專利名稱：P53生物標(biāo)記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及瘤學(xué)和癌癥治療領(lǐng)域。它更具體的關(guān)注于預(yù)測(cè)抗過度增生疾病治 療功效的因子的評(píng)估。
背景技術(shù)：
癌癥在大多數(shù)國家是主要的致死病因，導(dǎo)致全世界在醫(yī)療保健上花費(fèi)數(shù)十億美 元?，F(xiàn)在確定許多癌癥至少部分是由于基因異常引起的，基因異?；蛘咭鹨l(fā)癌癥的基 因(稱作“致癌基因”)的過表達(dá)，或者源于保護(hù)基因(通常稱作“瘤抑制”基因)喪失功 能的突變。例如p53，53kD大小的核磷蛋白質(zhì)，調(diào)控細(xì)胞增生。P53基因的突變和染色體 17p(基因位于該處)上等位基因的缺失，是人類惡性瘤中鑒定的最頻繁的變異。所述p53 蛋白進(jìn)化上是高度保守的，并且在大部分正常組織中表達(dá)(盡管以低水平表達(dá))。野生型 p53已被證明涉及細(xì)胞周期調(diào)控(Mercer，1992)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控(Fields and Jang, 1990 ；Mietz et al.，1992)，DNA 復(fù)制(ffilcock and Lane, 1991 ；Bargonetti et al.，1991)和凋亡的誘 導(dǎo)(Yonish-Rouach et al.，1991 ；Shaw et al. ,1992)。已知各種突變的p53等位基因發(fā)生單個(gè)堿基置換導(dǎo)致具有相當(dāng)不同生長(zhǎng)調(diào)控特 性的蛋白質(zhì)的合成，并最終引起惡性瘤(Hollstein et al.，1991)。事實(shí)上，p53基因已被發(fā) 現(xiàn)其在普通人類癌癥中是最頻繁突變的基因(Hollstein et al. , 1991 ；Weinberg, 1991), p53的突變尤其和那些與吸煙有關(guān)的癌癥相關(guān)(Hollstein et al. , 1991 ；Zakut-Houri etal.，1985)。乳腺瘤中p53的過表達(dá)也已被報(bào)道(Casey et al.，1991)。然而，有趣的 是，P53的有益功效并不限于含有突變的p53分子的癌癥。在一系列論文中，Clayman等人 (1995)證明表達(dá)野生型p53分子的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)也受到病毒載體中p53表達(dá)的抑制。綜合這些發(fā)現(xiàn)，相當(dāng)?shù)呐Ρ煌度雙53基因治療。把p53通過逆轉(zhuǎn)錄病毒遞送給 人類已在前些時(shí)候被報(bào)道(Roth et al，1996)。其中，含有野生型p53基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載 體受到β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的調(diào)控，通過直接注射將其用于介導(dǎo)野生型Ρ53基因轉(zhuǎn)移給9 個(gè)患有非小細(xì)胞肺癌的患者。直到治療后5個(gè)月臨床上沒有觀測(cè)到明顯的載體相關(guān)的毒效 應(yīng)。原位雜交和DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)表明在治療后活組織檢查中存在載體-ρ53序列。凋 亡(程序性細(xì)胞死亡)在治療后活組織檢查中比在治療前活組織檢查中更加頻繁。三個(gè)患 者中發(fā)現(xiàn)瘤退化，另外三個(gè)患者瘤生長(zhǎng)穩(wěn)定。類似的研究已被實(shí)施用腺病毒遞送Ρ53給患 有頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(SCCHN)的患者(Clayman et al.，1998)。手術(shù)和基因轉(zhuǎn)移相關(guān)的發(fā) 病率是最低的，總體結(jié)果為Ad-p53基因轉(zhuǎn)移作為晚期頭頸部鱗狀細(xì)胞患者的手術(shù)輔助治 療提供了初步支持。對(duì)p53功能異常在瘤增殖和治療抗性中的關(guān)鍵作用理解的進(jìn)展為研發(fā)p53基 因治療用于SCCHN和其他癌癥提供了基本原理(Hartwelland Kastan, 1994 ；Kastan et al. ,1995 ；Edelman and Nemunaitis,2003 ；Ahomadegbe et al. ,1995 ；Ganly et al., 2000 ；Zhang et al. , 1995 ；Clayman et al. , 1995 ；Clayman et al. , 1998 ；Clayman et al. , 1999 ；Swisher et al. , 1999 ；Nemunaitis et al. ,2000 ；Peng, 2005) 例如，Advexin (Ad5CMV-p53, INGN 201)含有復(fù)制缺陷的腺病毒類型5載體，所述載體含有正常 的P53瘤抑制基因作為其治療性成份。然而，盡管基因治療是成功的，但目前仍不清楚為什么有些患者對(duì)p53和其他療 法有反應(yīng)而其他患者則沒有。這仍然需要確定將最受益于這種治療的具體的患者亞群。幾個(gè)臨床上影響治療反應(yīng)和存活期的預(yù)后因子已在患有復(fù)發(fā)的SCCHN的患者中 得到鑒定(Argiris et al.，2004 ；Pivot et al.，2001 ；Recondo et al.，1991)。近來分子 生物標(biāo)記物更多地被用于預(yù)測(cè)預(yù)后。然而，關(guān)于使用P53生物標(biāo)記物進(jìn)行預(yù)測(cè)預(yù)后，該領(lǐng) 域以相矛盾數(shù)據(jù)為特征，一些研究表明P53生物標(biāo)記物預(yù)測(cè)結(jié)果的能力(Recondo et al., 1991 ；Gallo et al. ,1995 ；Mulder et al. ,1995 ；Sarkis et al. ,1995 ；Sauteret al., 1995 ；Stenmark-Askmalm et al. ,1995 ；Matsumura et al. ,1996 ；McKaig et al. ,1998 ； Nemunaitis et al.，1991)，而另一些研究表明p53生物標(biāo)記物不預(yù)測(cè)患者結(jié)果(Kyzas et al.，2005)。事實(shí)上，頭頸癌癥中的最大研究之一，結(jié)合涉及3388個(gè)患者的42項(xiàng)研究結(jié)果 的綜合分析表明P53生物標(biāo)記物狀態(tài)和臨床結(jié)果之間沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(Kyzas et al.，2005)。因此，需要合適地定義能更可靠地預(yù)測(cè)患者結(jié)果的p53生物標(biāo)記物表達(dá)譜，來指 導(dǎo)現(xiàn)行治療方法的適當(dāng)使用，并評(píng)估新治療方法的功效。

發(fā)明內(nèi)容
因此，根據(jù)本發(fā)明，這里提供預(yù)測(cè)患瘤的人受試者對(duì)p53基因治療的有利反應(yīng)的 方法(a)測(cè)定所述瘤的瘤細(xì)胞是否含至少一個(gè)野生型P53等位基因；和/或(b)測(cè)定所述 瘤的瘤細(xì)胞是否以高于表達(dá)正常P53的非瘤細(xì)胞中表達(dá)的水平表達(dá)p53蛋白。在某些方面，本發(fā)明人已測(cè)定所述瘤細(xì)胞(i)含至少一個(gè)野生型p53等位基因，和 /或(ii)表達(dá)不高于表達(dá)正常P53的非瘤細(xì)胞中表達(dá)水平的p53蛋白，和/或(iii)表達(dá) 升高水平的P53蛋白，定義為高于表達(dá)正常p53的非瘤細(xì)胞中表達(dá)的水平，其中所述p53蛋 白不抑制野生型P53的功能，則(i) (iii)中的任一項(xiàng)會(huì)預(yù)測(cè)所述受試者會(huì)對(duì)所述p53 基因治療有有利反應(yīng)。所述P53基因治療可以是包含使用p53基因或p53通路中涉及的基 因的基因治療，例如，Advexin .在某些實(shí)施方式中，如果所述瘤細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)(1)不含至少一個(gè)野生型p53等位基 因，和/或(2)含2個(gè)突變的p53等位基因，和/或(3)以高于由表達(dá)正常p53的正常細(xì)胞 表達(dá)的水平表達(dá)突變的P53蛋白，且所述突變的p53抑制所述野生型p53的功能，例如，具 有完整的四聚化區(qū)域的DNA結(jié)合域上含錯(cuò)意點(diǎn)突變的突變體，則其指示對(duì)所述p53基因治 療的不良反應(yīng)。顯性抑制突變的其他類型為本領(lǐng)域內(nèi)所知，并且其他類型也可通過功能分 析而被鑒定(Resnick et al.，2003)。通過這些顯性失活突變的免疫組織學(xué)測(cè)定的高水平 表達(dá)也可以指示對(duì)治療的不良反應(yīng)。升高的p53水平的評(píng)估可以用多種技術(shù)進(jìn)行，包括通過瘤細(xì)胞中p53的抗體檢測(cè) 來測(cè)量P53蛋白的水平(例如，使用免疫組織化學(xué)(IHC)這些免疫檢測(cè)可檢測(cè))?；蛘?，p53 轉(zhuǎn)錄可以通過(例如)使用定量PCR或RT-PCR而被擴(kuò)增并在細(xì)胞中測(cè)量，來評(píng)估p53的過 表達(dá)或增長(zhǎng)水平。然而，預(yù)計(jì)幾乎任何P53的分析檢測(cè)都可被校正(通過和足量表達(dá)p53的 非瘤細(xì)胞中的P53檢測(cè)比較)以用于本發(fā)明，例如，ELISA、免疫測(cè)定、放射免疫測(cè)定(RIA)、免疫放射測(cè)定、熒光免疫測(cè)定、化學(xué)發(fā)光測(cè)定、生物發(fā)光測(cè)定、凝膠電泳、蛋白印跡分析或原 位雜交測(cè)定。野生型p53等位基因和突變基因結(jié)構(gòu)的存在可以使用原位雜交、RNA印跡或核酸 酶保護(hù)，或者使用各種基于和多種探針雜交的基因分型技術(shù)，例如，測(cè)序、基因陣列或基因 芯片來測(cè)定?；蚪M序列具體在所述瘤的瘤細(xì)胞中擴(kuò)增，所述瘤細(xì)胞可被石蠟包埋。所述瘤可以是良性瘤生長(zhǎng)(例如，良性前列腺增生、口腔白斑、結(jié)腸息肉、食管癌 前生長(zhǎng)或良性病變)。所述瘤可以是癌，比如口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸道癌、泌尿生殖器 癌、胃腸道癌、中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)組織癌、內(nèi)分泌或神經(jīng)內(nèi)分泌癌或造血細(xì)胞癌、神經(jīng)膠 質(zhì)瘤、肉瘤、癌、淋巴瘤、黑色素瘤、纖維瘤、腦膜瘤、腦癌、口咽癌、鼻咽癌、腎癌、膽囊癌、前 列腺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、胰島細(xì)胞癌、李弗勞明瘤、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、垂體瘤、腎上腺瘤、 成骨性肉瘤、I型和II型多發(fā)性神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、乳腺癌、肺癌、頭頸癌、前列腺癌、食管癌、氣 管癌、皮膚癌、腦癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、睪丸癌、結(jié)腸癌、 直腸癌或皮膚癌。例如，瘤可以是鱗狀細(xì)胞癌(SCCHN)，更具體的是復(fù)發(fā)的SCCHN。對(duì)所述治療的有利反應(yīng)可以包括瘤尺寸或負(fù)荷減小、瘤生長(zhǎng)的阻斷、瘤相關(guān)疼痛 減少、瘤相關(guān)病理的減少、瘤相關(guān)癥狀的減少、瘤非進(jìn)行、增加的無病間期、增加的至進(jìn)行時(shí) 間、緩解的誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)移的減少、或增長(zhǎng)的患者存活期?！傲龇磻?yīng)”更具體指瘤生長(zhǎng)控制(瘤生 長(zhǎng)控制(TGC)定義為尺寸上完全(CR)和部分(PR)減小> 50%或病癥穩(wěn)定(SD) ；TGC = CR+PR+SD)或瘤尺寸減小> 10%。在某些實(shí)施方式中，還提供方法，其還被定義為包括下列步驟(a)測(cè)定所述瘤細(xì) 胞是否含2個(gè)野生型p53等位基因；且如果是，則(b)給所述受試者施用p53基因治療。在 另一些實(shí)施方式中，所述方法也可被定義為包括下列步驟(a)測(cè)定所述瘤細(xì)胞是否含至 少一個(gè)野生型P53等位基因，及所述瘤細(xì)胞是否不過表達(dá)p53蛋白；且如果是，則(b)給所 述受試者施用P53基因治療。在另一些實(shí)施方式中，所述方法可以被定義為包括下列步驟 (a)測(cè)定所述瘤細(xì)胞是否不含p53突變等位基因；且如果是，則(b)給所述受試者施用p53 基因治療。在另一些實(shí)施方式中，所述方法可以被定義為包括下列步驟(a)測(cè)定所述瘤細(xì) 胞是否不過表達(dá)P53突變蛋白，所述p53突變蛋白抑制野生型p53的功能；且如果是，則(b) 給所述受試者施用P53基因治療。在另一些實(shí)施方式中，所述方法還被定義為包括下列步驟(a)測(cè)定所述瘤細(xì)胞 是否過表達(dá)P53蛋白，所述p53蛋白不抑制野生型p53的功能；且如果是，則(b)給所述受 試者施用P53基因治療。在另一些實(shí)施方式中，所述方法還被定義為包括下列步驟(a)測(cè) 定所述瘤細(xì)胞是否過表達(dá)突變的P53蛋白，且所述突變的p53抑制野生型p53的功能；且如 果是，則(b)給所述受試者施用p53基因治療之外的治療。在另一些實(shí)施方式中，所述方法 還被定義為包括下列步驟(a)測(cè)定所述瘤細(xì)胞是否不含至少一個(gè)野生型p53等位基因；且 如果是，則(b)給所述受試者施用p53基因治療之外的治療。在另一些實(shí)施方式中，所述方 法還被定義為包括下列步驟(a)測(cè)定所述瘤細(xì)胞是否含2個(gè)突變的p53等位基因；且如果 是，則(b)給所述受試者施用p53基因治療之外的治療。所述其他治療可以是甲氨蝶呤。在某些方面，所述方法還包括第二抗瘤治療。所述第二抗瘤治療可以是手術(shù)治 療、化學(xué)治療、放射治療、冷凍治療、高溫療法、光療法、放射消融治療、激素治療、免疫治療、 小分子療法、受體激酶抑制劑治療和生物治療，如單克隆抗體、siRNA、反義寡核苷酸、核酶或基因治療。所述生物治療可以是基因治療，比如抑癌基因治療，細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)基因治療， 細(xì)胞周期調(diào)控基因治療，細(xì)胞因子基因治療，毒素基因治療，免疫基因治療，自殺基因治療， 前藥基因治療，抗細(xì)胞增殖基因治療，酶基因治療或抗血管生成因子基因治療。所述抑癌基因治療可以是APC、CYLD,HIN-U KRAS2b、pl6、pl9、p21、p27、 p27mt、p53、p57、p73、PTEN、FHIT, Rb、子宮珠蛋白、Skp2、BRCA-U BRCA-2、CHK2、CDKN2A、 DCC, DPC4、MADR2/JV18、MENl、MEN2、MTSl、NFl、NF2、VHL, WRN、WTl、CFTR、C-CAM、CTS-I、 zacl、ras、MMACl、FCC、MCC, FUS1、基因 26 (CACNA2D2)、PL6、β * (BLU)、Luca-I (HYALl)、 Luca-2(HYAL2)、123F2 (RASSFl)、101F6或基因21(NPRL2)。所述促凋亡蛋白治療可以是 mda7、CD95、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、Bax、Bag-I、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak, MKP-7、 PARP, bad, bcl-2、MSTl、bbc3、Sax, BIK或BID。所述細(xì)胞周期調(diào)控治療可以是反義致癌 基因，致癌基因的siRNA、致癌基因單鏈抗體或致癌基因核酶。所述細(xì)胞因子治療可以是 GM-CSF, G-CSF, IL-I α、IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、 IL-IU IL-12、 IL-13、 IL-14、 IL-15、 IL-16、 IL-17、 IL-18、 IL-19、 IL-20、 IL-21、 IL-22、 IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IFN-α、IFN-β、 IFN-γ、MIP-I α、MIP-I β、TGF-β、TNF-α、TNF-β 或 PDGF。所述抗血管生成治療可以是 血管生成抑素、內(nèi)皮抑素、阿瓦斯丁或反義物，siRNA、單鏈抗體、針對(duì)促血管新生因子的核 酶。所述癌細(xì)胞可能有正常的p53基因和/或蛋白結(jié)構(gòu)，或者有異常的p53基因和/ 或蛋白結(jié)構(gòu)。例如，所述P53基因可能生成等同于野生型p53蛋白的p53蛋白。在另一些 實(shí)施方式中，P53蛋白中可存在突變(例如，截短，刪除，置換，反式顯性突變等)。所述p53 基因可能含有至少一個(gè)野生型P53等位基因(例如，呈現(xiàn)正確的啟動(dòng)子，內(nèi)含子，外顯子和 方向)或者所述P53基因可能含有突變的等位基因(例如，錯(cuò)義，刪除，置換，重排等)。在某些實(shí)施方式中，所述基因治療可以通過非病毒載體遞送。所述非病毒載體可 被包封在脂質(zhì)媒質(zhì)中(例如，脂質(zhì)體)。所述媒質(zhì)可以是納米顆粒。所述基因治療可通過病 毒載體遞送(例如，反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、痘病毒載體、多瘤病毒 載體、慢病毒載體、或皰疹病毒載體)。所述p53基因治療可為局部區(qū)域基因治療。所述局部區(qū)域基因治療可包括局部基 因治療。所述局部基因治療可以包括所述瘤的直接注射、瘤血管的注射、區(qū)域性基因治療、 或施用到瘤相關(guān)淋巴管或?qū)Ч軆?nèi)。所述施用可包括腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、囊內(nèi)、或鞘內(nèi)施用。所 述區(qū)域性基因治療可包括施用到與所述瘤相關(guān)的肢的血管系統(tǒng)。某些實(shí)施方式還包括試劑盒，其含p53抗體或探針，其用于檢測(cè)瘤樣品中p53蛋 白的量；及多個(gè)探針，其用于測(cè)定P53基因或轉(zhuǎn)錄物結(jié)構(gòu)。所述試劑盒用于測(cè)定瘤細(xì)胞是否 含有至少一個(gè)野生型P53等位基因和所述瘤的瘤細(xì)胞是否以高于表達(dá)正常p53的非瘤細(xì)胞 中表達(dá)的水平表達(dá)P53蛋白，以此預(yù)測(cè)對(duì)p53基因治療的有利反應(yīng)。本文所述的“p53”是指野生型或突變(例如，反式顯性，錯(cuò)意等)的P53蛋白。認(rèn)為本文所述的任何方法或組合物都能用于本文所述的任何其他方法或組合物 中。權(quán)利要求和/或說明書中使用的“a”或“an”在與術(shù)語“包含”聯(lián)用時(shí)意為“一種/ 一個(gè)”，但是它也要和“一個(gè)或多個(gè)/ 一種或多種”或“至少一個(gè)/至少一種”的意思一致。 術(shù)語“約”通常意味這設(shè)定數(shù)值士5%。權(quán)利要求中使用的術(shù)語“或”用于表示“和/或”，除 非明確指示只涉及兩者中的一個(gè)或兩者是相互排斥的，即使公開支持的定義只是指二者選 其一和“和/或”。本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征和優(yōu)勢(shì)將在下列詳細(xì)描述中變的清晰。然而，應(yīng)知道所述 的詳細(xì)描述和特定的實(shí)施例(雖然指示本發(fā)明具體的實(shí)施方式)僅是以說明的方式給出， 因?yàn)橥ㄟ^此詳細(xì)描述，涵蓋在本發(fā)明精神和范圍之內(nèi)的各種變化和修飾對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員 而言是顯而易見的。


下列附圖形成本說明書的一部分，并被包括用于進(jìn)一步展示本發(fā)明的某些方面。 通過參考一個(gè)或多個(gè)這些附圖，并結(jié)合本文的具體實(shí)施方式
的詳細(xì)描述，本發(fā)明可以被更 好地理解。圖ι. Advexin 的作用機(jī)制圖2.對(duì)Advexin 治療的抗瘤反應(yīng)譜圖3.實(shí)施Advexin 治療后李弗勞明瘤的衰老/穩(wěn)定疾病反應(yīng)。對(duì)李弗勞明瘤 患者骨盆瘤進(jìn)行pet掃描，顯示Advexin 治療后注射的瘤(箭頭)完全緩解。伴隨的 CT掃描表明穩(wěn)定的病癥而沒有瘤的減小。臨床上，瘤反應(yīng)和減少的骨盆痛和下肢水腫相伴 (Senzer,2007)。圖4.實(shí)施Advexin 治療后復(fù)發(fā)的頭頸部瘤的凋亡/瘤減小反應(yīng)。對(duì)復(fù)發(fā)的 SCCHN患者進(jìn)行CT掃描，顯示Advexin 治療后注射的瘤(箭頭)尺寸的減小和完全緩解。圖5. Advexin 單一治療-ιττ群Τ301后，瘤生長(zhǎng)控制和增長(zhǎng)的存活期的相關(guān) 性圖6. Advexin 單一治療-ιττ群Τ201后，瘤生長(zhǎng)控制和增長(zhǎng)的存活期的相關(guān) 性圖7. Advexin 單一治療-ιττ群Τ301+Τ201后，瘤生長(zhǎng)控制和增長(zhǎng)的存活期的 相關(guān)性圖8. Advexin 單一治療-ιττ群T301+T201后，瘤減小彡10%和增長(zhǎng)的存活 期的相關(guān)性圖9. Advexin 單一治療-ITT群Τ301+Τ201后，瘤減小彡50%和增長(zhǎng)的存活 期的相關(guān)性圖10. ρ53失活機(jī)制和相應(yīng)的ρ53測(cè)序和免疫組織化學(xué)生物標(biāo)記物表達(dá)譜。圖11.由mdm-2/4的野生型P53的失活被Advexin 治療逆轉(zhuǎn)。具有野生型 P53序列的瘤中，通過上調(diào)p53抑制因子mdm-2和mdm_4，正常的內(nèi)源性p53被失活。通過 Ach^xin 提供的正常p53的增加水平能逆轉(zhuǎn)mdm-2/4的抑制。圖12.大多數(shù)p53突變?cè)贒NA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中。圖13. DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域突變通過形成不會(huì)結(jié)合DNA的四聚物而使p53失活。圖14.突變的p53的低水平表達(dá)是對(duì)Advexin 功效有利的p53生物標(biāo)記物表達(dá)譜。圖15.突變的p53的高水平表達(dá)是對(duì)Advexin 功效不利的顯性抑制p53生物 標(biāo)記物表達(dá)譜。圖16.具有阻斷的P53瘤抑制的患者群。圖17.復(fù)發(fā)的SCCHN癌癥(T301)中對(duì)Advexin 功效有利和不利的p53表達(dá)譜 預(yù)示Advexin 存活益處。有利的-高水平的野生型p53 ；低水平的突變的P53 ；低水平 的野生型P53。不利的-高水平突變的p53。圖18.復(fù)發(fā)的SCCHN癌癥(T301+T201)中對(duì)Advexin 功效有利和不利的p53 表達(dá)譜預(yù)示Advexin 存活益處。有利的-高水平的野生型p53 ；低水平的突變的P53 ； 低水平的野生型P53。不利的-高水平突變的P53。圖19.復(fù)發(fā)的SCCHN癌癥中對(duì)Advexin 功效有利和不利的p53表達(dá)譜不預(yù)示 甲氨喋呤的結(jié)果。有利的-高水平的野生型P53 ；低水平的突變的P53 ；低水平的野生型 P53。不利的-高水平突變的p53。圖20.復(fù)發(fā)的SCCHN癌癥(T301)中對(duì)Advexin 功效有利和不利的p53表達(dá)譜 預(yù)示Advexin 存活益處。有利的-高水平的野生型p53 ；低水平的突變的P53 ；低水平 的野生型P53。不利的-高水平突變的p53。圖21.復(fù)發(fā)的SCCHN癌癥中甲氨喋呤對(duì)具有對(duì)Advexin 功效不利的p53表達(dá) 譜的患者是有效的。有利的-高水平的野生型P53 ；低水平的突變的p53 ；低水平的野生型 P53。不利的-高水平突變的p53。實(shí)施方式I.本發(fā)明如本文所討論，在臨床水平上的基因治療研究已經(jīng)超過了十年，包括大量癌癥治 療試驗(yàn)?？傮w而言，隨著超過傳統(tǒng)治療方法的益處的增多，該方法的成功是有希望的。然而， 就大部分抗癌治療而言，仍實(shí)質(zhì)需要改善那些最可能受益于基因治療或其他治療功效的患 者群的鑒定。以前的p53生物標(biāo)記物表達(dá)譜的評(píng)估不足以完全預(yù)測(cè)所述治療反應(yīng)或預(yù)后，因?yàn)?