 8C所示。CD4與CD8的比值以及CD3細胞的百分比(以及CD4細胞的百分比)可根據上述 三個測量值計算得出。收集全血樣品并儲存于含有2mM EDTA (作為抗凝劑)的BDVacutainer (BD Biosciences#366452)中。將20 μ L樣品移至1. 5mL離心管中。將5 μ L磁性抗CD3捕獲抗
27體直接加入含有20 μ L血樣的離心管中。將5yL標記有熒光分子(標記物1，其與讀取設 備相容)的抗⑶3檢測抗體也直接加入含有20 μ L血樣的離心管中。將5μ L標記有第二 熒光分子(標記物2，其與前一熒光分子不同且也與讀取設備相容)的抗CD4檢測抗體也直 接加入含有20 μ L血樣的離心管中。將5μ L標記有第三熒光分子(其與前兩種熒光分子 不同且也與讀取設備相容)的抗CD8檢測抗體也直接加入含有20 μ L血樣的離心管中。使 用移液器適當混合樣品。將該樣品靜置孵育20分鐘。使用ImL PBS/BSA溶液(預包裝的 PBS/BSA =Sigma Ρ3688)稀釋該樣品，并轉移至讀取裝置的注射器。將所述樣品的等分試樣 注入成像腔室中。一開始引入樣品，便啟用設備的磁場。連續(xù)觀察樣品(使用針對⑶3熒光標記物 的檢測通道)以及引入新的樣品等分試樣，使得能夠決定是繼續(xù)加載更多樣品等分試樣還 是結束該步驟。一旦完成加載步驟，便使用所述沒備的三個檢測通道依次對成像腔室視野 中⑶3、⑶4和⑶8細胞進行計數。根據樣品加載體積、視野大小與磁場控制下成像腔室之 表面的大小的比值以及設備的捕獲效率來計算每微升樣品中的細胞數。實施例4.分離和檢測來自全血的⑶4細胞將ImL PBS/BSA 加至含有 2mM EDTA (作為抗凝劑)的 BDVacutainer (BD Biosciences#366452)。將20 μ L PBS/BSA/EDTA移至1. 5mL離心管中。使用無菌手指針 (finger prick)，直接收集1或2滴血液至1. 5mL離心管中。將1或5 μ L磁性抗⑶4捕 獲抗體(IMag 抗人CD4顆粒-BD Biosciences，貨號557767)加入含有血樣的離心管中。 將1或5 μ L標記有熒光分子的抗CD4檢測抗體(R-PE綴合的小鼠抗人單克隆抗體-BD Biosciences貨號555347，其與讀取設備相容)也加入含有血樣的離心管中。使用移液器 適當混合樣品。將該樣品靜置孵育20 25分鐘。使用lmL、400 μ L或200 μ L的PBS/BSA 溶液(預包裝的PBS/BSA :Sigma P3688)稀釋該樣品，并轉移至讀取裝置的注射器。將所述 樣品的等分試樣注入成像腔室中。所述樣品準備矩陣示于表1中。表權利要求
用于固定和檢測樣品中的細胞的方法，其包括(a)將樣品與磁性抗體相接觸，所述磁性抗體針對可能存在于所述樣品中的第一細胞上的特定表位具有特異性親和力；(b)將所述樣品與第一標記抗體相接觸，所述第一標記抗體針對所述細胞上的特定表位具有特異性親和力；(c)將所述樣品的等分試樣引入腔室中；(d)向所述腔室施加磁場以吸引所述磁性抗體至所述腔室的表面；(e)清洗所述腔室，以除去所述樣品中未固定于所述腔室表面上的部分；(f)對通過與所述磁性抗體結合而被固定在所述腔室表面上并通過與所述經標記抗體結合而被標記的細胞進行檢測和計數；(g)確定是否有統(tǒng)計學顯著數目的經標記細胞固定于所述腔室的表面上；(h)重復步驟(c)至(g)，直至統(tǒng)計學顯著數目的經標記細胞固定于所述腔室的表面上；以及(i)對經固定且經標記的細胞進行檢測和計數。
2.權利要求1的方法，其中所述樣品是體液。
3.權利要求1的方法，其中所述樣品是環(huán)境樣品。
4.權利要求1的方法，其中所述細胞是淋巴細胞、白細胞或單核細胞。
5.權利要求1的方法，其中所述細胞是細菌細胞、孢子或真菌細胞。
6.權利要求1的方法，其中所述磁性抗體和經標記抗體針對同一表位具有特異性親和力。
7.權利要求1的方法，其中所述磁性抗體和經標記抗體針對不同表位具有特異性親和力。
8.權利要求1的方法，其中在將所述樣品引入腔室之前使所述樣品與所述經標記抗體 相接觸。
9.權利要求1的方法，其中在將所述樣品引入腔室之后使所述樣品與所述經標記抗體 相接觸。