它們不能鑒別具有功能的正常P53蛋白的所有情況，而這是預(yù)測(cè)和預(yù)后測(cè)定的關(guān)鍵。之前 的申請(qǐng)偏離本發(fā)明的教導(dǎo)，前者通?？紤]檢測(cè)異常升高的P53蛋白或p53基因突變，但不包 括把有功能的正常P53蛋白作為預(yù)測(cè)或預(yù)后標(biāo)記物。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)p53表達(dá)量和基 因突變狀態(tài)的正確組合和應(yīng)用是鑒別正常功能的P53蛋白的存在來預(yù)測(cè)p53基因治療的治 療反應(yīng)所必需的。這一意外結(jié)果指示了為什么先前利用P53免疫組織化學(xué)或測(cè)序分析的嘗 試會(huì)產(chǎn)生相矛盾的結(jié)果，這些結(jié)果和這些P53生物標(biāo)記物表達(dá)譜能否常規(guī)地預(yù)測(cè)治療反應(yīng) 和預(yù)后相關(guān)。這里，本發(fā)明人提供使用p53生物標(biāo)記物表達(dá)譜組合來預(yù)測(cè)患者對(duì)癌癥治療的有 利反應(yīng)或程度的方法。在具體的實(shí)施方式中，所述癌癥治療是基因治療，例如，Advexin 治療之類的腺病毒P53基因治療。Α. p53瘤生物標(biāo)記物表達(dá)譜預(yù)測(cè)對(duì)P53基因治療的反應(yīng)本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)所述下列瘤生物標(biāo)記物組合通常預(yù)測(cè)有利反應(yīng)和預(yù)后結(jié)果(1)高 水平的正常P53蛋白(例如，對(duì)野生型p53序列免疫組織化學(xué)呈陽性)；( 低水平的p53蛋白(免疫組織化學(xué)陰性)伴隨檢測(cè)出至少一個(gè)正常等位基因和一個(gè)異常的P53基因序 列(當(dāng)存在一個(gè)正常的P53等位基因和一個(gè)異常的等位基因時(shí)可以觀測(cè)到免疫組織化學(xué)陰 性，報(bào)道于Trkova等人000；3))?；? 低水平的正常p53蛋白(對(duì)野生型p53序列免疫 組織化學(xué)呈陰性)。這些生物標(biāo)記物表達(dá)譜中的每一個(gè)通常都定義這一情況，即正常的P53 基因可能被活化。就這一點(diǎn)而言，將導(dǎo)致正常的P53基因表達(dá)上升的p53基因治療將有助 于治療功效，并克服由下文所述的MDM2、MDM4類抑制物或p53顯性抑制突變蛋白的低水平 表達(dá)介導(dǎo)的P53失活。用復(fù)制缺陷型腺病毒載體單獨(dú)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞也可以在含有野生型p53基 因的細(xì)胞中誘導(dǎo)野生型P53的表達(dá)(Mcpake et al.，1999)。正常的p53基因結(jié)構(gòu)被定義為等同于在表達(dá)p53的非瘤正常細(xì)胞中的p53基因結(jié) 構(gòu)的P53基因結(jié)構(gòu)。野生型p53等位基因具有和p53非瘤正常細(xì)胞中的p53基因相同的 DNA序列。p53蛋白升高的水平或p53的過表達(dá)被定義為高于表達(dá)正常p53的非瘤細(xì)胞中 表達(dá)水平的水平。P53蛋白的正常水平被定義為不高于正常p53的非瘤細(xì)胞中表達(dá)水平的 水平。1.升高的D53水平和if常的D53某因預(yù)示有利反應(yīng)高水平的p53表達(dá)組合正常的p53基因型(由野生型p53等位基因組成)指示 存在高水平的正常的P53。已知這些瘤中很多具有升高水平的抑制p53活性的MDM2或 MDM4 (Valentin-Vega et al. ,2007) 然而，Valenitn-Vega 等人 Q007)并沒教導(dǎo)這一情 況和任何有利的預(yù)后益處相關(guān)，而只有本發(fā)明教導(dǎo)了這一點(diǎn)。本發(fā)明表明當(dāng)這些瘤暴露于 治療劑，這些制劑誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)并進(jìn)而上調(diào)P53表達(dá)或者遞送額外的如同Advexin 的 野生型P53，或者下調(diào)如同nutlins的P53抑制物，所述抑制被克服，并且瘤抑制通路隨后被 激活，引起治療功效和治療反應(yīng)，例如瘤尺寸的減小等。2.低水平的p53和ιΗ常的p53基因預(yù)示有利反應(yīng)在p53的免疫組織化學(xué)評(píng)估揭示具有正常的p53基因序列(由野生型p53等位基 因構(gòu)成)的低表達(dá)時(shí)會(huì)出現(xiàn)類似的情況。這些瘤或者沒有P53缺陷或者它們也許有上調(diào)的 類似MDM2或MDM4的p53抑制物或者可能有其他阻斷p53的方法(Valentin-Vega et al.， 2007)。然而，Valenitn-Vega等人Q007)沒有教導(dǎo)這一情況和任何有利的預(yù)后益處相關(guān)， 而只有本發(fā)明由此教導(dǎo)。在具有低水平正常的p53蛋白表達(dá)譜的患者中，施用野生型p53 和/或施用引起P53應(yīng)激反應(yīng)的上調(diào)或如同nutlins的p53抑制物引起下調(diào)的p53基因治 療，相對(duì)于它的抑制劑將增加正常P53的表達(dá)，并克服所述p53抑制物而產(chǎn)生治療的瘤抑制 效應(yīng)。3.低P53水平和異常的p53基因預(yù)示有利反應(yīng)Poeta(2007), Olivier (2006) ^P Soussi (2006)教導(dǎo)突變的 p53 基因(能夠抑制 正常的P53的活性)的存在是預(yù)測(cè)不良臨床結(jié)果的一種情況。這些事例中普遍在具有完 整四聚化結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合域上有p53突變，導(dǎo)致突變的p53能夠結(jié)合正常的p53并使其 失活。這些突變被稱作顯性抑制P53突變或失活或阻斷突變。然而，他們單獨(dú)存在(如通 過基因測(cè)序方法檢測(cè))不足以正確地預(yù)測(cè)結(jié)果，這報(bào)道于Poeta(2007)、01ivieH2006)和 Soussi (2006)，由于它們沒有考慮這些抑制蛋白的水平，而這些蛋白能使另一個(gè)正常的p53 等位基因(當(dāng)它存在時(shí))失活。除了這些失活或顯性抑制突變的存在，其表達(dá)水平對(duì)確定 其對(duì)正常p53的影響而言是重要的。本發(fā)明公開，如果存在p53蛋白的低水平表達(dá)，失活的P53突變的存在與對(duì)p53治療的不良反應(yīng)無關(guān)。Trkova等人^00 已經(jīng)報(bào)道了具有突變的p53序列和通過免疫組織學(xué)評(píng)估的低 P53水平的患者經(jīng)常含有另一個(gè)正常的p53基因。然而，Trkova等人Q003)沒有教導(dǎo)這一 情況和任何有利的預(yù)后益處有關(guān)，而這僅在本發(fā)明中公開。4.高D53水平和異常的d53基因如上文所述，僅存在突變的p53基因不足以預(yù)測(cè)對(duì)癌癥治療的不良的臨床反應(yīng)。 本發(fā)明公開了那些允許還是阻止正常的P53功能的情況是通過p53量和基因測(cè)序分析的組 合得到的P53生物標(biāo)記物表達(dá)譜進(jìn)行預(yù)測(cè)和預(yù)后應(yīng)用的關(guān)鍵因素。如果這些p53突變以高 水平表達(dá)，并且是能抑制正常的P53功能的阻斷突變，即使存在野生型p53基因，例如具有 完整四聚化結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合域的顯性抑制突變導(dǎo)致突變的p53能夠結(jié)合正常的p53并使 其失活，這些情況更可能和P53基因治療的不良反應(yīng)有關(guān)，因?yàn)橥ㄟ^治療引進(jìn)或誘導(dǎo)的正 常P53功能被高水平的損壞性p53突變阻斷。這些突變類型(具有完整四聚化能力的DNA 結(jié)合域上的錯(cuò)意突變)約占了 p53突變的80%，并且當(dāng)瘤細(xì)胞中這些突變的p53基因編碼 的P53蛋白以高水平表達(dá)時(shí)，它們將和對(duì)治療的不良反應(yīng)有關(guān)。然而，在表達(dá)高p53和突變的p53的瘤細(xì)胞中，如果這些突變不是抑制野生型p53 功能的突變，例如，截短的四聚化結(jié)構(gòu)域的突變導(dǎo)致突變的P53不能結(jié)合正常的p53而使其 失活，這些瘤細(xì)胞能對(duì)P53基因治療產(chǎn)生有利反應(yīng)?？傮w而言，和上述p53生物標(biāo)記物表達(dá)譜分析相比，所有以前的p53生物標(biāo)記物 評(píng)估方法(Kyzas et al.，2005 ；George et al.，2007 ；Olivier et al.，2006 ；Geisler et al. ,2002 ；Poeta et al. ,2007 ；Soussi et al.，2006)都僅教導(dǎo)部分識(shí)別所述關(guān)鍵因素， 這些因素需要一致并特異地預(yù)測(cè)治療結(jié)果。所有那些單獨(dú)依靠免疫組織化學(xué)(Geisler et al.，2002)或單獨(dú)依靠基因測(cè)序分析(Poeta et al.，2007，Soussi et al.，2006，Olivier et al. ,2006)的方法錯(cuò)失了重要的關(guān)于正常或異常p53蛋白存在或水平的信息，而這些信 息正是正確預(yù)后或預(yù)測(cè)決定的關(guān)鍵。組合P53免疫組織化學(xué)和基因測(cè)序分析的研究(Kyzas et al.，2005 ；Georgeet al.，2007)也組合了不足、不完全或者不正確地得出關(guān)于這些評(píng)估 的預(yù)測(cè)能力的錯(cuò)誤結(jié)論的信息。例如，George等人Q007)沒有教導(dǎo)在他們的p53免疫組織學(xué)和p53測(cè)序分析的 應(yīng)用中有功能的P53基因/蛋白存在的重要性。他們涵蓋了最好的預(yù)后種類中具有外顯子 5p53蛋白突變的高、低水平表達(dá)的患者。他們忽略了突變的外顯子5p53蛋白的表達(dá)水平， 并像維護(hù)那些具有正常P53基因構(gòu)型的患者一樣維護(hù)具有外顯子5p53突變的患者。具有 突變的外顯子5p53蛋白高水平表達(dá)的患者的不良預(yù)后是不可根據(jù)George等人Q007)的 教導(dǎo)預(yù)期或預(yù)測(cè)的，他們認(rèn)為所有外顯子5突變的情況都有良性預(yù)后，無論他們的p53表達(dá) 水平。在P53的臨床實(shí)驗(yàn)中，這些表達(dá)高水平的外顯子5p53突變蛋白的患者中沒有一個(gè)對(duì) 治療有反應(yīng)，并且他們的中位值存活期近似于那些在其他DNA結(jié)合域外顯子具有反式顯性 抑制突變的P53突變的患者的中位值存活期。George等人Q007)的研究的大部分情況中， 外顯子5突變體有p53蛋白低水平表達(dá)，當(dāng)其反映低水平異常的p53突變蛋白時(shí)，他們卻錯(cuò) 誤地稱之為野生型。在他們的研究中，這些情況被綜合用于分類，更少數(shù)高表達(dá)突變的外顯 子5p53蛋白的情況沒有顯著改變有利預(yù)后組的中位值存活期，他們是通過綜合所有這些 情況所確定的有利預(yù)后組，甚至大量患者具有正常水平的正常P53蛋白。因此，George等人Q007)沒有教導(dǎo)該識(shí)別表達(dá)譜的重要性，其中正常的p53是無功能的，沒有教導(dǎo)由可使 正常P53失活的外顯子5突變(如果存在)的p53反式顯性抑制失活的p53蛋白的高水平 的重要性。這些結(jié)論還沒有被了解或結(jié)合已有文獻(xiàn)中推導(dǎo)出來，這可以由先前的研究沒有利 用或定義正確的組合來證明。本發(fā)明公開了正確和合適的蛋白表達(dá)和基因測(cè)序組合來鑒定 有利和不利的P53表達(dá)譜，根據(jù)那些允許或阻止正常的p53功能的情況，如本文所述這些情 況是P53生物標(biāo)記物表達(dá)譜預(yù)測(cè)和預(yù)后應(yīng)用的關(guān)鍵因素。B. iS徹053 瞧辦陳汰終_哈俯傭白如53#·示適胃汰譜1平fe1.D53基因結(jié)構(gòu)的測(cè)定p53，最為了解的瘤抑制物，約390個(gè)氨基酸的磷蛋白，能在細(xì)分為5個(gè)結(jié)構(gòu)域 N-端轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(TAD)，其激活轉(zhuǎn)錄因子；富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域，其對(duì)p53凋亡活性是 重要的；結(jié)合中央DNA的核心結(jié)構(gòu)域(DBD)，其含有一個(gè)鋅原子和幾個(gè)精氨酸(由外顯子 5 8編碼)；同型寡聚化(四聚化)結(jié)構(gòu)域(OD)，四聚化是體內(nèi)p53活性所必要的；C-端， 其涉及所述中央結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合的下調(diào)。p53位于細(xì)胞的細(xì)胞核并且非常不穩(wěn)定。損壞DNA的制劑通過翻譯后機(jī)制誘導(dǎo)p53 變的非常穩(wěn)定，使其在細(xì)胞核的濃度顯著增加。在響應(yīng)DNA損傷的反應(yīng)中p53抑制進(jìn)程貫 穿整個(gè)細(xì)胞周期，因此允許在基因組復(fù)制之前發(fā)生DNA修復(fù)。因此，p53通過起始凋亡來阻 止損壞的遺傳信息從一代細(xì)胞到下一代細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，如果對(duì)細(xì)胞的損壞是嚴(yán)重的。如前文所述，p53的突變能夠引起細(xì)胞發(fā)生致癌性轉(zhuǎn)變，并且轉(zhuǎn)染研究已經(jīng)表明 P53起瘤抑制物的作用，能在體外恢復(fù)癌細(xì)胞正常生長(zhǎng)的部分水平。p53是轉(zhuǎn)錄因子，并且 一旦活化，它能夠抑制幾個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，這幾個(gè)基因涉及刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，并刺激參與細(xì)胞周 期調(diào)控的其他基因的表達(dá)。使癌癥中p53失活的突變通常發(fā)生在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。大部分這些DNA結(jié)合突變 脫離完整的四聚化結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能和野生型P53分子四聚化，并且抑制異源四聚體結(jié) 合其靶DNA序列的能力，因而在下游基因的轉(zhuǎn)錄活化中阻斷正常p53的功能。因此具有DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域突變(能和正常的P53寡聚化的突變)的p53對(duì)p53的功能有顯性抑制突變效 應(yīng)。具有顯性抑制效應(yīng)的突變也可以用下文描述的功能分析加以證實(shí)。在某些方面，因此有升高水平的p53的細(xì)胞是那些有p53錯(cuò)意突變、反式顯性突變 和功能獲取突變的細(xì)胞(e. g.，de Vries et al.，2002)，這些突變導(dǎo)致p53的過表達(dá)或p53 降解的下降。本發(fā)明人預(yù)計(jì)具體在患有高水平表達(dá)突變的P53蛋白的患者中，對(duì)于給定的 P53過表達(dá)細(xì)胞，當(dāng)用腺病毒p53轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，將不容易產(chǎn)生足夠的野生型p53來清除獲得功能 的內(nèi)源性P53或反式顯性等位基因的過表達(dá)效應(yīng)，因此所述患者很可能是對(duì)p53基因治療 的不利反應(yīng)者，其中所述突變的P53蛋白抑制野生型p53的功能，例如在外顯子5 8DNA 結(jié)合核心結(jié)構(gòu)域和完整的四聚化結(jié)構(gòu)域上有錯(cuò)意突變或反式顯性突變的p53。不利反應(yīng)的 類似預(yù)測(cè)應(yīng)用于不含野生型P53等位基因或含2個(gè)突變的p53等位基因的瘤細(xì)胞。對(duì)于被 預(yù)言對(duì)P53基因治療有不利反應(yīng)的患者，本發(fā)明可以提供方法，包括給所述患者施用p53治 療之外的治療，比如甲氨喋呤。在某些其他方面，含至少野生型p53等位基因的細(xì)胞和/或沒有高水平的阻斷或 抑制突變的P53的細(xì)胞將可能對(duì)p53基因治療產(chǎn)生有利反應(yīng)，正如通過p53生物標(biāo)記物表達(dá)譜預(yù)測(cè)的那樣。結(jié)合用于導(dǎo)入外源性野生型P53的p53基因治療和腺病毒載體在內(nèi)源性 野生型P53誘導(dǎo)上的效應(yīng)，將增加細(xì)胞中野生型p53的產(chǎn)量，并克服那些情況中的缺陷。為了在瘤組織中檢測(cè)p53基因結(jié)構(gòu)，分離和評(píng)估瘤樣品來說明可能存在于這些組 織中的正常細(xì)胞的存在是有幫助的。濃縮組織制備瘤細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域內(nèi)所知。例如， 組織可以分離自已被染色的石蠟包埋切片或冷凍切片，并用顯微鏡評(píng)估來測(cè)定瘤細(xì)胞的優(yōu) 勢(shì)。癌細(xì)胞也可以用流式細(xì)胞術(shù)從正常的細(xì)胞中分離出來。這些和其他用于從正常細(xì)胞中 分離瘤細(xì)胞的技術(shù)為本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。如果瘤組織被正常細(xì)胞高度污染，通過測(cè)序技術(shù)和利用樣品核酸序列的PCR擴(kuò)增 的芯片陣列仍容易達(dá)到突變的檢測(cè)。樣品中正常細(xì)胞的存在可使瘤細(xì)胞中正常P53等位基 因的檢測(cè)更加難以辨別?；诩す饧夹g(shù)的顯微解剖系統(tǒng)的最近發(fā)展已經(jīng)大大解決了這一重 要的問題。激光顯微解剖是從染色的自細(xì)胞培養(yǎng)物的甲醛固定的切片、石蠟包埋切片和冰 凍切片，甚至分裂中期細(xì)胞的單個(gè)染色體中分離特定細(xì)胞群(或單個(gè)細(xì)胞)的強(qiáng)有力的工 具。由此產(chǎn)生的物質(zhì)適用于廣泛的下游分析，比如L0H(雜合子丟失)研究，mRNA水平上的 基因表達(dá)分析和多種蛋白組學(xué)方法，比如2D凝膠分析，反向蛋白陣列和SELDI蛋白表達(dá)譜。 單細(xì)胞PCR的應(yīng)用也被預(yù)計(jì)用于避免正常的組織污染。熒光原位雜交(FISH)和單核苷酸多態(tài)性陣列是檢測(cè)瘤細(xì)胞中，甚至在含有瘤細(xì) 胞和正常細(xì)胞混合物的樣品中正常的P53等位基因存在的另外的方法(Yamamoto et al., 2007 ；Ross,et al. ,2007,George etal. ,2007 ；Flotho et al. ,2007 ；Fitzgibbon et al.， 2007 ；Melcher et al. ,2007 ；Purdie et al. ,2007 ；Kawamata et al. ,2008 ；Lindbjerg et al. , 2007 ；van Beers et al. ,2006)。點(diǎn)突變的檢測(cè)可以通過瘤組織中存在的所述p53等位基因的分子克隆和用本領(lǐng) 域內(nèi)所熟知的技術(shù)測(cè)序等位基因來進(jìn)行?；蛘?，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可被用于從瘤組織中制備 的基因組DNA中直接擴(kuò)增p53基因序列。然后所述擴(kuò)增序列的DNA序列可以被測(cè)定。聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)本身為本領(lǐng)域內(nèi)所熟知。參見，例如，Saiki等人(1988)、美國專利No. 4，683，202 和 4，683，195。p53基因的具體缺失或截短也能被檢測(cè)。例如，所述p53基因或附近的標(biāo)記基因的 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)探針能被用于評(píng)估p53等位基因的缺失或部分缺失。檢測(cè) 缺失或截短的其他技術(shù)(為本領(lǐng)域內(nèi)所熟知)也能被使用。或者，錯(cuò)配檢測(cè)能被用于檢測(cè)所述p53基因或它的mRNA產(chǎn)物的點(diǎn)突變。盡管這些 技術(shù)沒有測(cè)序技術(shù)靈敏，但它們能簡(jiǎn)易地用于大量瘤。錯(cuò)配剪切技術(shù)的例子是RNA酶保護(hù) 方法，這詳細(xì)報(bào)道于Winter等人(1985)、Meyers等人(1985)。在類似的方式中，DNA探針能被用于檢測(cè)錯(cuò)配，通過酶剪切或化學(xué)剪切。參見，例 如，Cotton等人(1988)、Shenk等人(1975)?；蛘撸e(cuò)配可被檢測(cè)，通過錯(cuò)配的雙鏈體相對(duì) 于正常的雙鏈體有變異的電泳遷移率。參見，例如，Cariello(1988)。用RNA探針或DNA探 針，所述細(xì)胞mRNA或DNA (可能含有突變)能在雜交之前用PCR擴(kuò)增。已用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的源于瘤組織的p53基因的DNA序列也可以用等位基 因特異性探針篩選到。這些探針是核酸寡聚物，每個(gè)都含有帶有已知突變的P53基因序列 的區(qū)域。例如，一個(gè)寡聚物可能約長(zhǎng)30個(gè)核苷酸，相應(yīng)于所述p53基因序列的一部分。在 P53基因編碼的第175個(gè)密碼子的位置上，所述寡聚物編碼丙氨酸，而不是野生型密碼子纈氨酸。通過使用一系列這樣的等位基因特異性探針，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物能被篩選到以鑒定先前 鑒定的所述P53基因中突變的存在?？蛇M(jìn)行等位基因特異性探針與P53序列在例如尼龍膜 上的雜交。特定探針的雜交指示了瘤組織中有和等位基因特異性探針相同突變的存在。通過各種一系列高分辨率、高通量的微陣列平臺(tái)的發(fā)展和應(yīng)用，瘤細(xì)胞中p53基 因結(jié)構(gòu)變化的鑒定已被促進(jìn)。實(shí)質(zhì)上有兩類陣列；那些攜帶源于克隆的核酸的PCR產(chǎn)物的 陣列(例如，cDNA，BAC，粘粒)和那些使用寡核苷酸的陣列。它們各有優(yōu)缺點(diǎn)，但現(xiàn)在很可 能測(cè)量基因組范圍DNA拷貝數(shù)異常和表達(dá)水平來得到瘤細(xì)胞中缺失、獲得、擴(kuò)增和同一樣 品中過量和不足表達(dá)的基因之間的相關(guān)性。提供瘤中mRNA水平評(píng)估的基因表達(dá)陣列已經(jīng) 引出外顯子特異性陣列，該陣列能鑒定基因表達(dá)水平、選擇剪接事件和mRNA加工改變。寡 核苷酸陣列也被用于詢查貫穿基因組的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)來進(jìn)行連鎖和聯(lián)合研究， 并且這些已被用于定量拷貝數(shù)異常和雜合子的缺失事件。最終DNA測(cè)序陣列將允許染色體 區(qū)域和整個(gè)基因組的再測(cè)序。在本發(fā)明中，基于SNP的陣列和其他基因陣列或芯片被預(yù)計(jì)用于測(cè)定野生型p53 等位基因的存在和突變的結(jié)構(gòu)。單核苷酸多態(tài)性(SNP)指在DNA中的單個(gè)位點(diǎn)的變異，是 基因組中最頻繁的變異類型。例如，估計(jì)人類基因組中存在5百萬 1千萬個(gè)SNPs。由于 SNPs在進(jìn)化歷程和種群內(nèi)是高度保守的，SNPs表達(dá)譜作為優(yōu)秀的用作研究的基因分型標(biāo) 記物。SNP陣列是研究整個(gè)基因組的有效工具。另外，SNP陣列能被用于研究雜合子的缺失(LOH)。LOH是等位基因失衡的形式，該 失衡源于等位基因的完全缺失或一個(gè)等位基因相對(duì)于另一個(gè)等位基因拷貝數(shù)的增加。相較 于其他基于芯片的方法(例如，比較基因組雜交只能檢測(cè)基因組的獲取或缺失)，SNP陣列 有額外的優(yōu)勢(shì)來檢測(cè)由于單親二體(UPD)的拷貝數(shù)中性LOH。UPD中，一對(duì)等位基因或整個(gè) 染色體都來自單親，沒有引起另一親本的等位基因的再復(fù)制(單親=來自父母中一方，二 體=復(fù)制的)。當(dāng)所述野生型等位基因(例如來自母親)是缺失的或取代所述兩個(gè)雜合性 等位基因(例如，來自母親)的拷貝出現(xiàn)時(shí)，在疾病中這種構(gòu)型的發(fā)生可能是病態(tài)的。SNP 陣列的使用在癌癥診斷中有巨大潛能，因?yàn)長(zhǎng)OH是大部分人類癌癥的主要特征。最近基于 SNP陣列技術(shù)的研究已經(jīng)表明不僅實(shí)體瘤(例如，胃癌、肝癌等)而且血液的惡性瘤(ALL、 MDS、CML等)具有高比例的L0H，由于基因組缺失或UPD和基因組獲取。在本發(fā)明中，使用 高密度的SNP陣列來檢測(cè)LOH以允許鑒定等位基因失衡的模式來測(cè)定野生型p53等位基因 的存在(Lips et al.，2005 ；Laiet al.，2007)?，F(xiàn)行p53基因序列和單核苷酸多態(tài)性陣列的例子包括p53基因芯片 (Affymetrix, Santa Clara, CA)、Roche p53Ampli_ 芯 片(RocheMolecular Systems, Pleasanton, CA)、基因芯片定位陣列(Affymetrix，Santa Clara, CA)、SNP 陣列 6. 0 (Affymetrix, Santa Clara, CA)、珠陣列(Illumina，San Diego, CA)等。野生型p53基因的突變也可以基于所述p53基因野生型表達(dá)產(chǎn)物的突變來檢測(cè)。 這些表達(dá)產(chǎn)物包括mRNA和所述p53蛋白產(chǎn)物本身。點(diǎn)突變也可通過直接測(cè)序所述mRNA或 經(jīng)過由mRNA制成的cDNA的分子克隆來檢測(cè)。所述克隆的cDNA序列可以用本領(lǐng)域內(nèi)眾所 周知的DNA測(cè)序技術(shù)測(cè)定。所述cDNA也能通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來測(cè)序?？墒褂脝慰寺】贵w平板，其中涉及p53功能的每一個(gè)表位被單克隆抗體所代表。 當(dāng)所述平板中單克隆抗體結(jié)合的缺失或擾亂可指示所述P53蛋白和p53基因本身的突變改變。突變的P53基因或基因產(chǎn)物也可在身體樣品中檢測(cè)到，比如，血清，糞便或其他體液，例 如尿和唾液。上文所述的用來組織中突變P53基因或基因產(chǎn)物檢測(cè)的相同技術(shù)能用于其他 身體樣品。2.P53蛋白水平的評(píng)估各種患者參數(shù)，包括患者/病史/特征和分子特征(例如，癌性瘤中P53的過表達(dá) 結(jié)合基因結(jié)構(gòu)分析)可被用作預(yù)后因素來預(yù)測(cè)患者對(duì)諸如本發(fā)明中教導(dǎo)的癌癥治療(例 如，腺病毒P53基因治療)的有利的反應(yīng)和程度。增長(zhǎng)的p53蛋白水平的評(píng)估可以是直接的，如在定量免疫組織化學(xué)(IHC)或其他 基于抗體的檢測(cè)中使用(蛋白印跡、FIA、放射免疫檢測(cè)(RIA)、RIP、ELISA、免疫測(cè)定法、放 射免疫法、熒光免疫分析、免疫檢測(cè)，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，生物發(fā)光檢測(cè)，凝膠電泳)，或者是間 接的，通過定量這些基因的轉(zhuǎn)錄物(原位雜交、核酸保護(hù)、RNA印跡或PCR，包括RT-PCR)。關(guān)于免疫組織學(xué)，正常細(xì)胞以低水平表達(dá)p53，所述低水平指當(dāng)在光學(xué)顯微鏡下觀 測(cè)時(shí)，在小部分細(xì)胞中也不存在僅僅微弱的染色。在大部分所述瘤細(xì)胞中可視的細(xì)胞核染 色的檢出指示著升高的、過表達(dá)的，高水平P53蛋白的狀態(tài)。雖然不旨在受任何特定的理論束縛，本發(fā)明人提出，當(dāng)瘤細(xì)胞表現(xiàn)出比肩于正常 體細(xì)胞中的升高水平(比如升高的水平)的P53蛋白時(shí)，指示著所述p53瘤抑制通路中存 在功能障礙，該通路是調(diào)控響應(yīng)基因突變的細(xì)胞凋亡反應(yīng)的關(guān)鍵通路。本發(fā)明人假定當(dāng)通 路中的某些連接點(diǎn)存在缺陷時(shí)，升高的P53水平反映了這一缺陷自身的存在。例如，已知當(dāng) p53本身有缺陷(尤其在DNA結(jié)合域)(即產(chǎn)生“突變的”p53)時(shí)，并且這一缺陷產(chǎn)生功能 異常的P53蛋白，該蛋白能和正常的p53蛋白四聚化，但不能結(jié)合DNA，正常p53蛋白的功 能被阻斷。相對(duì)于見于正常細(xì)胞中功能異常的蛋白，所述細(xì)胞過表達(dá)這些蛋白，徒勞地試圖 達(dá)到P53蛋白功能的“正?！彼?。此外，和能表達(dá)功能水平的抑制瘤生長(zhǎng)的正常p53的細(xì) 胞相比，具有高水平的突變的能阻斷正常P53功能的突變的p53的瘤細(xì)胞將具有選擇優(yōu)勢(shì)。 另外，在某些情況中，突變的P53蛋白也比野生型p53不易被降解或從細(xì)胞中清除，促使所 述細(xì)胞中明顯增加的P53含量。已知升高水平的p53標(biāo)志著所述p53瘤抑制通路的異常，并且與SCCHN癌中不良 預(yù)后有關(guān)(Geisler et al. ,2002)；然而，本發(fā)明公開了單以增長(zhǎng)的p53蛋白水平不足以預(yù) 測(cè)對(duì)癌癥治療的反應(yīng)。在某一具體實(shí)施方式
中，相較于正常的表達(dá)P53的非瘤組織，由于高 水平的能阻斷正常野生型P53功能的突變蛋白，p53升高水平的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)提 供對(duì)P53基因治療更可能有不利反應(yīng)的整體預(yù)測(cè)。的確，預(yù)計(jì)這一關(guān)系將在基因治療事例 或通常誘導(dǎo)P53介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)的其他藥物中被很好地證明。本發(fā)明人也提出具有升高的P53蛋白的瘤亞群更可能為有利的反應(yīng)者。當(dāng)缺陷發(fā) 生在通路中任何一處時(shí)(例如，在通路中p53蛋白的上下游基因或基因元件中)，該缺陷也 能導(dǎo)致通路的擾亂，并因而導(dǎo)致p53蛋白升高，再次推測(cè)為由于細(xì)胞試圖彌補(bǔ)合適的p53通 路活性的缺失或降低。的確，盡管事實(shí)上所有正常的體細(xì)胞都以幾乎不可檢測(cè)的水平表達(dá) P53蛋白(例如，只能用極其靈敏的技術(shù)檢測(cè)，比如，RT-PCR)，但是已發(fā)現(xiàn)定義的瘤亞群具 有升高的P53蛋白，即使存在野生型p53等位基因或正常的p53基因結(jié)構(gòu)。在該情況中，p53 功能經(jīng)常被升高表達(dá)的如分子MDM2和MDM4之類的p53抑制物抑制。在這些具有升高的正 常P53蛋白的瘤細(xì)胞中，刺激p53應(yīng)激反應(yīng)的治療能有利地改變正常p53相對(duì)于p53抑制物水平的比例，引起正常P53活性的恢復(fù)和對(duì)治療的有利反應(yīng)。在缺乏任何正常p53的瘤 或突變的P53已阻斷如本發(fā)明中所述的反式顯性效應(yīng)的瘤中，正常的p53功能將不受影響， 并且這些瘤將不易對(duì)p53基因治療起有利反應(yīng)，所述基因治療通過p53依賴性通路(p53依 賴性凋亡、衰老或細(xì)胞周期停滯)的活化發(fā)揮其作用。有利反應(yīng)者的另一種情況可用具有截短的四聚化結(jié)構(gòu)域的升高的P53蛋白的瘤 細(xì)胞例示。這些突變的蛋白不能和野生型P53蛋白四聚化來干擾它們的DNA結(jié)合，因此這 些突變不能抑制野生型P53蛋白的功能。當(dāng)另一個(gè)正常的p53等位基因存在或當(dāng)外源性施 用的正常的P53被遞送到瘤時(shí)，這些瘤將對(duì)p53治療起有利反應(yīng)。檢測(cè)這些瘤抑制物(比如ρ5!3)的“升高水平”的最普遍和方便的方式選擇這種技 術(shù)，該技術(shù)對(duì)反映和檢測(cè)所述通常見于癌細(xì)胞的蛋白水平足夠靈敏，但對(duì)那些通常見于正 常體細(xì)胞的蛋白水平不足夠靈敏。免疫組織化學(xué)染色(“IHC”)技術(shù)包括一系列可應(yīng)用的 能被用于檢測(cè)“升高水平”的Ρ53的例示檢測(cè)技術(shù)，并且因此特別適用于本發(fā)明(參見例如 Ladner et al.，2000)。方便地，IHC技術(shù)通常不能足夠靈敏地檢測(cè)少量產(chǎn)生的p53蛋白， 例如在正常的體細(xì)胞中，因此通常用于檢測(cè)P53蛋白的升高水平。實(shí)踐中結(jié)合本發(fā)明的特 殊的優(yōu)勢(shì)在于，P53蛋白的IHC檢測(cè)將通常不能分辨野生型和突變或異常的p53蛋白(特 別在本發(fā)明的情況中，由于下方的抗體可被選擇來檢測(cè)大部分突變或者正常的P53蛋白)。 在這些情況中，P53基因序列和拷貝數(shù)的同時(shí)檢測(cè)被組合用來測(cè)定所述患者是否對(duì)p53基 因治療有P53表達(dá)譜有利或不利反應(yīng)。然而，本發(fā)明自然決不限于IHC技術(shù)的使用來鑒定和選擇患有瘤的患者，這些患 者具有升高的P53蛋白水平或p53通路中其他可測(cè)量的缺陷，因而本發(fā)明預(yù)期使用任何能 辨別表現(xiàn)正常和異常的P53表達(dá)的細(xì)胞的技術(shù)。例子將包括檢測(cè)技術(shù)，這些檢測(cè)技術(shù)已合 適地用于辨別P53mRNA表達(dá)和/或p53蛋白翻譯水平的正常和異常水平。這些方法包括 (除了 P53蛋白的免疫學(xué)檢測(cè))核酸雜交技術(shù)，例如，基因陣列和芯片，用于檢測(cè)mRNA水平 的差異，因此可以用于辨別p53mRNA水平。已知例示正常細(xì)胞和瘤細(xì)胞(以細(xì)胞系的形式) 通常含有P53蛋白正常的或升高的水平，所述細(xì)胞包括諸如WI-38、CCD16和MRC-9，細(xì)胞系 諸如SCC61、SCC173和SCC179，獲得于普通提供者，比如ATCC和其他。如前文所述，本發(fā)明公開了 p53治療，具體的是腺病毒p53治療，可能在癌癥患者 亞群中起有利作用，這些患者具有升高的野生型P53水平及缺乏具有阻斷活性的p53突變 的高水平表達(dá)。相反，具有升高的阻斷野生型P53蛋白的p53蛋白的瘤細(xì)胞對(duì)p53治療有 不良反應(yīng)。這一分類綜合考慮了蛋白水平、基因序列和基因拷貝數(shù)，提供了在升高的蛋白存 在時(shí)治療反應(yīng)者的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，而不是僅僅依靠升高的蛋白水平或單獨(dú)突變分析的不完全的 預(yù)后。3.突變的P53功能的鑒定能抑制野生型p53基因功能的突變能通過篩選野生型p53蛋白功能的缺失而被檢 出。盡管所述P53蛋白確實(shí)具有的所用功能仍待闡明，至少DNA結(jié)合功能是已知的。例如， P53蛋白結(jié)合SV40大的T抗原和腺病毒ElB抗原或其他知道的靶DNA序列。對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)熟 練地技術(shù)人員而言，傳統(tǒng)的方法可被用于檢測(cè)P53蛋白結(jié)合能力的缺失，所述結(jié)合能力可 結(jié)合任一或全部這些抗原或其他靶DNA，即使存在野生型p53蛋白，這指示著所述蛋白的突 變變化，反映了其基因的突變變化，可能通過和野生型P53四聚化來阻斷野生型p53的功能并阻止結(jié)合靶DNA。過去十年中，實(shí)驗(yàn)性的功能檢測(cè)也被用于為本領(lǐng)域內(nèi)熟練的技術(shù)人員熟知的酵母 和人類細(xì)胞，來測(cè)量P53突變蛋白的各種性能，包括突變蛋白對(duì)位于p53反應(yīng)元件控制之 下的報(bào)告基因的反式激活活性；高于野生型蛋白的顯性抑制效應(yīng)；細(xì)胞周期停滯或凋亡的 誘導(dǎo)；溫度感受性；獨(dú)立于或和野生型蛋白無關(guān)的突變蛋白的活性。最近，源于這些功能檢 測(cè)的結(jié)果已經(jīng)通過萬維網(wǎng)p53. iarc. fr/被整合到國際癌癥研究署(IARC)的TP53數(shù)據(jù)庫。 該數(shù)據(jù)庫提供結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和研究P53突變模式的分析工具(Peitjean et al. ,2007 ；Resnick and hgadOO； )。這些方法可用于鑒定那些p53突變，這些p53突變能發(fā)揮將抑制正常p53 功能的顯性抑制阻斷效應(yīng)。當(dāng)該反式顯性抑制P53突變以高水平表達(dá)或當(dāng)細(xì)胞不能表達(dá)正 常P53，例如沒有正常的p53等位基因，這些情況對(duì)p53基因治療有不利的結(jié)果。II.癌癥治療依照本發(fā)明的某些實(shí)施方式，申請(qǐng)人也提供用于預(yù)測(cè)對(duì)治療性癌治療和施用基于 上文所述P53生物標(biāo)記物表達(dá)譜的治療的有利反應(yīng)的方法。本發(fā)明更具體地涉及通過施用 抗瘤治療(比如P53基因治療)治療過度增生疾病。A.過度增牛疾病過度增生疾病是和細(xì)胞異常生長(zhǎng)或增生相關(guān)的疾病。所述過度增生疾病是可在受 用者身上表現(xiàn)為損傷的疾病，例如瘤。所述瘤可以是良性瘤生長(zhǎng)或癌。本發(fā)明設(shè)想的用于治療的例示瘤包括以下鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺瘤、腺 癌、皮革胃、胰島素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、胰腺瘤、膽管上皮癌、肝細(xì)胞癌、腺樣囊 性癌、類癌瘤、催乳素瘤、嗜酸粒細(xì)胞腺瘤、何氏細(xì)胞腺瘤、腎細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜樣腺瘤、囊 腺瘤、腹膜假粘液瘤、Warthin氏瘤、胸腺瘤、泡膜細(xì)胞瘤、顆粒細(xì)胞瘤、卵巢男性細(xì)胞瘤、 krtoli-Leydig細(xì)胞瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、血管球瘤、黑色素瘤、軟組織肉瘤、結(jié) 締組織增生性小圓細(xì)胞瘤、纖維瘤、纖維肉瘤、粘液瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、平滑 肌肉瘤、肌瘤、肌肉瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、多形性腺瘤、腎母細(xì)胞瘤、勃勒納瘤、滑膜肉 瘤、間皮瘤、無性細(xì)胞瘤、生殖細(xì)胞瘤、胚胎性癌、卵黃囊瘤、畸胎瘤、皮樣囊腫、絨毛膜癌、中 腎瘤、血管瘤(hemangioma)、血管瘤(angioma)、血管肉瘤(hemangiosarcoma)、血管肉瘤 (angiosarcoma)、血管內(nèi)皮瘤、血管內(nèi)皮瘤、卡波西氏肉瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、淋巴管瘤、囊 狀淋巴管瘤、骨瘤、骨肉瘤、骨軟骨瘤、軟骨外生骨疣、軟骨瘤、軟骨肉瘤、巨細(xì)胞瘤、尤因肉 瘤、牙源性瘤、成牙骨質(zhì)細(xì)胞瘤、成釉細(xì)胞瘤、顱咽管瘤膠質(zhì)瘤混合性寡星形細(xì)胞瘤、室管膜 瘤、星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)上皮瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì) 胞瘤、腦膜瘤、神經(jīng)纖維瘤、神經(jīng)纖維瘤病、神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)瘤、顆粒細(xì)胞瘤、腺泡狀軟組織肉 瘤、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤、淋巴漿細(xì)胞性淋巴 瘤、外套細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、縱隔(胸腺)大細(xì)胞淋巴瘤、彌漫大B細(xì)胞淋巴 瘤、囊內(nèi)大B細(xì)胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、脾邊緣區(qū)淋巴瘤、濾泡淋巴瘤、粘膜相關(guān)淋巴組織 的結(jié)外邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(MALT-淋巴瘤淋巴瘤)、淋巴結(jié)邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤、蕈樣肉 芽腫、塞扎里綜合征、外周血T細(xì)胞淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤、皮下脂膜炎樣T 細(xì)胞淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、肝脾T細(xì)胞淋巴瘤、腸病型T細(xì)胞淋巴瘤、淋巴瘤樣丘疹 病、原發(fā)性皮膚間變性大細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤、母細(xì)胞NK細(xì)胞淋巴瘤、漿細(xì)胞 瘤、多發(fā)性骨髓瘤、肥大細(xì)胞瘤、肥大細(xì)胞肉瘤、肥大細(xì)胞增生、肥大細(xì)胞白血病、朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥、組織細(xì)胞肉瘤、朗格漢斯細(xì)胞肉瘤樹突狀細(xì)胞肉瘤、濾泡樹突細(xì)胞肉 瘤、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥、淋巴瘤樣肉芽腫、急性白血病、淋巴細(xì)胞白血病、急性淋巴 母細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤、 漿細(xì)胞白血病、T細(xì)胞大顆粒淋巴細(xì)胞白血病、B細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞性白血病、T細(xì)胞幼淋巴細(xì) 胞性白血病、前體B淋巴細(xì)胞白血病、前體T淋巴細(xì)胞白血病、急性紅白血病、淋巴瘤細(xì)胞白 血病、髓樣白血病、髓性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性早幼粒細(xì)胞白 血病、急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性髓單核細(xì)胞性白血病、嗜堿性粒細(xì)胞白血病、嗜酸性粒 細(xì)胞白血病、急性嗜堿性粒細(xì)胞白血病、急性髓樣白血病、慢性髓性白血病、單核細(xì)胞性白 血病、急性單核母細(xì)胞和單核細(xì)胞性白血病、急性巨核母細(xì)胞性白血病、急性髓樣白血病和 骨髓增生異常綜合征、綠色瘤或髓樣肉瘤、急性全骨髓增生與骨髓纖維化、毛細(xì)胞白血病、 少年髓單核細(xì)胞白血病、侵襲性NK細(xì)胞白血病、真性紅細(xì)胞增多癥、骨髓增生性疾病、慢性 特發(fā)性骨髓纖維化、自發(fā)性血小板增多、慢性中性粒細(xì)胞白血病、慢性嗜酸性粒細(xì)胞白血病 /嗜酸性細(xì)胞增多綜合癥、移植后淋巴組織增生性疾病、慢性骨髓增殖性疾病、骨髓增生異 常/骨髓增生性疾病、慢性髓單核細(xì)胞白血病和骨髓增生異常綜合征。所述過度增生疾病或癌癥可在初次診斷后或隨后通過治療性核酸或其他療法或 者兩種或更多療法治療。過度增生疾病或癌癥復(fù)發(fā)可定義為任何治療(包括一次或多次 手術(shù)、放射療法或化學(xué)療法)后患者再次出現(xiàn)或再次診斷有任何過度增生疾病或癌癥。疾 病復(fù)發(fā)的患者不必被視為無病的，但僅僅被視為在對(duì)首次治療發(fā)生某種程度的臨床反應(yīng)之 后，所述患者展現(xiàn)出復(fù)發(fā)的過度增生疾病或癌生長(zhǎng)。所述臨床反應(yīng)可以是，但不限于穩(wěn) 定的病癥、瘤退行、瘤壞死、無可證實(shí)的癌、瘤尺寸或負(fù)荷減小、瘤生長(zhǎng)的阻斷、瘤相關(guān)疼痛 減少、瘤相關(guān)病理的減少、瘤相關(guān)癥狀的減少、瘤非進(jìn)行、增加的無病間期、增加的至進(jìn)行時(shí) 間、緩解的誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)移的減少、或增長(zhǎng)的患者存活期。B.鱗狀細(xì)胞癌所述瘤具體可以是鱗狀細(xì)胞癌(SCCHN)，更具體可以是復(fù)發(fā)的SCCHN。復(fù)發(fā)的 SCCHN是最厲害的癌之一。這些瘤有非常高的致死率并引起劇烈的痛苦。復(fù)發(fā)的SCCHN瘤和 標(biāo)準(zhǔn)的治療導(dǎo)致患者毀容和明顯的妨礙基本功能(比如吃、吞咽和呼吸)的病態(tài)?；颊叱３?需要類似飼管和氣管切開術(shù)等侵入性方法來提供營養(yǎng)和呼吸。不幸的是，這些疾病的現(xiàn)行 治療不幸是不充分的，并且引起相當(dāng)?shù)亩靖弊饔?，?jīng)常加劇瘤病態(tài)。大部分患者對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的治 療沒有反應(yīng)，并且中位值存活期只有4 6個(gè)月。用于治療的所有化學(xué)治療劑(甲氨蝶呤， 順鉬，5FU和紫杉烷類)都能引起加劇瘤病態(tài)的口腔粘膜炎。雖然單克隆抗體Erbitux 不引起口炎，但它能產(chǎn)生皮疹，并增加放射性壞死副作用。除了傳統(tǒng)治療的不良的安全特性，治療反應(yīng)通常是短期的，并且?guī)缀跗毡樾枰~ 外治療。因此，復(fù)發(fā)的SCCHN清楚地表示著可怕的未滿足需要的醫(yī)療狀況，需要額外的治 療，優(yōu)選用那些不產(chǎn)生構(gòu)成瘤病態(tài)毒性的制劑。C.P53基因治療在一實(shí)施方式中，p53基因治療被預(yù)期。自從90年代中期人類p53基因治療已報(bào) 道于文獻(xiàn)。Roth等人(1996)報(bào)道了基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的治療，Clayman等人(1998)報(bào)道了 腺病毒遞送。美國專利 5，747，469，6，017，524 ；6，143，290 ；6, 410, 010 ；6，511，847。美國申 請(qǐng)2002/0077313和美國申請(qǐng)2002/0006914各自報(bào)道了用p53治療患者的方法，并且以引用方式并入本文中。預(yù)期對(duì)患者進(jìn)行表達(dá)構(gòu)件體的局部、區(qū)域(及局部-區(qū)域)或全身遞送。一般認(rèn) 為該方法將提供臨床益處，寬泛地定義為下列任何一項(xiàng)減小原發(fā)瘤的尺寸、減少轉(zhuǎn)移的發(fā) 生或尺寸、減少或停止瘤生長(zhǎng)、誘導(dǎo)緩解、復(fù)發(fā)間隔時(shí)間增加、減少瘤相關(guān)疼痛、抑制瘤細(xì)胞 分裂、殺死瘤細(xì)胞、誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡、減少或消除瘤復(fù)發(fā)、和/或增加患者存活期。所述p53基因治療具體是Adwxin 。Advexin 作為單個(gè)制劑是有效的，并 且它的抗瘤活性和Adv^dn 遞送的P53蛋白的表達(dá)相關(guān)，導(dǎo)致p53響應(yīng)基因的表達(dá)隨之 改變。這些基因和它們的基因產(chǎn)物影響大范圍的引起抗瘤效應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)程。這些進(jìn)程特性 的理解對(duì)解釋Advexin 治療后觀測(cè)到的臨床反應(yīng)類型來說是關(guān)鍵的。Advexin 是以誘導(dǎo)細(xì)胞衰老作為其作用的關(guān)鍵機(jī)制的首批抗癌制劑的一種。 細(xì)胞衰老的誘導(dǎo)引起“永久的細(xì)胞周期停滯”并在具有失活的P53的瘤中p53活性暫時(shí)恢 復(fù)后被觀測(cè)到。臨床上，永久的細(xì)胞周期停滯的誘導(dǎo)和瘤生長(zhǎng)的穩(wěn)定化而不是瘤尺寸減小 有關(guān)。動(dòng)物瘤模型和人類臨床試驗(yàn)已經(jīng)清楚地證實(shí)Advexin 治療后細(xì)胞周期停滯/衰 老被激活。P53也激活抗血管生成機(jī)制，這些機(jī)制也和瘤生長(zhǎng)的穩(wěn)定化而不是瘤尺寸減小有 關(guān)。或者，凋亡或“程序性細(xì)胞死亡”是被P53恢復(fù)激活的另一個(gè)關(guān)鍵通路。關(guān)于臨床瘤反 應(yīng)，預(yù)計(jì)在Advexin 治療后凋亡誘導(dǎo)引起瘤尺寸減小。這些關(guān)鍵的P53瘤抑制機(jī)制和它 們的分子調(diào)節(jié)物，如圖ι所闡釋。通常，在p53活性恢復(fù)之后，瘤中所有3種治療通路(細(xì)胞周期停滯-凋亡-抗血 管生成)被誘導(dǎo)。單個(gè)瘤細(xì)胞可能激活細(xì)胞周期停滯/衰老或凋亡通路，并且在特定細(xì)胞 中決定哪個(gè)通路被引發(fā)的因子目前仍不清楚。依靠這些機(jī)制中哪一個(gè)在所述瘤細(xì)胞中被主 要誘導(dǎo)，將決定在Advexin 治療后所觀測(cè)到的臨床反應(yīng)的特性。如圖2闡釋，預(yù)期一連 串的抗瘤反應(yīng)包括從瘤生長(zhǎng)的穩(wěn)定化到瘤完全根除，包括衰弱/穩(wěn)定的病癥(圖；3)和凋亡 /瘤減小(圖4)，取決于活化細(xì)胞衰老或凋亡途徑的細(xì)胞的相對(duì)比例。與治療機(jī)制的這些考慮一致，增長(zhǎng)的主要數(shù)據(jù)指示傳統(tǒng)的基于尺寸上完全(CR) 和部分(PR)減小>50%的瘤反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)臨床上不能最佳鑒定和增長(zhǎng)的存活期相關(guān)的有關(guān)反 應(yīng)(Lara et al.，2008)。Lara等人(2008)最近報(bào)道了 3個(gè)隨機(jī)的，涉及984名肺癌患者 的對(duì)照的西南瘤學(xué)組(Souttiwest Oncology Group)臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，指示CRJR或穩(wěn)定的 病癥定義的瘤生長(zhǎng)控制(TGC)在預(yù)測(cè)存活期上明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的CR+H 定義。同樣地，Choi 和同事Q007)證明用計(jì)算機(jī)化斷層顯象(CT)所示的瘤尺寸減小> 10%和用正電子成象 術(shù)(PET)所示的瘤反應(yīng)高度相關(guān)，并且是經(jīng)伊馬替尼治療的胃腸間質(zhì)瘤中比標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)標(biāo) 準(zhǔn)更加靈敏的存活益處的預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)(Choi，2007 ；Benjamin，2007)。因此，對(duì)于如Adv^du 的制劑，已知它們以誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和衰老為重要的 作用機(jī)制，基于瘤生長(zhǎng)控制(TGC = CR+PR+SD)或瘤尺寸減小> 10%的瘤反應(yīng)定義更適用于 定義預(yù)測(cè)治療后增加的存活期的瘤反應(yīng)。III.治療基因在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，提供給患者施用p53基因治療、p53基因治療之外的 治療，或另一個(gè)基于所述患者P53生物標(biāo)記物表達(dá)譜的抗瘤治療的方法。所述方法可在某 些方面使用治療性核酸，并在所述P53基因治療中使用特定的p53基因。A.治療性核酸