10.權利要求1的方法，其中所述經標記抗體是經熒光標記的抗體。
11.權利要求1的方法，其還包括將所檢出的細胞數與所述樣品中的細胞數建立關聯。
12.權利要求1的方法，其還包括使所述樣品與第二經標記抗體相接觸，所述第二經標 記抗體針對所述細胞上的特定表位具有特異性親和力，其中所述第二經標記抗體用不同于 所述第一經標記抗體上標記物的標記物進行標記。
13.權利要求12的方法，其中所述第一經標記抗體和所述第二經標記抗體針對存在于 不同細胞群上的不同表位具有特異性親和力。
14.權利要求1的方法，其還包括將樣品與多種不同的磁性抗體相接觸，所述多種不同磁性抗體針對可能存在于所述樣 品中的多種不同細胞上的特定表位具有特異性親和力；以及將所述樣品與多種不同的經標記抗體相接觸，所述多種不同經標記抗體針對所述多種 不同細胞上的特定表位具有特異性親和力。
15.用于固定和檢測樣品中的一種或多種細胞群和/或亞群的方法，其包括(a)將樣品與磁性抗體相接觸，所述磁性抗體針對可能存在于所述樣品中的細胞群上 的特定表位具有特異性親和力；(b)將所述樣品與第一經標記抗體相接觸，所述第一經標記抗體針對所述細胞群上的 特定表位具有特異性親和力；(c)將所述樣品與第二經標記抗體相接觸，所述第二經標記抗體針對所述細胞群中第 一細胞亞群上的特定表位具有特異性親和力；(d)將所述樣品與第三經標記抗體相接觸，所述第三經標記抗體針對所述細胞群中第 二細胞亞群上的特定表位具有特異性親和力；(e)將所述樣品的等分試樣引入腔室中；(f)向所述腔室施加磁場以吸引所述磁性抗體至腔室表面；(g)清洗所述腔室，以除去所述樣品中未固定于所述腔室表面上的部分；(h)對通過與所述磁性抗體結合而被固定在所述腔室表面上并通過與所述第一經標記 抗體結合而被標記的細胞進行檢測和計數；(i)確定是否有統(tǒng)計學顯著數目的經標記細胞固定于所述腔室表面上；(j)重復步驟(e)至(i)，直至統(tǒng)計學顯著數目的經標記細胞固定于所述腔室的表面上；(k)對分別標記有所述第一、第二和第三經標記抗體的經固定細胞進行檢測和計數。
16.權利要求15的方法，其還包括確定所述第一細胞亞群與所述第二細胞亞群的比值。
17.權利要求15的方法，其還包括計算所述第一細胞亞群在所述細胞群中的百分比。
18.權利要求15的方法，其還包括計算所述第二細胞亞群在所述細胞群中的百分比。
19.權利要求15的方法，其還包括確定所述樣品中所述細胞群的濃度。
20.權利要求15的方法，其還包括將所述樣品與第四經標記抗體相接觸，所述第四經標記抗體針對所述細胞群中第三細 胞亞群上的特定表位具有特異性親和力；以及對標記有所述第四經標記抗體的經固定細胞進行檢測和計數。
21.權利要求20的方法，其還包括將所述樣品與第五經標記抗體相接觸，所述第五經標記抗體針對所述細胞群中第四細 胞亞群上的特定表位具有特異性親和力；將所述樣品與第六經標記抗體相接觸，所述第六經標記抗體針對所述細胞群中第五細 胞亞群上的特定表位具有特異性親和力；將所述樣品與第七經標記抗體相接觸，所述第七經標記抗體針對所述細胞群中第六細 胞亞群上的特定表位具有特異性親和力；將所述樣品與第八經標記抗體相接觸，所述第八經標記抗體針對所述細胞群中第七細 胞亞群上的特定表位具有特異性親和力；以及對標記有所述第五、第六、第七以及第八經標記抗體的經固定細胞進行檢測和計數。
22.權利要求21的方法，其還包括計算所述第三、第四、第五、第六和第七細胞亞群在 所述細胞群中的百分比。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于對復雜基質樣品中具有統(tǒng)計學顯著數目的生物細胞或其它目的生物分析物進行標記、分離、檢測和/或計數的方法和系統(tǒng)。通過免疫磁性分離從樣品混合物中分離目的生物靶標。向成像腔室引入樣品后，捕獲復合物(生物靶標-磁性捕獲劑)將被磁場吸引并會位于成像系統(tǒng)焦平面中的腔室表面上。
文檔編號G01N33/543GK101939648SQ200980104507
公開日2011年1月5日 申請日期2009年1月7日 優(yōu)先權日2008年1月7日
發(fā)明者布魯斯·伯納德, 庫爾特·霍法克, 楚克·柯林斯 申請人:盧米耐克斯公司