本文定義的“治療性核酸”指能被施用給受試者用于治療或預(yù)防疾病目的的核酸， 本文中所述核酸是已知的或懷疑有益于過度增生疾病的治療。治療益處可通過所述核酸引 起(例如)特定一種或多種基因表達(dá)的變化。特定一種或多種基因表達(dá)的變化可以是特定 基因表達(dá)的抑制或增強(qiáng)。本發(fā)明的某些實(shí)施方式關(guān)注于治療性核酸的施用。本文所用的“核酸”通常指DNA、RNA分子(S卩，鏈)或它們的衍生物或類似物，包 括核苷酸堿基。例如，核苷酸堿基包括發(fā)現(xiàn)于DNA(例如，腺嘌呤“A”、鳥嘌呤“G”、胸腺嘧啶 “T”或胞嘧啶“C”)或RNA (例如，A、G、尿嘧啶“U”或C)中的天然存在的嘌呤或嘧啶堿基。 所述術(shù)語“核酸”包含術(shù)語“寡核苷酸”和“多核苷酸”，每個(gè)作為所述“核酸”的子集。所述 術(shù)語“寡核苷酸”是指長(zhǎng)度在約8 約100個(gè)核苷酸堿基之間的分子。所述術(shù)語“多核苷 酸”是指長(zhǎng)度至少多于約100個(gè)核苷酸堿基的分子。在某些實(shí)施方式中，“基因”是指轉(zhuǎn)錄的核酸。在某些方面，所述基因包括涉及轉(zhuǎn)錄 或信息生成的調(diào)控序列。在具體的實(shí)施方式中，基因包含編碼蛋白、多肽或肽的轉(zhuǎn)錄序列。 如本領(lǐng)域內(nèi)那些技術(shù)人員所理解，這一有功能的術(shù)語“基因”包括基因組序列、RNA或cDNA 序列或更小的經(jīng)改造的核酸片段，包括基因非轉(zhuǎn)錄部分的核酸片段，包括但不限于基因的 非轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域。更小的經(jīng)改造的核酸片段可以表達(dá)或可適合表達(dá)蛋白、多 肽、肽結(jié)構(gòu)域、肽、融合蛋白、突變的多肽和/或諸如此類。“基本上從其他編碼序列分離”是指所關(guān)注的基因形成核酸片段的編碼區(qū)域的一 部分，所述片段不包含天然存在的編碼核酸的大部分，比如大染色體片段或其他功能基因 或cDNA編碼區(qū)。當(dāng)然，這指原始分離的核酸，并且不排除之后人工添加到核酸的基因或編 碼區(qū)域。在具體實(shí)施方式
中，所述治療性核酸以核酸“表達(dá)構(gòu)件體”的形式。在整個(gè)申請(qǐng)中， 所述術(shù)語“表達(dá)構(gòu)件體”是指包括任何核酸類型，該類型中所有或部分核酸能被轉(zhuǎn)錄。所述 轉(zhuǎn)錄部分可以編碼治療的基因，該基因能被翻譯成治療的基因產(chǎn)物，比如蛋白，但不必是蛋 白。在其他實(shí)施方式中所述轉(zhuǎn)錄部分可簡(jiǎn)單地作用來抑制或增加具體基因的表達(dá)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，所述治療性核酸編碼“治療性基因”。如本領(lǐng)域內(nèi)那 些技術(shù)人員所知，所述術(shù)語“治療性基因”包括基因組序列、cDNA序列、更小的經(jīng)改造的核酸 片段，它們表達(dá)，也可適應(yīng)表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽、結(jié)構(gòu)域、肽、融合蛋白、突變體，所有這些都能 給遭受過度增生疾病的患者提供臨床益處。編碼治療性基因的所述治療性核酸可包含約5 個(gè) 約20，000個(gè)或更多連續(xù)核苷酸、核苷或堿基對(duì)的核酸序列?；加胁豢汕谐牧龅幕颊呖梢愿鶕?jù)本發(fā)明被治療。作為結(jié)果，瘤尺寸可能減小，或 所述瘤血管可以改變而使所述瘤變?yōu)榭汕谐?。如果這樣，標(biāo)準(zhǔn)的手術(shù)切除可被允許。能 和手術(shù)聯(lián)用的另一個(gè)具體的施用模式是手術(shù)的瘤床的治療。因此，或者在最初基因療法治 療中，或者在隨后的治療中，可以用手術(shù)中的載體灌注所述切除的瘤床，并且在手術(shù)后，任 選插入導(dǎo)管到所述手術(shù)位點(diǎn)。B.核酸的純化和表達(dá)核酸可以用聚丙烯酰胺凝膠、氯化銫梯度離心、柱層析或以本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人 員所知的任何其他方式純化(例如Sambrook et al.，2001，通過引用并入本文)。在某些方 面，本發(fā)明關(guān)注的核酸是分離的核酸。如本文所述的術(shù)語“分離的核酸”是指核酸分子(例 如，RNA或DNA分子)，這些分子已被分離得無或別樣無大多數(shù)細(xì)胞成分或體外反應(yīng)成分，和/或一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中大量總基因組和轉(zhuǎn)錄的核酸。分離核酸的方法(例如，平衡密度離心 法、電泳分離、柱層析)為本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所熟知。根據(jù)本發(fā)明，期望在靶細(xì)胞中生產(chǎn)治療性蛋白。表達(dá)通常需要在載體或表達(dá)盒中 提供合適的信號(hào)，載體或表達(dá)盒中包含各種調(diào)控元件，比如源于病毒和/或哺乳動(dòng)物源的 增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，能驅(qū)動(dòng)宿主細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。也可包括設(shè)計(jì)為優(yōu)化信使RNA穩(wěn)定 性和在宿主細(xì)胞中可譯性的元件?？珊喜⑺幬镞x擇標(biāo)記物，以建立永久的穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。病毒載體選擇真核表達(dá)系統(tǒng)。包括腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、慢 病毒及包括牛痘病毒的痘病毒和包括SV40的乳頭瘤病毒。病毒載體可為復(fù)制缺陷的、有條 件缺陷的或復(fù)制完全的。還預(yù)期是非病毒遞送系統(tǒng)，包括基于脂質(zhì)的媒質(zhì)。C.載體和表汰構(gòu)件體使用的所述術(shù)語“載體”是指載質(zhì)核酸分子，其中可插入有用于導(dǎo)入細(xì)胞的核酸序 列，其在細(xì)胞中被復(fù)制和/或表達(dá)。核酸序列可以是“外源性的”或“異源性的”，外源性表 示它是從外面進(jìn)入細(xì)胞，所述載體可以被導(dǎo)入，異源性是指所述序列與細(xì)胞中序列同源，但 在宿主細(xì)胞核酸的位置上通常沒有發(fā)現(xiàn)所述序列。載體包括質(zhì)粒、粘粒、病毒(噬菌體、動(dòng) 物病毒、植物病毒)和人工染色體(例如，YAC)。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可用標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)很 好地裝備以構(gòu)建載體(參見例如，Sambrook et al.，2001and Ausubel et al.，1996，都通 過引用并入本文)。所述術(shù)語“表達(dá)載體”是指任一基因構(gòu)件體類型，該基因構(gòu)件體含編碼能被轉(zhuǎn)錄的 RNA的核酸。在某些情況中，RNA分子被翻譯成蛋白、多肽或肽。表達(dá)載體可包含多種“控 制序列”，這些控制序列指特定宿主細(xì)胞中可操作連接的編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的核 酸序列。除了控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制序列，載體和表達(dá)載體可以包含有其他功能的核酸序 列，如下文所述。為了表達(dá)p53或p53之外的治療性基因，有必要提供表達(dá)載體。合適的核酸可通 過標(biāo)準(zhǔn)的亞克隆技術(shù)插入到表達(dá)載體。這些載體的操作在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。融合蛋白 表達(dá)系統(tǒng)的示例是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Pharmacia，Piscataway, NJ)、麥芽糖結(jié)合蛋 白系統(tǒng)(NEB，Beverley，MA)、FLAG 系統(tǒng)(IBI，New Haven, CT)及 6X 組氨酸系統(tǒng) Oliagen， Chatsworth, CA)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，使用的表達(dá)系統(tǒng)由桿狀病毒多角體啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)系 統(tǒng)。編碼蛋白的基因能通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)操作來促進(jìn)克隆到所述桿狀病毒載體內(nèi)。具體的桿 狀病毒載體是PBlueBac載體anvitrogen，Sorrento，CA)。攜帶目的基因的載體用標(biāo)準(zhǔn)的 方法轉(zhuǎn)染到秋粘蟲(Spodoptera frugiperda (Sf9))細(xì)胞中，所述細(xì)胞被培養(yǎng)并處理來生產(chǎn) 重組蛋白。暴露于桿狀病毒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞被感染并可只表達(dá)外源基因。該方法可轉(zhuǎn)導(dǎo)所 有細(xì)胞，并以劑量依賴的方式表達(dá)該基因。也有各種提供合適媒質(zhì)的真核載體，這些載體中可產(chǎn)生重組多肽。HSV已被用于 組織培養(yǎng)以表達(dá)大量外源基因，及其內(nèi)源性基因的高水平表達(dá)。例如，雞卵清蛋白基因已用 α啟動(dòng)子在HSV中表達(dá)。Herz和Roizman(1983)。IacZ基因也已在各種HSV啟動(dòng)子控制 下表達(dá)。在整個(gè)申請(qǐng)中，所述術(shù)語“表達(dá)構(gòu)件體”是指包括任何包含編碼基因產(chǎn)物的核酸的 基因構(gòu)件體類型，其中部分或全部核酸編碼序列能被轉(zhuǎn)錄。所述轉(zhuǎn)錄物可被翻譯成蛋白，但未必。因此，在某些實(shí)施方式中，表達(dá)包括基因的轉(zhuǎn)錄和RNA到基因產(chǎn)物的翻譯。在其他實(shí) 施方式中，表達(dá)只包括所述核酸的轉(zhuǎn)錄。在具體的實(shí)施方式中，所述核酸受啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制。“啟動(dòng)子”是指被細(xì)胞合成 裝置或?qū)氲暮铣裳b置識(shí)別的DNA序列，為起始基因的特異轉(zhuǎn)錄所需。所述短語“受轉(zhuǎn)錄控 制”是指啟動(dòng)子相對(duì)于核酸在正確的位置和方向，以控制RNA聚合酶的起始和基因的表達(dá)。本文使用的短語“啟動(dòng)子”是指一組在針對(duì)RNA聚合酶II的起始位點(diǎn)附近聚集的 轉(zhuǎn)錄控制模塊。關(guān)于啟動(dòng)子如何被組織的很多考慮來自幾種病毒啟動(dòng)子的分析，包括對(duì)HSV 胸苷激酶(tk)和SV40早期轉(zhuǎn)錄單元的分析。這些研究(隨著最近更多的工作而增加)已 經(jīng)表明啟動(dòng)子由離散的功能模塊組成，每個(gè)由約7 20個(gè)bp的DNA組成，且含有轉(zhuǎn)錄活化 或抑制蛋白的一個(gè)或更多識(shí)別位點(diǎn)。每個(gè)啟動(dòng)子中至少一個(gè)模塊功能是定位RNA合成的起始位點(diǎn)。最熟知的例子是 TATA盒，但是在一些缺少TATA盒的啟動(dòng)子(比如哺乳動(dòng)物末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶基因的啟 動(dòng)子、SV40晚期基因的啟動(dòng)子)中，覆蓋起始位點(diǎn)的離散元件本身有助于固定起始位置。附加的啟動(dòng)子元件調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的頻率。通常，這些位于起始位點(diǎn)上游30 IlObp區(qū)域，盡管最近大量啟動(dòng)子已被證明在其起始位點(diǎn)下游含有功能元件。啟動(dòng)子元件之 間的距離時(shí)常是可塑的，因此當(dāng)元件是顛倒的或相對(duì)于另一個(gè)有移動(dòng)時(shí)，啟動(dòng)子功能是保 守的。在tk啟動(dòng)子中，啟動(dòng)子元件之間的距離增加到距原先50bp時(shí)活性開始下降。依賴 所述啟動(dòng)子，似乎單個(gè)元件或者合作或者獨(dú)立地發(fā)揮功能來激活轉(zhuǎn)錄。使用具體的啟動(dòng)子來控制核酸的表達(dá)不被認(rèn)為是決定性的，只要它能在靶細(xì)胞中 表達(dá)核酸。因此，在人類細(xì)胞作為靶點(diǎn)中，它具體位于臨近的并在啟動(dòng)子控制之下的核酸編 碼區(qū)域，該啟動(dòng)子能在人類細(xì)胞中被表達(dá)。一般而言，這一啟動(dòng)子可能包括人類或病毒啟動(dòng) 子。在各種其他實(shí)施方式中，人類巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期基因啟動(dòng)子、SV40早期 啟動(dòng)子和勞斯肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)能被用于獲得轉(zhuǎn)基因的高水平表達(dá)。使用其他本領(lǐng)域內(nèi) 眾所周知的病毒或哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌噬菌體啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因，也被期望提供高水平 表達(dá)來滿足預(yù)定目的。增強(qiáng)子最初被測(cè)定為增加轉(zhuǎn)錄的基因元件，相距位于同一 DNA分子的據(jù)啟動(dòng)子很 遠(yuǎn)的位置上。這種長(zhǎng)距離作用的能力在經(jīng)典的原核轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中沒有先例。隨后的研究 表明具有增強(qiáng)子活性的DNA區(qū)域結(jié)構(gòu)組織上很像啟動(dòng)子。即是，它們由許多單個(gè)元件構(gòu)成， 每個(gè)能結(jié)合一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄蛋白。增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的基本區(qū)別是可操作的。增強(qiáng)子區(qū)域總體上必須能在遠(yuǎn)處刺激轉(zhuǎn) 錄，這一需要不適用于啟動(dòng)子區(qū)域或其組分元件。另一方面，啟動(dòng)子必須有直接起始RNA在 特定位點(diǎn)和特定方向上合成的一個(gè)或多個(gè)元件，而增強(qiáng)子沒有這些特異性。啟動(dòng)子和增強(qiáng) 子常常是重疊的或連續(xù)的，常?？雌饋碛蓄愃频哪K組織。另夕卜，任{可啟動(dòng)子 / ±曾強(qiáng)子組合(as per the Eukaryotic PromoterData Base EPDB)也能被用于驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。T3、T7或SP6細(xì)胞質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的使用是另一可能的 實(shí)施方式。如果合適的細(xì)菌聚合酶被提供，真核細(xì)胞能支持由某些細(xì)菌啟動(dòng)子的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn) 錄，或者作為遞送復(fù)合體的一部分，或者作為額外的基因表達(dá)構(gòu)件體。其通常包括多聚腺苷酸化信號(hào)以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄物的合適的多聚腺苷酸化。多聚腺苷酸化的特性并不被認(rèn)為是本發(fā)明成功實(shí)施的關(guān)鍵，并且任何這些序列可被使用。具體的實(shí)施 方式包括SV40多聚腺苷酸信號(hào)和牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸信號(hào)，它們是方便的，并深知其在 各種靶細(xì)胞中的發(fā)揮良好的功能。也預(yù)計(jì)作為表達(dá)盒元件的是終止子。這些元件可以用于 增強(qiáng)信息水平并使從所述基因盒到其他序列的通讀最小化。特異的起始信號(hào)也是編碼序列的有效翻譯所需的。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子 和鄰近的序列。外源的翻譯控制信號(hào)，包括ATG起始密碼子，也許需要被提供。本領(lǐng)域內(nèi)普 通的技術(shù)人員能容易地測(cè)定該信號(hào)并提供所述必需信號(hào)。眾所周知，所述起始密碼子必須 是和所期望的編碼序列的閱讀框符合“符合閱讀框”，以確保整個(gè)插入片段的翻譯。外源性 翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以是天然的也可是合成的。表達(dá)效率可以通過內(nèi)含合適的轉(zhuǎn) 錄增強(qiáng)子元件而被增強(qiáng)(Bittner et al.，1987)。在本發(fā)明的各種實(shí)施方式中，所述表達(dá)構(gòu)件體包含病毒或經(jīng)改造的源于病毒基因 組的構(gòu)件體。某些病毒有能力經(jīng)過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞并整合到宿主細(xì)胞基因 組中穩(wěn)定并有效地表達(dá)病毒基因，這些能力使它們成為外源基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的 優(yōu)良候選物(Ridgeway，1988 ；Nicolas and Rubenstein, 1988 ；Baichwal andSugden, 1986 ； Temin, 1986) 0第一批用作載體的病毒是DNA病毒，包括乳多泡病毒(猿猴病毒40，牛乳 頭瘤病毒和多瘤)(Ridgeway，1988 ;Baichwal and Sugden，1986)及腺病毒(Ridgeway, 1988 ；Baichwal and Sugden，1986)和腺伴隨病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒也是優(yōu)良基因轉(zhuǎn)染載體 (Nicolas and Rubenstein，1988 ;Temin，1986)，也包括痘病毒(Ridgeway, 1988)和腺伴隨 病毒(Ridgeway，1988)。這些載體可用于(1)為了目的蛋白的表達(dá)體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，或(2) 在基因治療方案中體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞以提供治療性多肽。a.病毒載體病毒載體是利用病毒序列將核酸和可能的蛋白導(dǎo)入細(xì)胞中的表達(dá)構(gòu)建體，某些病 毒有能力經(jīng)過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用感染細(xì)胞或進(jìn)入細(xì)胞，并整合到宿主細(xì)胞基因組穩(wěn)定并 有效地表達(dá)病毒基因，這些能力使它們成為將外源核酸轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞(如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞) 的優(yōu)良候選物。本發(fā)明的載體成分可以是編碼一種或多種候選物或其他此類成分，例如，免 疫調(diào)節(jié)物或所述候選物的佐劑的病毒載體?？杀挥糜谶f送本發(fā)明核酸的病毒載體的非限制 性例子報(bào)道于下文。腺病毒是無包膜的雙鏈DNA病毒。病毒體由在蛋白衣殼內(nèi)的DNA-蛋白核心構(gòu)成。 病毒結(jié)合特定的細(xì)胞受體，被內(nèi)吞，所述基因組從核內(nèi)體擠出并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核?；蚪M約 36kB，編碼約36個(gè)基因。在細(xì)胞核中，所述“立即早期"ElA蛋白最初表達(dá)，這些蛋白誘導(dǎo)由 E1B、E2、E3和E4轉(zhuǎn)錄單元編碼的“延遲的早期”蛋白表達(dá)。感染后(p. i.)約1天時(shí)，病毒 體在細(xì)胞核中裝配，2 3天后細(xì)胞裂解并釋放子代病毒。細(xì)胞裂解由E311. 6K蛋白介導(dǎo)， 該蛋白被重新命名為“腺病毒死亡蛋白”(ADP)。腺病毒特別適合作為基因轉(zhuǎn)移載體，由于其中型尺寸的基因組，易于操作，高滴 度，廣泛的靶細(xì)胞范圍和高感染性。所述病毒基因組兩端含有100 200堿基對(duì)的反向重復(fù) 序列(ITRs)，這是病毒DNA復(fù)制和裝配所必需的順式元件。基因組的早期(E)和晚期(L) 區(qū)域含有由病毒DNA復(fù)制的起始劃分的不同轉(zhuǎn)錄單元。El區(qū)域(ElA和ElB)編碼負(fù)責(zé)病毒 基因組和一些細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白。E2區(qū)域(E2A和E2B)的表達(dá)引起用于病毒DNA 復(fù)制的蛋白合成。這些蛋白涉及DNA復(fù)制，晚期基因表達(dá)和宿主細(xì)胞關(guān)閉(Renan，1990)。晚期基因的產(chǎn)物(包括大部分病毒衣殼蛋白)只在主要的單獨(dú)的最初轉(zhuǎn)錄進(jìn)程之后表達(dá)， 由主要晚期啟動(dòng)子(MLP)啟動(dòng)。所述MLP(位于16. 8m. u.)在感染晚期特別有效，并且所有 由此啟動(dòng)子啟動(dòng)的mRNA' s具有5' _三聯(lián)前導(dǎo)序列(TPL)，該前導(dǎo)序列使這些稱為翻譯用 特定的mRNA' S。腺病毒可以是已知的51種不同血清型或亞型A F中的任何一種。C亞類的5型 腺病毒是人類腺病毒，其中大部分生物化學(xué)和遺傳學(xué)信息已知，歷史上已經(jīng)被用于大部分 使用腺病毒作為載體的制作。重組的腺病毒常常由穿梭載體和前病毒載體之間的同源重組 產(chǎn)生。由于兩種前病毒載體可能重組，野生型腺病毒可由該過程產(chǎn)生。因此，關(guān)鍵在于從單 個(gè)噬菌斑中分離病毒的單克隆并檢查其基因組結(jié)構(gòu)。用于基因治療的病毒可以是復(fù)制完全的或者是復(fù)制缺陷的。復(fù)制缺陷的腺病毒載 體的生成和增殖依靠輔助細(xì)胞系，原型是293細(xì)胞，通過用Ad5DNA片段轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞 來制備，該細(xì)胞系能組成性的表達(dá)El蛋白(Graham et al.，1977)。然而，輔助細(xì)胞系可以 源于人類細(xì)胞，比如人類胚胎腎細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、造血細(xì)胞或其他人類胚胎間充質(zhì)或上皮細(xì) 胞?；蛘撸鲚o助細(xì)胞可以源于其他允許人類腺病毒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這些細(xì)胞包括， 例如，Vero細(xì)胞或其他猴胚胎間充質(zhì)或上皮細(xì)胞。如前文所述，所述具體的輔助細(xì)胞系是 293。Racher等人(19卯)已經(jīng)公開了用于培養(yǎng)293細(xì)胞和繁殖腺病毒的改善的方法。 在一形式中，天然的細(xì)胞聚集物通過接種單個(gè)細(xì)胞到1升經(jīng)硅烷化處理的含有100 200ml 培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)燒瓶(Techne，Cambridge，UK)中生長(zhǎng)。然后以40rpm攪動(dòng)，細(xì)胞活力用臺(tái)盼 藍(lán)染色評(píng)估。在另一形式中，F(xiàn)ibra-Cel微載體(Bibby Sterlin, Stone, UK) (5g/l)如下 使用。細(xì)胞接種液在5ml培養(yǎng)基中重懸，在250ml錐形燒瓶中添加到載體(50ml)并保持靜 置1 4小時(shí)，偶爾攪動(dòng)。然后該培養(yǎng)基被50ml新鮮培養(yǎng)基取代并開始搖動(dòng)。關(guān)于病毒生 成，細(xì)胞被允許生長(zhǎng)達(dá)到約80%匯合度，此后培養(yǎng)基被替換(達(dá)到終體積的25% )，然后以 0. 05M0I添加腺病毒。培養(yǎng)保持靜置過夜，之后體積增加到100%，再開始搖動(dòng)72小時(shí)。腺病毒生長(zhǎng)和操作為本領(lǐng)域內(nèi)那些技術(shù)人員所知，并在體內(nèi)和體外具有廣泛的宿 主范圍。這類病毒可被高滴度獲得，例如，IO9 IO13噬菌斑形成單位/ml，并且它們具有高 度感染性。腺病毒的生命周期不需要整合進(jìn)入所述宿主細(xì)胞基因組。被腺病毒載體遞送的 外源基因是游離的，因此對(duì)宿主細(xì)胞的基因毒性較低。在用野生型腺病毒的疫苗接種研究 中還沒有副作用的報(bào)道(Couch et al. ,1963 ；Top et al.，1971)，證明了它們作為體內(nèi)基 因轉(zhuǎn)移載體的安全性和治療潛能。腺病毒載體已被用于真核基因表達(dá)(Levrero et al.，1991 ；Gomez-Foix et al.， 1992)和疫苗研發(fā)(Grunhaus and Horwitz, 1992 ；Graham and Prevec，1992)。動(dòng)物研究 已經(jīng)表明重組的腺病毒可被用于基因治療(Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991 ；Stratford-Perricaudet et al. , 1990 ；Rich et al. , 1993) 施用重組腺病毒到不 同組織的研究包括氣管灌注(Rosenfeld et al. ,1991 ；Rosenfeldet al.，1992)、肌肉注 射(Ragot et al.，1993)、外周靜脈注射(Herzand Gerard, 1993)和立體定向接種到腦(Le Gal La Salle et al. ,1993)。如上所述，Ad載體基于重組的Ad，該Ad或是復(fù)制缺陷的或是復(fù)制完全的。通常的 復(fù)制缺陷的Ad載體缺乏ElA和ElB基因(總稱為El)并在它們的位置上包含由啟動(dòng)子和mRNA前體加工信號(hào)構(gòu)成的表達(dá)盒，該信號(hào)驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)。這些載體不能復(fù)制，由于它們 缺乏誘導(dǎo)Ad基因表達(dá)和DNA復(fù)制所需要的ElA基因。另外，所述E3基因能被刪除，因?yàn)樗?們不是培養(yǎng)的細(xì)胞中病毒復(fù)制必需的。本領(lǐng)域內(nèi)認(rèn)為復(fù)制缺陷的Ad載體具有的幾個(gè)特征 使它們次優(yōu)用于治療。例如，復(fù)制缺陷載體的生產(chǎn)需要它們?cè)谶\(yùn)輸中提供ElA蛋白的補(bǔ)充 細(xì)胞系中生長(zhǎng)。幾個(gè)團(tuán)體也已經(jīng)提議用復(fù)制完全的Ad載體用于治療用途。復(fù)制完全的載體保持 復(fù)制必要的Ad基因，因而不需要補(bǔ)充細(xì)胞系來復(fù)制。復(fù)制完全的Ad載體裂解細(xì)胞是所述 載體生命周期的天然部分。當(dāng)所述載體被改造用于編碼和表達(dá)外源蛋白時(shí)，復(fù)制完全的Ad 載體具有優(yōu)勢(shì)。這些載體被期望隨著載體復(fù)制可大大地提高體內(nèi)編碼的蛋白的合成。關(guān)于 用作抗癌劑，理論上復(fù)制完全的病毒載體是有優(yōu)勢(shì)的，它們能夠在瘤中復(fù)制和擴(kuò)散，而不像 復(fù)制缺陷載體的情況那樣只在最初感染的細(xì)胞。另一種方法是制備有條件復(fù)制完全的病毒。Onyx制藥公司最近報(bào)道了基于腺病 毒的抗癌癥載體，其在非瘤細(xì)胞中是復(fù)制缺陷的，但在缺乏有功能的P53和/或視網(wǎng)膜神經(jīng) 膠質(zhì)瘤(PRB)瘤抑制蛋白的瘤細(xì)胞中表現(xiàn)復(fù)制表型(美國專利5，677，178)。據(jù)報(bào)道，該表 型可用重組的腺病毒實(shí)現(xiàn)，所述腺病毒在ElB區(qū)域含有突變，該突變使Ε1Β-5^(蛋白不能結(jié) 合p53 ；和/或在ElA區(qū)域含有突變，該突變使編碼的ElA蛋白(p^9R或p243R)不能結(jié)合 pRB和/或p300和/或pl07。E1B_5^(至少有兩種獨(dú)立的功能結(jié)合并使瘤抑制蛋白p53 失活；并且為Ad mRNA從細(xì)胞核的有效轉(zhuǎn)運(yùn)所必需。由于這些ElB和ElA病毒蛋白涉及使 細(xì)胞進(jìn)入S期，這為腺病毒DNA復(fù)制所需，并由于p53和pRB蛋白阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，Onyx 報(bào)道的重組的腺病毒載體可以在P53和/或pRB缺陷的細(xì)胞中復(fù)制(許多癌細(xì)胞中的情 況)，但不在具有野生型P53和/或pRB的細(xì)胞中復(fù)制。另一個(gè)復(fù)制完全的腺病毒載體中E1B_5^(基因被置換為單純皰疹病毒胸苷激酶 基因(Wilder et al.，1999a)。構(gòu)建該載體的團(tuán)體報(bào)道載體與更昔洛韋的組合表現(xiàn)為在裸 鼠模型中對(duì)人結(jié)腸癌有治療效應(yīng)(Wilder et al.，1999b)。然而，該載體缺乏ADP的基因， 因此該載體裂解細(xì)胞和從細(xì)胞到細(xì)胞的擴(kuò)散不如表達(dá)ADP的相當(dāng)?shù)妮d體有效。也可以利用各種啟動(dòng)子系統(tǒng)來制備過表達(dá)p53的腺病毒載體。載體也可以是復(fù) 制完全的或有條件復(fù)制的。其他版本的經(jīng)改造的腺病毒包括破壞ElA的能結(jié)合p300和/ 或Rb家族成員的能力，或缺乏至少一種E3蛋白表達(dá)的Ad載體，其中E3蛋白選自6. 7K、 gpl9K、RIDa (也稱10. 4K) ；RID β (也稱14. 5Κ)和14. 7Κ。由于野生型Ε3蛋白抑制免疫介 導(dǎo)的發(fā)炎和/或Ad缺陷細(xì)胞的凋亡，缺乏一種或多種這些Ε3蛋白的重組的腺病毒可以刺 激炎性和免疫細(xì)胞滲透到用腺病毒治療的瘤，并且該宿主免疫應(yīng)答將幫助摧毀瘤和已轉(zhuǎn)移 的瘤。Ε3區(qū)域的突變將損害其野生型功能，是感染病毒的細(xì)胞易于被宿主免疫系統(tǒng)攻擊。 這些病毒被詳細(xì)報(bào)道于美國專利6，627，190。其他腺病毒載體報(bào)道于美國專利5，670，488 ；5, 747，869 ；5, 932，210 ；5, 981，225 ； 6，069，134 ；6，136，594 ；6，143，290 ；6，210，939 ；6，296，845 ；6，410，010 ；和 6，511，184 ；美 國公開 No. 2002/0028785ο溶瘤病毒也被預(yù)期作為本發(fā)明的載體。本文定義的溶瘤病毒通常指較之正常細(xì) 胞，更常殺死瘤或癌細(xì)胞的病毒。裂解病毒的示范例包括過表達(dá)ADP的腺病毒。這些腺病 毒詳細(xì)報(bào)道于美國專利申請(qǐng)20040213764、美國專利申請(qǐng)20020(^8785和美國專利申請(qǐng)系列No. 09/351，778，每個(gè)都通過引用整體特別并入本申請(qǐng)的本章節(jié)和本申請(qǐng)的其他章節(jié)。裂 解病毒的示范例在本說明書的別處被討論。任一名本領(lǐng)域內(nèi)普通的技術(shù)人員熟悉其他裂解 病毒，這些病毒可用于藥物組合物和本發(fā)明的方法中。腺伴隨病毒(AAV)是用于本發(fā)明的方法的優(yōu)良載體系統(tǒng)，由于它具有整合高頻率 并能感染不分裂的細(xì)胞，因而使它有用于(例如)在組織培養(yǎng)(Muzyczka，1992)或體內(nèi)基 因的到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的遞送。AAV具有廣泛的感染宿主范圍(Tratschin et al. , 1984 ； Laughlin etal. , 1986 ；Lebkowski et al. , 1988 ；McLaughlin et al.，1988)。關(guān)于生成和 rAAV載體使用的細(xì)節(jié)報(bào)道于美國專利5，139，941和4，797，368，每個(gè)都通過引用并入本文。逆轉(zhuǎn)錄病毒有望作為治療性載體，由于它們能整合它們的基因到宿主基因組， 轉(zhuǎn)移大量外源遺傳物質(zhì)，感染廣泛的物種和細(xì)胞類型并能在特定細(xì)胞系中裝配(Miller， 1992)。為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在某些病毒序列的位置上，核酸被插入到病毒基因組 以生成復(fù)制缺陷的病毒。為了生成病毒體，包含gag、pol和env基因但沒有LTR和裝配組 件的裝配細(xì)胞系被構(gòu)建(Marm etal.，1983)。當(dāng)包含cDNA的重組質(zhì)粒，連同逆轉(zhuǎn)錄病毒的 LTR和裝配序列被導(dǎo)入到特定細(xì)胞系(例如，通過磷酸鈣沉淀)，裝配序列允許重組質(zhì)粒的 RNA轉(zhuǎn)錄物被裝配進(jìn)病毒顆粒，然后被分泌到培養(yǎng)基中(Nicolas and Rubenstein, 1988 ； Temin, 1986 ；Mann et al.，1983)。然后含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基被收集，任選濃縮，用 于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能感染廣泛的各種細(xì)胞類型。然而，整合和穩(wěn)定表達(dá)需要宿 主細(xì)胞分裂(Paskind et al.，1975)。慢病毒是復(fù)合的逆轉(zhuǎn)錄病毒，除了普通的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因gag、pol和env，還包 括其他調(diào)控或結(jié)構(gòu)功能的基因。慢病毒載體在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知(例如，參見Naldini et al.，1996 ；Zufferey et al.，1997 ；Blomer et al.，1997 ；美國專利 6，013，516 和 5，994，136)。重組的慢病毒載體能感染不分裂的細(xì)胞，并能用于體內(nèi)和體外基因轉(zhuǎn)移和核酸序 列的表達(dá)。例如，重組的慢病毒能感染不分裂的細(xì)胞，其中合適的宿主細(xì)胞能被兩種或更 多具有裝配功能元件(稱為gag、pol、env,以及rev和tat)的載體轉(zhuǎn)染，報(bào)道于美國專利 5，994，136，通過引用并入本文?？梢酝ㄟ^連接包膜蛋白和抗體或靶向特定細(xì)胞類型的特定 配體來靶向重組病毒。通過將目標(biāo)序列(包括調(diào)控區(qū))隨著另一編碼特定靶細(xì)胞上的受體 的配體的基因插入病毒載體(例如，所述載體現(xiàn)在是靶特異性的)。在治療神經(jīng)系統(tǒng)紊亂上已對(duì)單純皰疹病毒(HSV)產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)呐d趣，由于它對(duì)神 經(jīng)細(xì)胞的向性，但考慮到其廣泛的宿主范圍，這一載體也能用于其他組織。使HSV作為優(yōu)良 載體的另一個(gè)因素是其基因組的尺寸和組織結(jié)構(gòu)。由于HSV較大，并有多個(gè)基因或表達(dá)盒， 比其他更小的病毒系統(tǒng)更少有問題。此外，不同的病毒控制序列具有不同的性能(時(shí)間、長(zhǎng) 度等)，使之可能比其他系統(tǒng)更大程度地控制表達(dá)。它的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于該病毒具有相對(duì)較 少的重疊信息，更易于基因操作。HSV也相對(duì)易于操作并能生長(zhǎng)到高滴度。因此，遞送很少是問題，在體積上需要 達(dá)到足夠的MOI并較少需要重復(fù)給藥。HSV作為基因治療載體的綜述見于Glorioso等人 (1995)。HSV分為亞型1和2，是有包膜的病毒，是人類遭遇的最普遍的感染劑，世界范圍內(nèi)感染了數(shù)百萬受試者。大的、復(fù)合的雙鏈DNA基因組編碼許多不同的基因產(chǎn)物，其中一些源 于剪接的轉(zhuǎn)錄物。除了病毒體和包膜結(jié)構(gòu)成分，該病毒編碼很多其他蛋白，包括蛋白酶、核 糖核苷酸還原酶、DNA聚合酶、ssDNA結(jié)合蛋白、解旋酶/引物酶、依賴于DNA的ATP酶、dUTP 酶和其他。HSV基因分為幾組，它們的表達(dá)是協(xié)同調(diào)控的并在隨后的級(jí)聯(lián)模式中是有序的 (Honess and Roizman, 1974 ；Honess and Roizmanl975)。 α 基因的表達(dá)，是感染后第 一批被表達(dá)的基因，由病毒體第16蛋白或α-反式誘導(dǎo)因子增強(qiáng)(Post et al. , 1981 ； Batterson andRoizman，1983)。β基因的表達(dá)需要有功能的α基因產(chǎn)物，最特別是ICP4， 由α 4基因編碼(DeLuca et al.，1985)。γ基因，編碼大部分病毒體結(jié)構(gòu)蛋白的異源基因 的組，需要用于最優(yōu)表達(dá)的病毒DNA合成的起始(Hollan et al.，1980)。在基因組復(fù)合性中，很多涉及HSV的生命周期。除了裂解周期，其能導(dǎo)致病毒顆粒 的合成，最后細(xì)胞死亡，所述病毒能進(jìn)入潛伏的狀態(tài)，其中病毒基因組維持在神經(jīng)的神經(jīng)節(jié) 中，直到一些還未確定的信號(hào)引發(fā)裂解周期再現(xiàn)。HSV的無毒突變體已被研發(fā)，并被容易地 用于基因治療領(lǐng)域(美國專利5，672，344)。痘苗病毒載體已被廣泛使用，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀妆粯?gòu)建，獲得相對(duì)高水平的表達(dá)，廣泛 的宿主范圍和攜帶大容量DNA。牛痘含有約1861Λ的線性雙鏈DNA基因組，表現(xiàn)出明顯的 “A-T”偏好。基因組側(cè)翼有約10. 51Λ的反向末端重復(fù)。大部分必要基因似乎定位在中心區(qū) 域，在痘病毒中非常高度保守。預(yù)計(jì)牛痘病毒中開放閱讀框的數(shù)目為150 200。盡管兩條 鏈都能編碼，但閱讀框的廣泛重疊并不普遍。至少251Λ能被插入到牛痘病毒基因組中(Smith and Moss，1983)。原型牛痘載 體經(jīng)過同源重組含有插入到病毒胸苷激酶基因的轉(zhuǎn)基因?；趖k-表型選擇載體。腦心肌 炎病毒的非翻譯前導(dǎo)序列的內(nèi)含物，表達(dá)水平比傳統(tǒng)載體的高些，在M小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)基因蓄積 10%或更多感染的細(xì)胞蛋白(Elroy-Stein et al.，1989)。待遞送的核酸可被裝封在感染的病毒中，該病毒已被改造表達(dá)特定結(jié)合配體。因 而所述病毒顆粒將特異結(jié)合靶細(xì)胞的同源受體，并遞送內(nèi)含物給所述細(xì)胞?；谀孓D(zhuǎn)錄病 毒的化學(xué)修飾，通過化學(xué)添加乳糖殘基到病毒包膜開發(fā)了旨在允許逆轉(zhuǎn)錄病毒特異性靶向 的新方法。該修飾通過唾液酸糖蛋白受體允許肝細(xì)胞特異性感染。設(shè)計(jì)了靶向重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的另一個(gè)方法，其中使用了針對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋 白和針對(duì)特定細(xì)胞受體的生物素化抗體。使用鏈霉親和素將所述抗體和生物素成分偶聯(lián) (Roux et al.，1989)。使用針對(duì)I型和II型主要組織相容性復(fù)合體抗原的抗體，他們證明 各種人類細(xì)胞的感染，用專宿病毒體外鉆孔那些表面抗原(Roux et al.，1989)。b.非病毒遞送基于脂質(zhì)的非病毒制劑提供可以替代病毒的基因治療。盡管許多細(xì)胞培養(yǎng)研究已 經(jīng)證明了基于脂質(zhì)的非病毒基因轉(zhuǎn)染，但通過基于脂質(zhì)的制劑進(jìn)行全身的基因遞送仍受限 制?；谥|(zhì)的非病毒的基因遞送的主要限制在于包含非病毒遞送媒質(zhì)的陽離子脂質(zhì)的毒 性作用。脂質(zhì)體的體內(nèi)毒性部分解釋了體內(nèi)和體外基因轉(zhuǎn)染結(jié)果的矛盾。造成這一矛盾 結(jié)果的另一個(gè)因素是，脂質(zhì)體在血清蛋白存在和缺失時(shí)的穩(wěn)定性不同。脂質(zhì)體和血清蛋白 的相互作用對(duì)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性有顯著影響(Yang and Huang, 1997) 0陽離子脂質(zhì)體吸引并 結(jié)合帶負(fù)電荷的血清蛋白。血清蛋白包被的脂質(zhì)體或者被溶解，或者被巨噬細(xì)胞攝入以使它們從血液循環(huán)中清除?，F(xiàn)行體內(nèi)脂質(zhì)體遞送的方法使用霧化吸入、皮下、皮內(nèi)、瘤內(nèi)或顱 內(nèi)注射，以避免血液循環(huán)中陽離子脂質(zhì)相關(guān)的毒性與穩(wěn)定性問題。脂質(zhì)體和血漿蛋白的相 互作用是體外、(Felgneret al.，1987)和體內(nèi)(Zhu et al. , 1993 ；Philip et al.，1993 ； Solodin et al. , 1995 ；Thierry et al. , 1995 ；Tsukamoto et al. , 1995 ；Aksentijevich et al. ,1996)基因轉(zhuǎn)移效率不同的主要原因。最近在脂質(zhì)體制劑中的進(jìn)步已經(jīng)提高了體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的效率(Templeton et al. 1997 ；WO 98/07408，通過引用并入本文)。由等摩爾比例的1，2-雙(油?；?基)-3-(三甲銨基)丙烷(DOTAP)和膽固醇組成的新的脂質(zhì)體制劑在體內(nèi)顯著提高全身的 基因轉(zhuǎn)移，約150倍。據(jù)稱所述DOTAP 膽固醇脂質(zhì)制劑形成一獨(dú)特的稱為“夾心脂質(zhì)體”的 結(jié)構(gòu)。該制劑被報(bào)道“夾心的” DNA在凹入的雙層或“瓶”結(jié)構(gòu)之間。這些脂質(zhì)體的有利特 性包括正電到負(fù)電荷或P，膽固醇膠體穩(wěn)定化，二維的DNA包裝和增加的血清穩(wěn)定性。脂質(zhì)制劑的生產(chǎn)通常在(I)逆相蒸發(fā)(II)脫水，補(bǔ)液(III)洗滌劑透析及(IV) 薄膜水化后，通過超聲降解法或脂質(zhì)體混合物的連續(xù)擠壓制備。一旦被制備，脂質(zhì)結(jié)構(gòu)可被 用于包裹在血液循環(huán)中是有毒的(化學(xué)治療劑)或不穩(wěn)定的(核酸)的化合物。脂質(zhì)體包 裹已為該化合物引起較低毒性和較長(zhǎng)血清半衰期(Gabizon et al.，1990)。在治療過度增 生疾病的具體治療中，數(shù)種疾病治療使用基于脂質(zhì)的基因轉(zhuǎn)移策略來增強(qiáng)傳統(tǒng)的或建立的 新治療。脂質(zhì)體是多孔結(jié)構(gòu)的，以脂質(zhì)雙層和內(nèi)部含水介質(zhì)為特征。多室脂質(zhì)體有多個(gè)被 含水介質(zhì)分割的脂質(zhì)層。當(dāng)脂質(zhì)懸浮于過多的水溶液中時(shí)，它們能自發(fā)形成。所述脂質(zhì)成 分在形成特定結(jié)構(gòu)之前發(fā)生自身重排，該結(jié)構(gòu)在脂質(zhì)雙層間內(nèi)含水和溶解的溶質(zhì)((^hosh andBachhawat, 1991)。親脂性分子或具有親脂性區(qū)域的分子可也能溶于或結(jié)合于脂質(zhì)雙層。脂質(zhì)體能攜帶有生物活性的核酸，這些核酸是完全隔離的。脂質(zhì)體可能含有一種 或更多核酸，并被施用給哺乳動(dòng)物宿主來有效遞送它的內(nèi)含物給靶細(xì)胞。所述脂質(zhì)體可含 有DOTAP和膽固醇或膽固醇衍生物。在某些實(shí)施方式中，DOTAP相對(duì)膽固醇、膽固醇衍生物 或膽固醇混合物的比例是約10 1 約1 10、約9 1 約1 9、約8 1 約1 8、 約7 1 約1 7、約6 1 約1 6、約5 1 約1 5、約4 1 約1 4、約 3 1 1 3、2 1 1 2和1 1。在另一些實(shí)施方式中，DOTAP和/或膽固醇濃 度是約 lmM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、IOmMUlmM^ 12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、 17mM、18mM、19mM、20mM、25mM 或 30mM。DOTAP 和 / 或膽固醇濃度可在約 ImM 約 20mM、ImM 約 18mM、lmM 約 16mM、約 ImM 約 14mM，約 ImM 約 12mM、約 ImM 約 10mM、l 8mM、2 7mM、3 6mM和4 5mM。在本發(fā)明中膽固醇衍生物可以容易地替代膽固醇或和膽固醇混 合。許多膽固醇衍生物為熟練的技術(shù)人員所知。例子包括但不限于乙酸膽固醇和油酸膽固 醇。膽固醇混合物指含有至少一個(gè)膽固醇或膽固醇衍生物的組合物?？墒褂媚せ?yàn)V器排除所述制劑，且這可進(jìn)行多次。所述技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所 熟知，例如在Martin(1990)中?？蛇M(jìn)行擠壓以均一化制劑或限制其尺寸。某些實(shí)施方式中 涉及的制備脂質(zhì)體的方法是加熱、超聲處理及通過遞減孔尺寸的濾器順序擠壓脂質(zhì)，由此 導(dǎo)致小、穩(wěn)定脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)形成。此制劑僅產(chǎn)生合適且統(tǒng)一尺寸的脂質(zhì)體復(fù)合物脂質(zhì)體，其在 結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定，且產(chǎn)生最大活性。
例如，預(yù)期在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中DOTAP 膽固醇脂質(zhì)體用Templeton等人 (1997;通過引用并入本文)的方法制備。因此，在一實(shí)施方式中，DOTAP(陽離子脂質(zhì))和 膽固醇(中性脂質(zhì))等摩爾濃度混合。然后粉末狀的脂質(zhì)混合物溶于氯仿，溶液形成薄膜， 干燥，然后薄膜在含5%右旋糖(w/v)的溶液中水化達(dá)到終濃度為20mMD0TAP和20mM膽固 醇。水化的薄膜在50°C水中旋轉(zhuǎn)水浴45分鐘，然后35°C另外水浴10分鐘并于室溫靜置 過夜。第二天所述混合物在50°C超聲處理5分鐘。超聲處理的混合物被轉(zhuǎn)移到試管，并在 50°C加熱10分鐘。該混合物通過減小孔徑(1 μ m、0. 45 μ m、0. 2 μ m、0. 1 μ m)的注射過濾器 連續(xù)擠壓。也預(yù)計(jì)其他脂質(zhì)體制劑和制備方法可被結(jié)合給予期望的DOTAP 膽固醇脂質(zhì)體特 性。制備用于核酸遞送的基于脂質(zhì)的制劑的方法報(bào)道于Saravolac等人(W0 99/18933)。 細(xì)節(jié)是方法，其中特異制備脂質(zhì)組合物，以包裹核酸。在另一個(gè)脂質(zhì)體制劑中，雙親性媒質(zhì) 稱為溶劑稀釋微載體(SDMC)能使特定分子整合到脂質(zhì)媒質(zhì)的雙層(美國專利5，879，703)。 所述SDMCs能被用于遞送脂多糖，核酸等等。當(dāng)然，任何其他脂質(zhì)體制備方法能被熟練地技 術(shù)人員使用來獲得本發(fā)明中期望的脂質(zhì)體制劑。為本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所知的遞送基因到瘤的其他制劑也用于本發(fā)明。本發(fā)明也包 括用于核酸表達(dá)構(gòu)件體局部遞送的納米顆粒的脂質(zhì)體制劑。例如，所述脂質(zhì)體制劑可含有 DOTAP和膽固醇。這一包含核酸表達(dá)構(gòu)件體的制劑的例子列于下文。陽離子脂質(zhì)(DOTAP)可與中性脂質(zhì)膽固醇(Chol)以等摩爾濃度混合(Avanti Lipids)?；旌系姆勰钪|(zhì)能在I-L圓底燒瓶中溶解于HPLC-級(jí)氯仿(Mallinckrodt， Chesterfield, Mo.)。溶解后，30°C下溶液在Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中旋轉(zhuǎn)30分鐘形成薄膜。 然后含有薄脂膜的燒瓶真空干燥15分鐘。一旦完全干燥，薄膜可在含5%右旋糖的水溶液 (D5W)中水化達(dá)到終濃度為20mM DOTAP和20mM膽固醇，稱為20mM DOTAP 膽固醇。水化的 脂膜在50°C水中旋轉(zhuǎn)水浴45分鐘，然后另外在35°C水浴10分鐘。然后混合物被允許放在 石蠟封口的燒瓶中室溫過夜，然后50°C低頻率超聲降解5分鐘(Lab-Line，TranSonic 820/ H)。超聲處理后，混合物被轉(zhuǎn)移到試管并在50°C加熱10分鐘。該混合物通過Whatman (Kent, UK)減小孔徑(1. 0 μ m、0. 45 μ m、0. 2 μ m、0. 1 μ m)的注射過濾器連續(xù)擠壓。Whatman Anotop 過濾器，0. 2 μ m和0. 1 μ m，也可被使用。經(jīng)過擠壓，所述脂質(zhì)體能于4°C儲(chǔ)存在氬氣中。將質(zhì)粒DNA形式的核酸表達(dá)構(gòu)件體，例如150 μ g可被稀釋于D5W。儲(chǔ)存的脂質(zhì)體 也可稀釋于D5W的分離的溶液。然后等體積的DNA溶液和脂質(zhì)體溶液被混合達(dá)到終濃度 (例如)150 μ g DNA/300 μ 1體積(2. 5 μ g/5 μ 1)。稀釋和混合可在室溫下進(jìn)行。然后可用 自動(dòng)移液器槍頭將DNA溶液迅速添加到脂質(zhì)體溶液表面。然后可將所述DNA 脂質(zhì)體混合 物在移液器槍頭中迅速上下混合2次以生成DOTAP 膽固醇核酸表達(dá)構(gòu)件體復(fù)合體。用所述說明書中的教導(dǎo)和本領(lǐng)域內(nèi)那些技術(shù)人員已知的知識(shí)，可以進(jìn)行檢驗(yàn)測(cè)定 DOTAP 膽固醇核酸表達(dá)復(fù)合體的顆粒大小。例如，DOTAP 膽固醇核酸表達(dá)構(gòu)件體復(fù)合體的 顆粒大小可用M-Coulter顆粒尺寸分析器(Beckman-Coulter)測(cè)定。關(guān)于這一測(cè)定，在顆 粒大小測(cè)定之前，應(yīng)將5μ 1新制備的復(fù)合體被稀釋在Iml水中。另外，分析中也可采用所 述復(fù)合體在0. D. 400nm的分光光度計(jì)測(cè)量。關(guān)于該分析，5 μ 1樣品可稀釋在95 μ 1 D5W中 使終體積達(dá)到100 μ 1。應(yīng)用上述制備技術(shù)和尺寸分析方法應(yīng)能證實(shí)復(fù)合體的大小在374 400nm之間。
納米膠囊通常能用穩(wěn)定并可再生的方式包裹化合物。為了避免細(xì)胞內(nèi)過度負(fù)荷的 副作用，這些超微粒子(大小約0.1 μ m)應(yīng)被設(shè)計(jì)為能在體內(nèi)被降解的多聚體。符合這些 要求的可生物降解的多烷基-氰基丙烯酸酯納米顆粒被預(yù)期用于本發(fā)明，并且這些顆粒能 被輕易制備?？珊捅景l(fā)明的方法和組合物聯(lián)用的并適合納米顆粒使用的方法包括美國專利 6，555，376、美國專利6，797，704、美國專利申請(qǐng)20050143336、美國專利申請(qǐng)20050196343 和美國專利申請(qǐng)20050260276，每個(gè)都通過引用整體特別并入本文中。以美國專利公開 20050143336為例，其提供納米顆粒制劑的例子，該顆粒以核酸的形式含有瘤抑制基因，比 如p53和FUS-1，這些核酸與陽離子脂質(zhì)(比如D0TAP)或中性脂質(zhì)(比如DOPE)復(fù)合形成 脂質(zhì)體。2.載體遞送和細(xì)胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)行發(fā)明中用于細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或機(jī)體轉(zhuǎn)化的合適的核酸遞送方法被認(rèn)為 包括幾乎任一種能導(dǎo)入核酸(例如，DNA)到細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或機(jī)體的方法，如本文所 述或如本領(lǐng)域內(nèi)任一普通的技術(shù)人員所知。這些方法包括但不限于DNA的直接遞送，比 如離體轉(zhuǎn)染(Wilson et al. , 1989 ；Nabel et al.，1989)，注射(美國專利 5，994，624， 5，981，274,5, 945，100,5, 780，448,5, 736，524,5, 702，932,5, 656，610,5, 589，466 和 5，580，859，每個(gè)都通過引用并入本文)，包括顯微注射(Harland and ffeintraub, 1985 ； 美國專利5，789，215，通過引用并入本文)，電穿孔(美國專利5，384，253，通過引用并 入本文；Tur-Kaspaet al. , 1986 ；Potter et al.，1984)，磷酸鈣沉淀(Graham and Van Der Eb, 1973 ；Chen and Okayama, 1987 ；Rippe et al.，1990)；用 DEAE-右旋糖酐后使 用聚乙二醇(Gopal,1985)；直接超聲加載(Fechheimer etal. , 1987)；脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn) 染(Nicolau and Sene,1982 ；Fraley etal. ,1979 ；Nicolau et al. ,1987 ；Wong et al., 1980 ；Kaneda et al.，1989 ；Kato et al.，1991)和受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(ffu and Wu, 1987 ；Wu and ffu, 1988)；微粒轟炸(W0 94/09699 和 WO 95/06128 ；美國專利 5，610，042 ；5，322，783， 5，563，055，5，550，318，5，538，877和5，538，880，每個(gè)都通過引用并入本文)；碳化硅纖維 攪動(dòng)(Kaeppler et al.，1990 ；美國專利5，302，523和5，464，765，每個(gè)都通過引用并入本 文)；和這些方法的任意組合。3.表達(dá)系統(tǒng)各種表達(dá)系統(tǒng)表現(xiàn)為包含至少部分或全部上述組合物?；谠撕?或真核的系 統(tǒng)能被用于本發(fā)明來生產(chǎn)核酸序列，或它們的同源多肽、蛋白和肽。許多這些系統(tǒng)可商業(yè)化 并廣泛使用。昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒系統(tǒng)能制備高水平的異源核酸片段的蛋白表達(dá)，例如報(bào) 道于美國專利5，871，986、4，879，236，都通過引用并入本文，其可以購買，例如，來自 Invitrogen 的 MaxBaC 2. 0 和來自 Clontech 的 BacPack Baculovirus Expression System。其他表達(dá)系統(tǒng)例子包括Stratagene 的 Complete Control Inducible Mammalian Expression System，其涉及合成的蛻化素誘導(dǎo)的受體，或它的pET表達(dá)系 統(tǒng)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的另一個(gè)例子可從Invitrogen 得到，其攜帶 T-Rex (調(diào)控四環(huán)素的表達(dá))系統(tǒng)，是使用全長(zhǎng)CMV啟動(dòng)子的可誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。 Invitrogen 也提供酵母表達(dá)系統(tǒng)，稱作甲醇畢赤酵母(Pichiamethanolica)的表達(dá)系統(tǒng)，其被設(shè)計(jì)于在甲基營養(yǎng)型酵母甲醇畢赤酵母中重組蛋白的高水平生產(chǎn)。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù) 人員知道怎樣表達(dá)載體，比如表達(dá)構(gòu)件體，來生產(chǎn)核酸序列或其同源的多肽、蛋白或肽。預(yù)期治療性基因可以是“過表達(dá)的”，S卩，以相對(duì)細(xì)胞中天然表達(dá)增加的水平表達(dá)。 該過表達(dá)可用各種方法評(píng)估，包括放射性標(biāo)記和/或蛋白純化。然而，預(yù)期使用簡(jiǎn)單而直接 的方法，例如，那些涉及SDS/PAGE和蛋白染色或蛋白印記，隨后進(jìn)行定量分析，比如所得到 的凝膠或印記的光密度掃描。重組蛋白、多肽或肽水平相對(duì)于天然細(xì)胞中水平的特異性增 長(zhǎng)指示為過表達(dá)，即是特異的蛋白、多肽或肽相對(duì)于宿主細(xì)胞生產(chǎn)的其他蛋白的相對(duì)豐度， 例如，在凝膠上可見。在某些實(shí)施方式中，表達(dá)的蛋白質(zhì)序列在宿主細(xì)胞內(nèi)形成內(nèi)涵體，裂解該宿主細(xì) 胞，例如，通過細(xì)胞勻漿器破裂，沖洗和/或離心從可溶的細(xì)胞成分中分離濃密的內(nèi)涵體和 細(xì)胞膜。該離心可在合適的條件下進(jìn)行，其中通過將糖(比如，蔗糖)合并到緩沖液中，濃 密的內(nèi)涵體被選擇性地富集，并以選定的速度離心。內(nèi)涵體可以溶解于含有高濃度(例如， 8M)尿素或促溶劑(比如還原劑(比如，β -巰基乙醇、DTT (二硫蘇糖醇))存在下的鹽酸 胍)的溶液中，然后再折疊為更期望的構(gòu)象，這為本領(lǐng)域內(nèi)普通的技術(shù)人員所知。治療性基因的核酸和蛋白序列已經(jīng)在先前報(bào)道，并可見于為本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人 員所知的電腦數(shù)據(jù)庫。其中一個(gè)數(shù)據(jù)庫是美國生物信息學(xué)中心的Genbank和GenP印t數(shù)據(jù) 庫(www. ncbi. nlm. nih. gov/)。這些已知基因的編碼區(qū)域可以被擴(kuò)增和/或表達(dá)，通過用本 文所公開的技術(shù)或本領(lǐng)域內(nèi)那些普通技術(shù)人員所知的任何技術(shù)。另外，肽序列可以用本領(lǐng) 域內(nèi)那些普通技術(shù)人員所知的方法合成，比如使用自動(dòng)的肽合成機(jī)器進(jìn)行肽合成，比如可 從 Applied Biosystems (Foster City, CA)得到的機(jī)器。IV.聯(lián)合瘤治療根據(jù)本發(fā)明的某些方面，一個(gè)或更多治療可被使用給患者以聯(lián)合的益處。這些治 療包括輻射、化療、手術(shù)、細(xì)胞因子、免疫治療、生物治療、毒素、藥物、飲食、或基因療法。例 子如下文所述。為了殺死癌細(xì)胞，減緩它們的生長(zhǎng)或達(dá)到上述的任何臨床終點(diǎn)，可以對(duì)癌細(xì)胞或 瘤接觸第一 P53基因治療并結(jié)合第二抗癌治療。這兩種形式可以對(duì)于殺死或抑制癌細(xì)胞的 增生，或者達(dá)到理想的臨床終點(diǎn)，包括增長(zhǎng)的患者存活期來說有效組合量提供。該過程可涉 及同時(shí)用兩種形式接觸癌細(xì)胞或瘤。這也可以通過用單獨(dú)包括兩種制劑的組合物或藥物制 劑接觸癌細(xì)胞或瘤，或者通過用兩種不同的組合物或制劑接觸癌細(xì)胞或瘤，同時(shí)，其中一個(gè) 組合物包括第一基因治療，另一個(gè)包括第二治療?；蛘撸龅谝?p53基因治療可先于或晚于第二治療，二者間隔從幾分鐘到幾周。 在兩種形式分別施用給癌細(xì)胞或瘤的實(shí)施方式中，通常保證明顯的功效時(shí)間周期在每次遞 送時(shí)間之間不停止，如此以致二者都仍能對(duì)癌細(xì)胞或瘤發(fā)揮有利的組合效應(yīng)。在某些例子 中，預(yù)計(jì)用兩種形式在彼此間隔約12 M小時(shí)內(nèi)接觸細(xì)胞，更具體的為在約6 12小時(shí) 內(nèi)，只有約12小時(shí)的延遲時(shí)間最為具體。但在某些情況下，期望顯著延長(zhǎng)治療的時(shí)間周期， 在各個(gè)施用之間有幾天0、3、4、5、6或7)到幾周(1、2、3、4、5、6、7或8)時(shí)間?？梢韵胍姼鱾€(gè)形式多于一次的施用將是期望的?？梢允褂酶鞣N組合，其中第一基 因治療是“A”，第二治療是“B”Α/Β/Α Β/Α/Β Α/Β/Α Α/Α/Β Α/Β/Β Β/Α/Α Β/Β/Β/Α B/A/B/B
Β/Β/Α/Β Α/Α/Β/Β Α/Β/Α/Β Α/Β/Β/Α Β/Β/Α/Α B/A/B/AΒ/Α/Α/Β Α/Α/Α/Β Β/Α/Α/Α Α/Β/Α/Α Α/Α/Β/Α A/B/B/BA.編碼治療件基因的治療件核酸如上文所述，在本發(fā)明的各種實(shí)施方式中需要對(duì)患者提供治療性基因，旨在治療 過度增生疾病。本申請(qǐng)中所述術(shù)語“基因治療”可定義為遞送治療性基因或其他治療性核 酸給有需要的患者，用于治療過度增生疾病或治療這一癥狀，即如不治療將導(dǎo)致過度增生 疾病。包含在“治療性基因”定義之內(nèi)的是“生物功能等同”的治療性基因。因此，和等同 于或功能等同于治療性基因氨基酸的氨基酸有約70% 約99%同源性的序列將是這些序 列，其中這些序列是提供保持了蛋白的生物活性的生物功能等同物。治療性基因的種類包 括抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)物、促凋亡基因、細(xì)胞因子、毒素、抗血管生成因子、抑制癌基因 的分子、促血管生成因子、生長(zhǎng)因子、反義轉(zhuǎn)錄物、核酶和RNAi。治療性基因的例子包括但不限于Rb、CFTR、pl6、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC, CTS-I、zacl、scFV ras、DCC, NF-U NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II, BRCAl、VHL, MMACl、FCC、 MCC, BRCA2、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、 GM-CSF、G-CSF、胸苷激酶、mda7、fus、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-y、ADP、p53、ABLI, BLC1、BLC6、CBFAl、CBL, CSFIR、ERBA, ERBB, EBRB2、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、 HRAS, JUN、KRAS, LCK, LYN、MDM2、MLL, MYB, MYC, MYCLU MYCN, NRAS, PIMl、PML, RET、SRC、 TALI、TCL3、YES、MADH4、RBI、TP53、WT1、TNF、BDNF, CNTF, NGF, IGF、GMF, aFGF、bFGF、NT3、 NT5、ApoAI、ApoAIV、ApoE、RaplA、胞嘧啶脫氨酶、Fab、ScFv、BRCA2、zacl、ATM、HIC-l、DPC-4、 FHIΤ, PTEN、INGU NOEYU N0EY2、OVCAU MADR2、53BP2、IRF-U Rb、zacl、DBCCR-U rks_3、 COX-1、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、 VEGF, FGF、凝血酶敏感素、BAI-I、GDAIF 或 MCC。治療性基因的其他例子包括編碼酶的基因。例子包括但不限于，ACP脫氫酶、ACP 羥化酶、ADP-葡萄糖磷酸化酶、ATP酶、乙醇脫氫酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、過氧化氫酶、 纖維素酶、環(huán)氧合酶、脫羧酶、糊精酶、酯酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、透明紙酸合酶、半乳糖 苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纖維素酶、透明質(zhì)酸酶、整合酶、轉(zhuǎn)化酶、 異構(gòu)酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂肪氧化酶、裂合酶、溶菌酶、果膠酯酶、過氧化物酶、磷酸 酶、磷脂酶、磷酸化酶、果膠酶、蛋白酶、肽酶、支鏈淀粉酶、重組酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、 木聚糖酶、報(bào)告基因、白介素或細(xì)胞因子。另一些治療性基因的例子包括編碼以下酶的基因氨甲酰合成酶I、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨 甲酰酶、精氨基琥珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、 苯丙氨酸羥化酶、α "I抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受體、膽色素原脫氨 酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚-β -合酶、支鏈酮酸脫羧酶、白蛋白、異戊酰輔酶A脫氫酶、 丙酰輔酶A羧化酶、甲基丙二酰輔酶A變位酶、戊二酰輔酶A脫氫酶、胰島素、β -葡萄糖 苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脫羧酶、H-蛋白、T-蛋白、門克斯 病銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶、威爾森氏癥銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶、胞嘧啶脫氨酶、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖 轉(zhuǎn)移酶、半乳糖-1-磷酸鹽尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、苯丙氨酸羥化酶、葡萄糖腦苷脂酶、鞘磷脂酶、 α -L-艾杜糖苷、葡萄糖-6磷酸脫氫酶、HSV胸苷激酶或人類胸苷激酶。治療性基因也包括編碼激素的基因。例子包括但不限于編碼下列激素的基因生長(zhǎng)激素、催乳激素、胎盤催乳素、黃體激素、卵泡刺激素、絨毛膜促性腺激素、促甲狀腺激素、 瘦素、促腎上腺皮質(zhì)激素、血管緊張素I、血管緊張素II、β -內(nèi)啡肽、β -黑素細(xì)胞刺激素、 膽囊收縮素、內(nèi)皮素1、甘丙肽、抑胃肽、胰高血糖素、胰島素、促脂解素、神經(jīng)垂體素運(yùn)載蛋 白、生長(zhǎng)抑素、降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽、β -降鈣素基因相關(guān)肽、高鈣血癥惡性因子、甲狀 旁腺激素相關(guān)蛋白、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白、胰高血糖素樣肽、胰抑素、胰肽、肽ΥΥ、ΡΗΜ、分 泌素、血管活性腸肽、催產(chǎn)素、加壓素、加壓催產(chǎn)素、腦啡肽酰胺、metorphinamide, α -黑素 細(xì)胞刺激素、心鈉素、糊精、淀粉樣蛋白P成分、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、生長(zhǎng)激素釋放 因子、促黃體激素釋放激素、神經(jīng)肽Y、K物質(zhì)、P物質(zhì)、或促甲狀腺激素釋放激素。治療性基因的其他例子包括編碼存在于過度增生疾病組織的抗原的基因，該抗原 能用于引起對(duì)該組織的免疫應(yīng)答?？拱┟庖咧委熢诒绢I(lǐng)域內(nèi)眾所周知，例如，更多的細(xì)節(jié)在 PCT申請(qǐng)W00333029，W00208436，W00231168和W00285^7，每個(gè)都通過弓|用整體特別并入本 文。還有其他治療性基因是編碼抑制分子的基因，比如反義核酸、核酶、SiRNA和單鏈 抗體。這些分子能被方便地用于抑制過度增生基因，比如，癌基因、細(xì)胞增生和促血管生成 因子的誘導(dǎo)物。1.編碼瘤抑制物的核酸“瘤抑制物”是指多肽，當(dāng)其存在于細(xì)胞中，降低細(xì)胞的致瘤性、惡性、或過度增生 表型。編碼瘤抑制物基因氨基酸序列的核酸序列包括瘤抑制基因的全長(zhǎng)核酸序列，和源于 全長(zhǎng)序列的任一長(zhǎng)度的非全長(zhǎng)序列。還應(yīng)了解所述序列包括天然序列的簡(jiǎn)并密碼子或在特 異宿主細(xì)胞中被導(dǎo)入提供密碼子優(yōu)選的序列。本文定義的“瘤抑制基因”通常指降低細(xì)胞的致瘤性、惡性、或過度增生表型的核 酸序列。因此，瘤抑制物基因在別的健康細(xì)胞中正常表達(dá)的缺失、突變或擾亂增加了細(xì)胞變 為瘤狀態(tài)的可能性，或?qū)е录?xì)胞變?yōu)榱鰻顟B(tài)。相反，當(dāng)有功能的瘤抑制基因或蛋白存在于 細(xì)胞中，它的存在抑制了細(xì)胞的致瘤性、惡性、或過度增生表型。該定義內(nèi)的瘤抑制核酸的 例子包括但不限于，APC、CYLD, HIN-U KRAS2b、pl6、pl9、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、 PTEN、Rb、子宮珠蛋白、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC, DPC4、MADR2/JV18、FHIT, MENl、MEN2、MTSl、NFl、NF2、VHL、WRN、WTl、CFTR、C-CAM、CTS-l、zacl、scFV、ras、MMACl、FCC、 MCC、基因 26(CACNA2D2)、PL6、β * (BLU) ,Luca-I (HYALl)、Luca_2 (HYAL2)、123F2 (RASSFl)、 101F6、基因21 (NPRL2)或編碼SEM A3多肽和FUSl的基因。其他例示瘤抑制基因報(bào)道于瘤 抑制基因數(shù)據(jù)庫(www. cise. ufl. edu/ yyl/HTML-TSGDB/Hom印age. html)，通過引用并入 本文。該數(shù)據(jù)庫，本文通過引用特別并入到這里和本申請(qǐng)的所有其他章節(jié)。編碼瘤抑制基 因的核酸，如上所述，包括瘤抑制基因，或其核酸衍生物(例如，cDNAs、cRNAs、mRNAs，和其 中編碼各個(gè)瘤抑制物氨基酸序列活性片段的子序列)，和包含這些序列的載體。本領(lǐng)域內(nèi)普 通的技術(shù)人員熟悉能用于本發(fā)明的瘤抑制基因。2.編碼單鏈抗體的核酶在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本文所述藥物組合物和裝置的核酸編碼單鏈抗體。 單鏈抗體報(bào)道于美國專利4，946，778和5，888，773，每個(gè)都通過引用并入本文。3.編碼細(xì)胞因子的核酸所述術(shù)語“細(xì)胞因子”是由一種細(xì)胞群釋放的作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一細(xì)胞的蛋白的通稱?！凹?xì)胞因子氨基酸序列”是指多肽，當(dāng)其存在于細(xì)胞中時(shí)，保持細(xì)胞因子的一些 或全部功能。編碼細(xì)胞因子氨基酸序列的核酸序列包括細(xì)胞因子的全長(zhǎng)核酸序列和源于全 長(zhǎng)序列的任一長(zhǎng)度的非全長(zhǎng)序列。還應(yīng)理解，如上所述，所訴序列包括天然序列的簡(jiǎn)并密碼 子或在特異宿主細(xì)胞中被倒入提供密碼子優(yōu)選的序列。這些細(xì)胞因子的例子是淋巴因子、單核因子、生長(zhǎng)因子和傳統(tǒng)的多肽激素。所 述細(xì)胞因子包括生長(zhǎng)激素，比如，人生長(zhǎng)激素、N-蛋氨酰人類生長(zhǎng)激素、牛生長(zhǎng)激素、甲狀 旁腺激素、甲狀腺素、胰島素、胰島素原、松弛素、松弛素原；糖蛋白激素，比如卵泡刺激素 (FSH)、甲狀腺刺激激素(TSH)和促黃體生成素(LH)；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；前列腺素、成纖維 細(xì)胞生長(zhǎng)因子、催乳素、胎盤催乳素、OB蛋白、瘤壞死因子-α及-β ；繆勒(氏)管抑制 物質(zhì)、小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素、激活素、囊內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整合素；血小板生成素 (TPO)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子，比如NGF-β、血小板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFs)，比如TGF-α 和TGF-β ；類島素樣生長(zhǎng)因子-I和II;紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子；干擾素，比如 干擾素-α、-β、- Y ；集落刺激因子(CSF)，比如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)；粒細(xì)胞-巨噬細(xì) 胞-CSF(GM-CSF)；和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，比如 IL-U IL-I α、IL-2、IL-3、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、 IL-17、IL-18、IL-24 (MDA-7)、LIF、G-CSF, GM-CSF, M-CSF, ΕΡ0、kit-配體或 FLT-3。4.編碼促凋亡基因/稈序件細(xì)胞死亡調(diào)控物的核酸凋亡，或程序性細(xì)胞死亡，是正常胚胎發(fā)育，維持成體組織中穩(wěn)態(tài)和抑制癌發(fā)生的 必要過程(Kerr et al.，1972)。Bcl_2蛋白家族和ICE樣蛋白酶已被證明是某些系統(tǒng)中重 要的凋亡調(diào)節(jié)劑和效應(yīng)物。發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白與濾泡性淋巴瘤相關(guān)，在控制凋亡和促進(jìn)細(xì)胞 響應(yīng)各種凋亡刺激而存活中有重要作用(Bakhshi et al. ,1985 ；Cleary and Sklar, 1985 ； Cleary et al. , 1986 ；Tsujimoto et al. , 1985 ；Tsujimoto and Croce, 1986)?，F(xiàn)在認(rèn)為 進(jìn)化保守的Bcl-2蛋白是相關(guān)蛋白家族的一員，這些蛋白被劃分為死亡激動(dòng)劑或死亡拮抗 劑。隨后的發(fā)現(xiàn)表明Bcl-2發(fā)揮抑制各種刺激引發(fā)的細(xì)胞死亡的作用。同樣，現(xiàn)已知 存在Bcl-2細(xì)胞死亡調(diào)控蛋白家族，這些蛋白有著共同的結(jié)構(gòu)和序列同源性。已發(fā)現(xiàn)這些 不同的家族成員或與Bcl-2具有相似功能(BclXL，Bclw，Bcls，Mcl-l，Al，Bfl-l)，或與Bcl-2 功能相反而促進(jìn)細(xì)胞死亡。后者稱為促凋亡基因，編碼誘導(dǎo)或維持凋亡至活化形式的蛋白。 本發(fā)明預(yù)計(jì)任何促凋亡基因氨基酸序列的內(nèi)含物為本領(lǐng)域內(nèi)那些普通技術(shù)人員所知。例示 促凋亡基因包括CD95、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3、Bax, Bag-U CRADD, TSSC3、bax, hid、 Bak、MKP-7、PERP、bad、bcl-2, MST1、bbc3、Sax、BIK、BID 和 mda7。本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員 熟悉促凋亡基因和本文未特別列出的其他這些基因，這些基因能用于本發(fā)明的方法和組合 物中。編碼促凋亡基因氨基酸序列的核酸包括促凋亡基因或它們的核酸衍生物(例如， cDNAs、cRNAs、mRNAs，和其中編碼各促凋亡氨基酸序列活性片段的子序列)，和包含這些序 列的載體?！按俚蛲龌虬被嵝蛄小笔侵付嚯?，當(dāng)其存在于細(xì)胞中時(shí)，誘導(dǎo)或促進(jìn)凋亡。5.編碼血管生成抑制劑的核酸血管生成抑制劑包括血管生成抑制因子和內(nèi)皮抑素。血管生成抑制因子是約200 氨基酸的多肽。它產(chǎn)生于纖溶酶原的斷裂，所述纖溶酶原是溶解血栓的重要血漿蛋白質(zhì)。血管生成抑制因子結(jié)合暴露于細(xì)胞表面嵌入在質(zhì)膜中的ATP合酶的亞基。在最近發(fā)現(xiàn)之 前，僅知ATP合酶為線粒體蛋白。內(nèi)皮抑素是184個(gè)氨基酸的多肽。它是發(fā)現(xiàn)于XVIII型 (Mulder et al. , 1995)膠原蛋白的C端的球狀結(jié)構(gòu)域，所述XVIII型膠原蛋白是發(fā)現(xiàn)于血 管上的膠原蛋白，從親體分子的切下。血管生成抑制劑也包括抑制劑或促血管生成因子，比如反義核酸、核酶、SiRNAs和 單鏈抗體，這些報(bào)道于本文的別處。上皮細(xì)胞在其表面表達(dá)跨膜蛋白，稱為整合素，它們通 過所述整合素把自己錨定在細(xì)胞外基質(zhì)。結(jié)果是瘤上的新血管表達(dá)血管整合素，稱為αν/ β 3，其沒有發(fā)現(xiàn)于正常組織的舊血管中。Vitaxin ,直接針對(duì)所述α ν/β 3血管整合素 的單克隆抗體，在小鼠中減小瘤而不傷害它們。在人類2期臨床試驗(yàn)中，Vitaxin 已在減 小實(shí)體瘤而不引起有害副作用上表現(xiàn)出一些前景。6.編碼細(xì)胞增牛誘導(dǎo)物的核酸誘導(dǎo)細(xì)胞增生的蛋白還可據(jù)其功能分為各類。所有這些蛋白的通性是它們能調(diào)控 細(xì)胞增生。例如，PDGF形式，sis癌基因，是分泌的生長(zhǎng)因子。致癌基因很少是源于編碼生 長(zhǎng)因子的基因，并且目前為止，sis是已知僅有的自然發(fā)生的致癌的生長(zhǎng)因子。蛋白質(zhì)FMS、ErbA、ErbB和neu是生長(zhǎng)因子受體。這些受體的突變引起調(diào)控功能的 喪失。例如，影響Neu受體蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變產(chǎn)生neu致癌基因。erbA致癌基因源 于甲狀腺激素的細(xì)胞內(nèi)受體。修飾的致癌的ErbA受體被認(rèn)為其和內(nèi)源性甲狀腺激素受體 競(jìng)爭(zhēng)，引起生長(zhǎng)失控。最大一類致癌基因包括所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(例如，Src, Abl和Ras)。蛋白Src是 細(xì)胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶，在某些情況下它從原癌基因形式轉(zhuǎn)化到致癌基因，源于酪氨酸殘 基527上突變。相反，在一例子中，GTP酶蛋白ras從原癌基因到致癌基因的轉(zhuǎn)化，源于其 序列第12氨基酸上纈氨酸到甘氨酸的突變，降低了 ras GTP酶活性。蛋白質(zhì)Jim、Fos和Myc是在細(xì)胞核上直接發(fā)揮它們作為轉(zhuǎn)錄因子作用的蛋白質(zhì)。反義核酸方法利用核酸趨向和互補(bǔ)序列配對(duì)這一事實(shí)。說道互補(bǔ)，它意味著多核 苷酸是那些能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick互補(bǔ)規(guī)則堿基配對(duì)的多核苷酸。即是，DNA中較大 的嘌呤將和較小的嘧啶堿基配對(duì)來形成鳥嘌呤和胞嘧啶配對(duì)(G:C)，腺嘌呤和胸腺嘧啶配 對(duì)(A:T)，或在RNA中為腺嘌呤和尿嘧啶配對(duì)(A:U)的組合。內(nèi)含的稀有堿基，比如肌苷、 5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黃嘌呤和其他雜交序列中不干擾配對(duì)的堿基。具有多核苷酸的靶雙鏈(ds)DNA引起三螺旋形成；靶向RNA將引起雙螺旋形成。 反義多核苷酸，當(dāng)導(dǎo)入到靶細(xì)胞中，特異結(jié)合它們的靶多核苷酸并干擾其轉(zhuǎn)錄、RNA加工、轉(zhuǎn) 運(yùn)、翻譯和/或穩(wěn)定性。反義RNA構(gòu)建體或編碼這些反義RNA的DNA在宿主細(xì)胞中可能被 用于在體外或者在體內(nèi)抑制基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯或二者都有，比如在宿主動(dòng)物內(nèi)，包括人受 試者。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，預(yù)計(jì)用于細(xì)胞增生特定誘導(dǎo)物的siRNAs、核酶和單鏈抗 體治療能被用于阻止細(xì)胞增生誘導(dǎo)物的表達(dá)，并因此對(duì)癌癥患者提供臨床益處。7.其他基于核酸的治療反義構(gòu)件體可被設(shè)計(jì)用于結(jié)合啟動(dòng)子和其他調(diào)控區(qū)域、外顯子、內(nèi)含子或甚至基 因的外顯子-內(nèi)含子交界。預(yù)計(jì)最有效的反義構(gòu)件體將包括外顯子/內(nèi)含子剪接點(diǎn)的互補(bǔ) 區(qū)。因此，有人提議一個(gè)具體的實(shí)施方式包括具有外顯子/內(nèi)含子剪接點(diǎn)互補(bǔ)區(qū)內(nèi)50 200堿基的反義構(gòu)件體。已觀測(cè)到一些外顯子序列能被包含于沒有嚴(yán)重影響其靶選擇性的構(gòu)件體。包含的外顯子物質(zhì)的量變化取決于具體使用的外顯子和內(nèi)含子序列。可以簡(jiǎn)單通 過體外檢測(cè)所述構(gòu)件體來容易地檢測(cè)是否包含過多外顯子DNA，以確定正常的細(xì)胞功能是 否被影響或具有互補(bǔ)序列的相關(guān)基因的表達(dá)是否被影響。如上所述，“互補(bǔ)”或“反義”是指在其全長(zhǎng)上有充分互補(bǔ)的多核苷酸序列，并且很 少有堿基錯(cuò)配。例如，長(zhǎng)為15個(gè)堿基的序列，當(dāng)其在13或14個(gè)位置上有互補(bǔ)核苷酸時(shí)可 以被稱為互補(bǔ)的。自然，完全互補(bǔ)的序列是指序列在全長(zhǎng)中完全互補(bǔ)并且沒有堿基錯(cuò)配的 序列。其他具有較低同源性的序列也是預(yù)期的。例如，可設(shè)計(jì)具有有限的高度同源的區(qū)域， 但也含有非同源區(qū)域(例如，核酶，見下文)的反義構(gòu)件體。這些分子，盡管只有低于50% 的同源性，但仍能在合適的條件下結(jié)合靶序列。結(jié)合部分基因組DNA和cDNA或合成序列來生成特異的構(gòu)件體是有利的。例如，期 望內(nèi)含子存在與最終的構(gòu)件體中，需要使用基因組的克隆。所述cDNA或合成的多核苷酸可 提供更多方便的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)來保留所訴構(gòu)件體部分，因此將用于其余序列。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本文所述藥物組合物和裝置的核酸是核酶。盡管傳 統(tǒng)上蛋白已用于核酸的催化，但另一種大分子在該研究中已表現(xiàn)為有用。核酶是RNA-蛋 白復(fù)合體，以位點(diǎn)特異的模式切割核酸。核酶有具有內(nèi)切酶活性的特異的催化結(jié)構(gòu)域(Kim and Cook, 1987 ；Gerlach et al. , 1987 ；Forster and Symons，1987)。例如,大量核Bl力口 速具有高度特異性的磷酸酯轉(zhuǎn)移反應(yīng)，通常在寡核苷酸底物的幾個(gè)磷酸酯中的僅一處斷裂 (Cook et al.，1981 ；Michel and Westhof, 1990 ；ReinhoId-Hurek and Shub，1992)。該特 異性歸因于需要在化學(xué)反應(yīng)之前，底物通過特異的堿基配對(duì)相互作用結(jié)合核酶的內(nèi)部指導(dǎo) 序列(“IGS，，)。核酶催化最初被視為涉及核酸的序列特異切割/連接反應(yīng)的一部分(Joyce， 1989 ；Cook et al.，1981)。例如，美國專利5，354，855報(bào)道某些核酶能用作比已知核酸酶 具有更高序列特異性的內(nèi)切酶。并具有接近于DNA限制性內(nèi)切酶的特異性。因此，序列特 異的核酶介導(dǎo)的基因表達(dá)的抑制可特別適合于治療應(yīng)用Gcanlon et al. , 1991 ；Sarveret al.，1990)。最近，報(bào)道了核酶在一些應(yīng)用了所述核酶的細(xì)胞系中引發(fā)基因變化，所述改變 的基因包括致癌基因H-raS、c-f0S和HIV基因。大部分該研究涉及靶mRNA的修飾，基于由 特異核酶斷裂的特異突變的密碼子。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本文所述的藥物組合物的治療性核酸是RNAi。RNA 干擾(也稱為“RNA-介導(dǎo)的干擾”或RNAi)是降低或消除基因表達(dá)的機(jī)制。雙鏈RNA (dsRNA) 已被觀測(cè)到能介導(dǎo)降低反應(yīng)，這是多步驟進(jìn)程。dsRNA激活轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)監(jiān)控機(jī)制，該 機(jī)制表面功能為保護(hù)細(xì)胞遠(yuǎn)離病毒感染并具有轉(zhuǎn)座活性(Fire et al. , 1998 ；Grishok et al. ，2000 ；Ketting et al. ,1999 ；Lin and Avery et al. ,1999 ；Montgomery et al. ,1998 ； Sharp and Zamore，2000 ;Tabara etal.，1999)。這些機(jī)制靶向用于破壞的成熟的活化，使 dsRNA-互補(bǔ)的mRNA。RNAi為基因功能的研究提供主要的實(shí)驗(yàn)優(yōu)勢(shì)。這些優(yōu)勢(shì)包括非常高 的特異性，易于移動(dòng)穿過細(xì)胞膜，并靶基因的延長(zhǎng)的下調(diào)(Fire et al. , 1998 ；Grishok et al. ，2000 ；Ketting et al. , 1999 ；Lin andAvery et al. ,1999 ；Montgomery et al. ,1998 ； Sharp et al.，1999 ；Sharpand Zamore, 2000 ；Tabara et al. , 1999)。此夕卜，dsRNA 已被證明 在廣泛的系統(tǒng)范圍中使基因沉默，包括植物、原生動(dòng)物、真菌、線蟲、錐蟲、果蠅和哺乳動(dòng)物 (Grishok et al. ,2000 ；Sharp et al. ,1999 ；Sharpand Zamore,2000 ；Elbashir et al.,2001)。通常認(rèn)為RNAi在轉(zhuǎn)錄后作用，靶向用于降解的RNA轉(zhuǎn)錄物。似乎細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì) RNA 都能被靶向(Bosher and Labouesse，2000)。已知核糖核酸內(nèi)切酶生成兩類調(diào)控記憶表達(dá)的小的調(diào)控RNAs 小干擾 RNAs(siRNAs)和微 RNAs(miRNAs)(Bernstein et al. ,2001 ；Grishok et al. ,2001 ； Hutvgner et al.，2001 ；Ketting et al.，2001 ；Knightand Bass, 2001)。在動(dòng)物中，siRNAs 直接靶向 mRNA 的斷裂(Elbashiret al.，2001)，而 miRNAs 阻斷 mRNA 的翻譯(Lee et al.， 1993 ；Reinhartet al.，2000 ；Brennecke et al.，2003 ；Xu et al.，2003)。最近資料提示， 將siRNAs和miRNAs并入到類似或甚至等同的蛋白復(fù)合體中，mRNA破壞對(duì)翻譯調(diào)控的關(guān)鍵 決定因素是小RNA和其靶mRNA的序列互補(bǔ)程度(Hutvgner and Zamore,2002 ；Mourelatos et al. ,2002 ；Zeng et al. ,2002 ；Doench et al. ,2003 ；Saxena et al. ,2003 ；Zeng et al.，2003)。許多已知的miRNA序列和它們?cè)诨蚪M或染色體中的位置見于www. sanger. ac. uk/Software/Rfam/mirna/belp/summary, shtml。siRNAs必須被這樣設(shè)計(jì)以使它們?cè)谝种颇康幕虻谋磉_(dá)中是特異的和有效的。選 擇靶序列(即，那些存在于一個(gè)或多個(gè)所述目的基因中的序列，其中siRNAs指導(dǎo)降解機(jī)理) 的方法旨在避免可能干擾siRNAs指導(dǎo)功能的序列，盡管其包含特異于一個(gè)或多個(gè)基因的 序列。通常，長(zhǎng)度約21 23個(gè)核苷酸的siRNA靶序列是最有效的。該長(zhǎng)度反映了源于上 述更長(zhǎng)的RNAs加工的消化產(chǎn)物的長(zhǎng)度(Montgomery etal.，1998)。siRNAs的制備主要通過化學(xué)直接合成；通過較長(zhǎng)的雙鏈RNAs暴露于果蠅胚胎裂 解物的加工；或通過源于S2細(xì)胞的體外系統(tǒng)。細(xì)胞裂解或體外加工的使用還可涉及隨后從 裂解物等分離短的、21 23個(gè)核苷酸siRNAs，使該加工有些累贅和昂貴。通過制備兩條單 鏈RNA-寡聚物，隨后將兩條單鏈寡聚物退火形成雙鏈RNA來進(jìn)行化學(xué)合成?；瘜W(xué)合成的方 法多種多樣。非限制性例子報(bào)道于美國專利5，889，136,4, 415，723和4，458，066 (通過引 用特別并入本文)和Wincott等人(1995)。另外幾個(gè)siRNA序列的修飾已被建議使用，用于改變它們的穩(wěn)定性或提高它們的 效力。據(jù)推測(cè)，具有雙核苷酸突出的合成的互補(bǔ)的21聚體RNAs (例如，19個(gè)互補(bǔ)核苷酸 +3'非互補(bǔ)的二聚體)可以提供最大水平的抑制。這些方法主要使用兩個(gè)O'脫氧的)胸 苷核苷酸作為雙核苷酸突出部分的序列。這些雙核苷酸突出部分通常寫作dTdT以區(qū)分于 通常位于RNA內(nèi)部的核苷酸。文獻(xiàn)已經(jīng)表明dT突出的使用主要出于降低化學(xué)合成RNAs費(fèi) 用的需要而激發(fā)。據(jù)推測(cè)dTdT突出可能比UU突出更穩(wěn)定，盡管可用的數(shù)據(jù)表明和具有UU 突出的siRNA相比，dTdT突出的穩(wěn)定性只有輕微(< 20% )的提高。WO 99/32619和WO 01/68836表明siRNA中使用的RNA可被化學(xué)或酶法合成。這 些文獻(xiàn)都通過引用整體并入本文。這些文獻(xiàn)中預(yù)期的酶法合成是用細(xì)胞的RNA聚合酶或噬 菌體RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6)，經(jīng)過表達(dá)構(gòu)件體的使用和生產(chǎn)，這為本領(lǐng)域內(nèi)所知。 例如，見于美國專利5，795，715。預(yù)期的構(gòu)件體提供生成RNAs的模板，該RNA含有等同于 部分靶基因的核苷酸序列。這些參考文獻(xiàn)中提供的等同序列的長(zhǎng)度至少25個(gè)堿基，并且長(zhǎng) 度可以達(dá)到400或更多個(gè)堿基。該參考文獻(xiàn)的重要方面是作者預(yù)計(jì)消化較長(zhǎng)的dsRNAs為 21 25聚體長(zhǎng)度，伴隨有能體內(nèi)轉(zhuǎn)化dsRNAs到siRNAs的內(nèi)源性核酸酶復(fù)合體。他們并沒 有報(bào)道或提出有體外合成和使用轉(zhuǎn)錄的21 25聚體dsRNAs的數(shù)據(jù)?；瘜W(xué)或酶法合成的 dsRNAs在RNA干擾使用中預(yù)期的特性沒有區(qū)別。
同樣，WO 00/44914，通過引用并入本文，表明單鏈RNA能用酶法或部分/全部有機(jī) 合成來制備。單鏈RNA具體從DNA模板的PCR產(chǎn)物中用酶法合成，克隆的cDNA模板和RNA 產(chǎn)物具體是cDNA的完全轉(zhuǎn)錄物，其可包含數(shù)百個(gè)核苷酸。WO 01/36646，通過引用并入本 文，對(duì)siRNA合成的方式?jīng)]有做出限制，提出RNA可在體內(nèi)或體外合成，用手工和/或自動(dòng) 的程序。該文獻(xiàn)也提出體外合成可以是化學(xué)的或酶學(xué)的，例如用克隆的RNA聚合酶(例如， T3、T7、SP6)用于內(nèi)源性DNA(或cDNA)模板的轉(zhuǎn)錄，或二者混合物的轉(zhuǎn)錄。同樣，化學(xué)或酶 法合成的siRNA在RNA干擾使用中預(yù)期的特性沒有區(qū)別。美國專利5，795，715報(bào)道了兩個(gè)互補(bǔ)DNA序列鏈在單個(gè)反義混合物中同時(shí)轉(zhuǎn)錄， 其中所述兩個(gè)轉(zhuǎn)錄物立即雜交。使用的模板具體在40和100個(gè)堿基對(duì)之間，并且在每一 端都裝備有啟動(dòng)子序列。所述模板具體附著于固體表面。用RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄后，所產(chǎn)生的 dsRNA片段可用于檢測(cè)和/或分析核酸靶序列。美國專利申請(qǐng)20050203047報(bào)道了通過RNA干擾調(diào)控基因表達(dá)的方法，其把siRNA 或miRNA序列并入到編碼序列的轉(zhuǎn)移RNA (tRNA)。所述包含siRNA或miRNA序列的tRNA可 被并入到核酸表達(dá)構(gòu)件體以使該序列從表達(dá)的tRNA剪接。所述siRNA或miRNA序列可被 放置在和未加工的tRNA轉(zhuǎn)錄物相關(guān)的內(nèi)含子內(nèi)，或被放置在所述tRNA轉(zhuǎn)錄物的任一端。核酸可用本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員所知的任一技術(shù)制備，比如，化學(xué)合成法、酶法生 產(chǎn)或生物生產(chǎn)。合成的核酸(例如，合成的寡核苷酸)的非限制性例子包括體外化學(xué)合 成的核酸，化學(xué)合成使用磷酸三酯、亞磷酸鹽、亞磷酰胺化學(xué)物質(zhì)和固相技術(shù)(比如報(bào)道 于EP 266032，通過引用并入本文)，或通過脫氧核苷H-膦酸酯中間物，報(bào)道于Froehler 等人(1986)和美國專利5，705，629，每個(gè)都通過引用并入本文。寡核苷酸合成的各種機(jī) 制可被使用，這些方法報(bào)道于美國專利4，659，774 ；4，816，571 ；5, 141,813 ；5, 264，566 ； 4，959，463 ；5，428，148 ；5，554，744 ；5，574，146 ；5，602，244，每個(gè)都通過引用并入本文。酶學(xué)制備核酸的非限制性例子包括用酶在諸如PCRtm等(例如參見美國專利 4，683，202和4，682，195，每個(gè)都通過引用并入本文)擴(kuò)增反應(yīng)中制備的核酸，或者報(bào)道于 美國專利5，645，897(每個(gè)都通過引用并入本文)的寡核苷酸的合成。生物制備核酸的非 限制性例子包括在活細(xì)胞中制備(例如，復(fù)制)的重組核酸，比如在細(xì)菌中復(fù)制的重組DNA 載體(例如參見Sambrook et al. 2001，通過引用并入本文)。B.其他治療1.手術(shù)約60%癌癥患者將經(jīng)歷某種類型的手術(shù)，包括預(yù)防、診斷或分期、治療性和姑息性 手術(shù)。治療性手術(shù)是可和其他治療聯(lián)用的癌癥治療，其他治療比如本發(fā)明的治療、化療、放 療、激素治療、基因治療、免疫治療和/或替代療法。治療性手術(shù)包括切除術(shù)，其中全部或部分癌組織被機(jī)械去除、切離和/或破壞。瘤 切除術(shù)涉及至少肉體上去除部分瘤。除了瘤切除術(shù)，手術(shù)治療還包括激光手術(shù)、冷凍手術(shù)、 電手術(shù)、和顯微控制手術(shù)(莫氏手術(shù))。還預(yù)計(jì)本發(fā)明可聯(lián)同表皮癌，初癌或正常組織附帶 物切除使用。先于手術(shù)或者部分或全部癌細(xì)胞、組織、或瘤的部分切除后的瘤內(nèi)注射可在身體 上形成腔洞。治療的實(shí)施可通過灌注，直接注射或這些部位局部施用以額外的抗癌治療。這 些治療可以是重復(fù)的，例如，每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)月。這些治療也可以是劑量變化的。2.化學(xué)治療根據(jù)本發(fā)明可使用很多化學(xué)治療劑。所述術(shù)語“化學(xué)治療”是指治療癌癥藥物的 使用?！盎瘜W(xué)治療劑”用于表示在癌癥治療中施用的化合物或組合物。這些制劑或藥物根據(jù) 它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的活化模式被分類，例如，它們是否和在某一階段影響細(xì)胞周期?；蛘?，制劑 可根據(jù)其能直接交聯(lián)DNA，嵌入到DNA，或通過影響核酸合成引起染色體和有絲分裂畸變來 表征。大部分化學(xué)治療劑分?jǐn)?shù)為下列門類烷化劑、抗代謝藥物、抗瘤抗生素、有絲分裂抑制 劑和亞硝基脲。a.烷化劑烷化劑是直接和基因組DNA相互作用以阻止癌細(xì)胞增生的藥物。這類化學(xué)治療藥 物代表影響細(xì)胞周期所有階段的藥物，就是說，它們不是階段特異性的。烷化劑能被用于 治療慢性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多發(fā)性骨髓瘤，及特別是乳腺癌、肺癌和卵巢 癌。它們包括白消安、苯丁酸氮芥、順鉬、環(huán)磷酰胺(環(huán)磷酰胺)、達(dá)卡巴嗪、異環(huán)磷酰胺、 氮芥(氮芥)和美法侖。曲格列酮可結(jié)合任何一個(gè)或多個(gè)這些烷化劑用于治療癌癥，其中 一些如下文所述。b.抗代謝藥物抗代謝藥物擾亂DNA和RNA的合成。不同于烷化劑，它們特異性影響細(xì)胞周期的 S期。它們已用于治療慢性白血病，還有乳腺癌、卵巢癌和胃腸道癌?？勾x藥物包括5氟 尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C方案)、氟達(dá)拉濱、吉西他濱、和甲氨蝶呤。5氟尿嘧啶(5-FU)的化學(xué)名稱為5_氟_2，4 (1H，3H)-嘧啶二酮。它的作用機(jī)制被 認(rèn)為是通過阻斷脫氧尿苷酸到胸苷酸的甲基化反應(yīng)。因此，5-FU干擾脫氧核糖核酸(DNA) 的合成，并較少程度地抑制核糖核酸(RNA)的形成。由于DNA和RNA為細(xì)胞分裂和增生所 必需，認(rèn)為5-FU的作用能引起胸甘缺陷導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，5-FU的作用被用于迅速分裂 的細(xì)胞，而迅速分裂是轉(zhuǎn)移的癌的特征。c.抗瘤抗生素抗瘤抗生素兼有抗微生物活性和細(xì)胞毒性。這些藥物還通過化學(xué)性抑制酶來干擾 DNA和有絲分裂或改變細(xì)胞膜。這些制劑不是階段特異的，因此它們能在細(xì)胞周期的所有 階段發(fā)揮作用。因此，它們廣泛地用于各種癌癥?？沽隹股氐睦影ú┤R霉素、更生霉 素、柔紅霉素、多柔比星(阿霉素)、和伊達(dá)比星，其中一些更是在下文詳細(xì)討論。臨床上廣 泛使用于瘤治療的這些化合物被用靜脈團(tuán)注法施用，以25 75mg/m2劑量、間隔期21天施 用阿霉素，以35 lOOmg/m2的劑量靜脈注射或口服依托泊苷。d.有絲分裂抑制劑有絲分裂抑制劑植物類堿和其他抑制細(xì)胞分裂或有絲分裂所需的蛋白合成的天 然制劑。它們?cè)诩?xì)胞周期的特定階段起作用。有絲分裂抑制劑包括多西紫杉醇、依托泊苷 (VP16)、紫杉醇、泰索、泰索帝、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春瑞濱。e.亞硝基脲亞硝基脲，類似于烷化劑，抑制DNA修復(fù)蛋白。它們用于治療非霍奇金淋巴瘤、多 發(fā)性骨髓瘤、惡性黑色素瘤，還有腦瘤。例子包括卡莫司汀和洛莫司汀。f.其他制劑
可被使用的其他制劑包括貝伐單抗(商品名阿瓦斯丁 )、吉非替尼(易瑞沙 )、曲妥單抗(赫賽汀 )、西妥昔單抗(愛必妥 ) >panitumumab (Vectibix )、硼替佐米 (Velcade )和格列衛(wèi)。此外，生長(zhǎng)因子抑制劑和小分子激酶抑制劑也有用于本發(fā)明。所 有治療報(bào)道于瘤學(xué)原理與實(shí)踐(7th Ed.，2004)和臨床瘤學(xué)((3rd Ed.，2004)通過引用并 入本文。同樣，下列附加的治療也被包含。通常，免疫治療依靠免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子對(duì)靶位作用并破壞癌細(xì)胞。例如，所述免 疫效應(yīng)物可以是特異于某些瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物的抗體。所述抗體可單獨(dú)作用為治療的效應(yīng) 物或者它可結(jié)合其他細(xì)胞來實(shí)際產(chǎn)生細(xì)胞殺傷?？贵w也可以和藥物或毒物(化療劑、放射 性核素、蓖麻毒素A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)綴合并僅嚴(yán)格作用于為靶向制劑。或者， 效應(yīng)物可以是攜帶直接或間接和靶瘤細(xì)胞相互作用的表面分子的淋巴細(xì)胞。各種效應(yīng)細(xì)胞 包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。因此，免疫治療可被用作聯(lián)合治療的一部分，結(jié)合p53基因治療。聯(lián)合治療的一般 方法如下文所述。通常，瘤細(xì)胞一定有一些可用于靶向(即是，不存在于大部分其他細(xì)胞) 的標(biāo)記物。存在許多瘤標(biāo)記物并且任何這些標(biāo)記物可適用于本發(fā)明情況中的靶向。普遍的 瘤標(biāo)記物包括癌胚抗原、前列腺特異抗原、尿瘤相關(guān)抗原、胎兒抗原、酪氨酸酶(P97)、gp68、 TAG-72、HMFG, Sialyl Lewis 抗原、MucA、MucB, PLAP、雌激素受體、層粘連蛋白受體、erb B 和P155。此外，p53本身可以是免疫治療靶位。參見美國公開2005/0171045，通過引用并 入本文。瘤壞死因子是糖蛋白，能殺死某些種類癌細(xì)胞，激活細(xì)胞因子產(chǎn)生，激活巨噬細(xì)胞 和囊內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)膠原蛋白和膠原酶產(chǎn)生，是炎癥介質(zhì)，也是感染性休克的調(diào)節(jié)劑，并且 促進(jìn)代謝、發(fā)燒和睡眠。一些感染性制劑通過刺激TNF生成而引起瘤退化。當(dāng)單獨(dú)以有效 劑量使用時(shí)，TNF可以是相當(dāng)毒的，因此最優(yōu)的治療方案可能將結(jié)合其他藥物低劑量使用 TNF。它的免疫抑制作用通過Y-干擾素得到加強(qiáng)，因此這一聯(lián)用是潛在危險(xiǎn)的。TNF和干 擾素-α的結(jié)合使用被發(fā)現(xiàn)具有抗癌活性。根據(jù)本文報(bào)道的方法性激素可用于治療癌癥。盡管本文報(bào)道的方法并不限于特定 的癌癥治療，但激素的使用對(duì)乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌(子宮內(nèi)層)有益。這些激素 的例子是雌激素、抗雌激素、孕酮、和雄激素。皮質(zhì)類固醇激素用于某些類型癌癥(淋巴瘤、白血病和多發(fā)性骨髓瘤)的治療。皮 質(zhì)類固醇激素能增加其他化學(xué)治療劑的功效，因此，它們經(jīng)常用于聯(lián)合治療。潑尼松和地塞 米松是皮質(zhì)類固醇激素的例子。3.放射療法放射療法，也稱作放射治療，是用電離輻射治療癌癥和其他疾病。電離輻射積存的 能量傷害或破壞局部被治療的細(xì)胞，通過損壞它們的遺傳物質(zhì)，使這些細(xì)胞不可能繼續(xù)生 長(zhǎng)。盡管輻射傷害癌細(xì)胞和正常細(xì)胞，但后者能適當(dāng)?shù)匦迯?fù)自身和功能。放射療法可用于 治療局部實(shí)體瘤，比如皮膚癌、舌癌、喉癌、腦癌、乳腺癌、或子宮頸癌。它也能用于治療白血 病和淋巴瘤(分別是血液形成細(xì)胞和淋巴系統(tǒng)的癌癥)。根據(jù)本發(fā)明使用的放射治療包括但不限于使用Y -射線、X-射線和/或直接遞送 放射性同位素給瘤細(xì)胞。DNA損傷因素的其他形式預(yù)期有，比如微波和UV-輻射。所有這些 因素最可能對(duì)DNA、DNA前體、DNA的復(fù)制和修復(fù)、染色體的裝配和維持有廣泛地?fù)p傷。X-射線的劑量范圍為延長(zhǎng)的時(shí)間周期(3 4周)內(nèi)每日50 200倫琴，單獨(dú)劑量是2000 6000倫琴。放射性同位素的劑量范圍變化很大，并且取決于同位素的半衰期、輻射釋放的強(qiáng) 度和類型和瘤細(xì)胞的攝入。放射療法包括使用放射性標(biāo)記的抗體遞送放射性劑量直接到癌位點(diǎn)(放射免疫 治療)。抗體是高度特異的蛋白，這些蛋白源于體內(nèi)對(duì)存在抗原(被免疫系統(tǒng)認(rèn)作外物的物 質(zhì))的反應(yīng)。一些瘤細(xì)胞包含引發(fā)特定瘤抗體產(chǎn)生的特定抗原。大批這些抗體能被在實(shí)驗(yàn) 室中制備并且附著放射性物質(zhì)(該過程稱為放射標(biāo)記)。一旦注入到體內(nèi)，所述抗體活化結(jié) 合癌細(xì)胞，該細(xì)胞被輻射的細(xì)胞殺傷(細(xì)胞毒素)作用破壞。該方法可使輻射對(duì)健康細(xì)胞 損傷的危險(xiǎn)最小化。立體順式放射治療使用同一放射治療機(jī)制，直線加速器，作為正常的放射治療但 金屬塊被放在X-射線光束的路徑上來改變它的形狀以和所述癌癥匹配。這確保較高的輻 射劑量被施用給瘤。周圍健康的細(xì)胞和附近的結(jié)構(gòu)接收較低的輻射劑量，因此副作用的可 能性被降低。稱為多葉式準(zhǔn)直儀的設(shè)備被研發(fā)并被用作代替金屬塊。所述多葉式準(zhǔn)直儀含 有許多固定于直線加速器的金屬板。每一層能被調(diào)整以使放射光束能適合于金屬塊不需要 的治療領(lǐng)域。放射治療儀的精確位置對(duì)立體順式放射治療非常重要，并且在每次治療之前， 特定掃描儀被用于檢測(cè)患者內(nèi)臟器官的位置。高分辨率的強(qiáng)度調(diào)節(jié)放射治療也使用多葉式準(zhǔn)直儀。在該治療中，當(dāng)治療被實(shí)施， 多葉式準(zhǔn)直儀圖層被移動(dòng)。該方法有可能達(dá)到更加準(zhǔn)確的治療光束的形狀，并允許放射治 療的劑量在整個(gè)治療中是恒定的。盡管調(diào)查研究已經(jīng)表明立體順式放射治療和強(qiáng)度調(diào)節(jié)放射治療可以降低放射治 療的副作用，有可能如此精確地改變治療區(qū)域可以終止微觀的癌細(xì)胞，僅治療區(qū)域是被破 壞的。這意味著在這些專門的放射治療中，未來癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較高。立體定向放射治療 用于治療腦瘤。該技術(shù)從不同的角度直接施用放射治療以使給瘤的劑量非常高而影響周圍 健康組織的劑量非常低。治療前，用電腦進(jìn)行幾個(gè)掃描分析以確保放射治療是精確靶向的， 并且當(dāng)接受放射治療時(shí)，患者的頭用特制的框保持不動(dòng)。幾個(gè)劑量可被考慮。用于腦部和其他瘤的立體放射-手術(shù)(伽瑪?shù)?不使用刀，而從數(shù)百個(gè)不同角度 使用非常精確靶向的伽瑪放射治療光束。只是一次放射治療需要花費(fèi)約4 5個(gè)小時(shí)。這 個(gè)治療中將有特制的金屬框附著在患者頭上。然后幾個(gè)掃描和χ-射線可被啟動(dòng)找到需要 治療的精確的區(qū)域。在腦瘤的放射治療期間，患者在他們的頭上戴大頭盔。該頭盔上有數(shù) 百個(gè)洞以允許放射治療光束穿過。相關(guān)方法允許用于在身體其他部位瘤的治療?？茖W(xué)家也正在尋找增加放射治療功效的方法。兩種調(diào)查的藥物類型正在被研究它 們對(duì)射線處理的細(xì)胞的影響。放射致敏劑使瘤細(xì)胞更易受到傷害，而輻射防護(hù)藥品保護(hù)正 常的組織免受輻射的影響。過熱，加熱的使用，也正在研究其在對(duì)輻射敏感的組織中的功 效。V.實(shí)施例 下述實(shí)施例包括進(jìn)一步列舉本發(fā)明的各個(gè)方面。本領(lǐng)域內(nèi)那些技術(shù)人員應(yīng)明晰所 述實(shí)施例中公開的遵從代表技術(shù)的技術(shù)和/或本發(fā)明人公開的組合物，在本發(fā)明的實(shí)踐中 運(yùn)行良好，因此能被考慮組成為其實(shí)踐的優(yōu)選模式。然而，根據(jù)本公開，本領(lǐng)域內(nèi)那些技術(shù) 人員應(yīng)知道，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可在公開的具體的實(shí)施方式中做出許多改變，仍取得相同或類似的結(jié)果。^MM 1. Advexin 治療有優(yōu)干標(biāo)準(zhǔn)治療獲得的總彳本存活其月有局部區(qū)域復(fù)發(fā)的SCCHN患者常常經(jīng)歷大量瘤相關(guān)的病癥。在該患者類群中，控 制局部進(jìn)程和保護(hù)功能的改善治療的需要不可被過度強(qiáng)調(diào)。在先前放射治療已失效并認(rèn)為 不能手術(shù)切除的患者中，化療被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)的治療方法。復(fù)發(fā)瘤治療的主要目標(biāo)是緩解癥 狀。幾個(gè)化學(xué)治療和靶向分子的單一治療方案已被用于復(fù)發(fā)的SCCHN的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理中， 和Advexin 相比的結(jié)果總結(jié)于下表。Advexin 和標(biāo)準(zhǔn)治療的總中位值存活期相似 (約5 6個(gè)月)，超過歷史上沒有治療的中位值存活期(約3 4個(gè)月)(Tarceva 美 國 Product Label，ErbitUX 美國 Product Label，2007)。表1 :SCCHN中(ITT群)單一治療研究的中位值存活期
權(quán)利要求
1.預(yù)測(cè)患瘤的人受試者對(duì)P53基因治療的有利反應(yīng)的方法(a)測(cè)定所述瘤的瘤細(xì)胞是否含至少一個(gè)野生型P53等位基因；和/或(b)測(cè)定所述瘤的瘤細(xì)胞是否以高于表達(dá)正常p53的非瘤細(xì)胞中表達(dá)的水平表達(dá)p53 蛋白；其中如果所述細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)(i)含至少一個(gè)野生型p53等位基因，和/或( )表達(dá)不高于表達(dá)正常P53的非瘤細(xì)胞中表達(dá)的水平的p53蛋白，和/或 (iii)表達(dá)升高水平的P53蛋白，定義為高于表達(dá)正常p53的非瘤細(xì)胞中表達(dá)的水平， 其中所述P53蛋白不抑制所述野生型p53的功能，則(i) (iii)中的任一項(xiàng)會(huì)預(yù)測(cè)所述受試者會(huì)具有對(duì)所述治療的有利反應(yīng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中， 如果所述瘤細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)(A)不含至少一個(gè)野生型p53等位基因，和/或(B)含2個(gè)突變的p53等位基因，和/或(C)以高于由表達(dá)正常p53的正常細(xì)胞表達(dá)的水平表達(dá)突變的p53蛋白，且所述突變的 P53抑制所述野生型p53的功能，則其指示對(duì)所述治療的不良反應(yīng)。
3.權(quán)利要求46 48的方法，其中所述其他治療是甲氨蝶呤。
4.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)包括p53的抗體檢測(cè)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)包括免疫組織化學(xué)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)包括ELISA、免疫測(cè)定、放射免疫測(cè)定(RIA)、免疫 放射定量測(cè)定、熒光免疫測(cè)定、化學(xué)發(fā)光測(cè)定、生物發(fā)光測(cè)定、凝膠電泳、蛋白印跡分析或原 位雜交測(cè)定。
7.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)包括擴(kuò)增p53轉(zhuǎn)錄物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述擴(kuò)增包括PCR或RT-PCR。
9.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)包括原位雜交、RNA印跡或核酸酶保護(hù)。
10.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)包括測(cè)序、基因陣列或基因芯片。
11.權(quán)利要求10的方法，其中在所述瘤的瘤細(xì)胞中擴(kuò)增基因組序列。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述瘤細(xì)胞經(jīng)石蠟包埋。
13.權(quán)利要求2的方法，其中所述突變的p53包括DNA結(jié)合突變。
14.權(quán)利要求1和41 45的方法，其中所述p53基因治療是Advexin 。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述瘤是良性瘤生長(zhǎng)。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述良性瘤生長(zhǎng)是良性前列腺增生、口腔白斑、結(jié)腸息 肉、食管癌前生長(zhǎng)或良性病變。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述瘤是癌。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述癌是口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸道癌、泌尿生殖 器癌、胃腸道癌、中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)組織癌、內(nèi)分泌或神經(jīng)內(nèi)分泌癌或造血細(xì)胞癌、神經(jīng) 膠質(zhì)瘤、肉瘤、癌、淋巴瘤、黑色素瘤、纖維瘤、腦膜瘤、腦癌、口咽癌、鼻咽癌、腎癌、膽囊癌、 嗜鉻細(xì)胞瘤、胰島細(xì)胞癌、李弗勞明瘤、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、垂體瘤、腎上腺瘤、成骨性肉瘤、I型和II型多發(fā)性神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、乳腺癌、肺癌、頭頸癌、前列腺癌、食管癌、氣管癌、肝 癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、睪丸癌、結(jié)腸癌、直腸癌或皮膚癌。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述癌是鱗狀細(xì)胞癌(SCCHN)。
20.權(quán)利要求1的方法，還包括第二抗瘤治療。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述第二抗瘤治療是基因治療。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述第二抗瘤治療是化學(xué)治療。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述第二抗瘤治療是放射治療。
24.權(quán)利要求20的方法，其中所述第二抗瘤治療是細(xì)胞因子治療。
25.權(quán)利要求20的方法，其中所述第二抗瘤治療是抗血管形成治療。
26.權(quán)利要求1的方法，其中所述p53基因治療通過非病毒載體遞送。
27.權(quán)利要求沈的方法，其中所述非病毒載體被包封在脂質(zhì)媒質(zhì)中。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述脂質(zhì)媒質(zhì)是脂質(zhì)體。
29.權(quán)利要求觀的方法，其中所述媒質(zhì)是納米顆粒。
30.權(quán)利要求1的方法，其中所述p53基因治療通過病毒載體遞送。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述病毒載體是反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病 毒載體、痘病毒載體、多瘤病毒載體、慢病毒載體、或皰疹病毒載體。
32.權(quán)利要求1的方法，其中所述p53基因治療是局部區(qū)域基因治療。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述局部區(qū)域基因治療包括局部基因治療。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述局部基因治療包括所述瘤的直接注射。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述局部基因治療包括瘤血管的注射。
36.權(quán)利要求32的方法，其中所述局部區(qū)域基因治療包括區(qū)域性基因治療。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述區(qū)域性基因治療包括施用到瘤相關(guān)淋巴管或?qū)Ч軆?nèi)。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述施用包括腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、囊內(nèi)、或鞘內(nèi)施用。
39.權(quán)利要求36的方法，其中所述區(qū)域性基因治療包括施用到與所述瘤相關(guān)的肢的血 管系統(tǒng)中。
40.權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)所述治療的有利反應(yīng)包括瘤尺寸或負(fù)荷減小、瘤生長(zhǎng) 的阻斷、瘤相關(guān)疼痛減少、瘤相關(guān)病理的減少、瘤相關(guān)癥狀的減少、瘤非進(jìn)行、增加的無病間 期、增加的至進(jìn)行時(shí)間、緩解的誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)移的減少、或增長(zhǎng)的患者存活期。
41.權(quán)利要求1的方法，還被定義為包括下列步驟(a)測(cè)定所述瘤細(xì)胞是否含2個(gè)野生型p53等位基因；且如果是，則(b)給所述受試者施用p53基因治療。
42.權(quán)利要求1的方法，還被定義為包括下列步驟(a)測(cè)定所述瘤細(xì)胞是否含至少一個(gè)野生型p53等位基因，及所述瘤細(xì)胞是否不過表 達(dá)P53蛋白；且如果是，則(b)給所述受試者施用p53基因治療。
43.權(quán)利要求1的方法，還被定義為包括下列步驟(a)測(cè)定所述瘤細(xì)胞是否不含p53突變等位基因；且如果是，則(b)給所述受試者施用p53基因治療。
44.權(quán)利要求1的方法，還被定義為包括下列步驟(a)測(cè)定所述瘤細(xì)胞是否不過表達(dá)p53突變蛋白，所述p53突變蛋白抑制野生型p53的 功能；且如果是，則(b)給所述受試者施用p53基因治療。
45.權(quán)利要求1的方法，還被定義為包括下列步驟(a)測(cè)定所述瘤細(xì)胞是否過表達(dá)p53蛋白，所述p53蛋白不抑制野生型p53的功能；且 如果是，則(b)給所述受試者施用p53基因治療。
46.權(quán)利要求1的方法，還被定義為包括下列步驟(a)測(cè)定所述瘤細(xì)胞是否過表達(dá)突變的p53蛋白，且所述突變的p53抑制野生型p53的 功能；且如果是，則(b)給所述受試者施用p53基因治療之外的治療。
47.權(quán)利要求1的方法，還被定義為包括下列步驟(a)測(cè)定所述瘤細(xì)胞是否不含至少一個(gè)野生型p53等位基因；且如果是，則(b)給所述受試者施用p53基因治療之外的治療。
48.權(quán)利要求1的方法，還被定義為包括下列步驟(a)測(cè)定所述瘤細(xì)胞是否含2個(gè)突變的p53等位基因；且如果是，則(b)給所述受試者施用p53基因治療之外的治療。
49.權(quán)利要求1的方法，還包括從所述患者獲得含瘤細(xì)胞的生物樣品。
50.試劑盒，其含(a)檢測(cè)瘤樣品中p53蛋白的量的p53抗體或探針；(b)測(cè)定p53基因或轉(zhuǎn)錄物結(jié)構(gòu)的多種探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及p53生物標(biāo)記物表達(dá)譜的鑒定，其中p53生物標(biāo)記物表達(dá)譜能預(yù)測(cè)患有過度增生疾病(比如癌癥)的患者對(duì)治療的反應(yīng)，還涉及它們?cè)谟每惯^度增生疾病的基因治療來治療所述患者的方法中的用途。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102066937SQ200980108333
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2009年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日
發(fā)明者K·梅南德, R·E·索博爾 申請(qǐng)人:P53股份有限公司