專利名稱：生物標(biāo)記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及饑餓素信號肽(GRN-SP)以及其在預(yù)后、診斷和監(jiān)測生物事件或障礙 或狀態(tài)方面的應(yīng)用，其中上述生物事件或疾病或狀態(tài)導(dǎo)致標(biāo)記物釋放到循環(huán)(血循環(huán)， circulation)中。上述狀態(tài)包括肥胖癥以及相關(guān)病癥如葡萄糖代謝障礙、糖尿病以及心血 管疾病，尤其是急性心臟疾病。
背景技術(shù)：
肥胖癥在人群已占到流行比例。肥胖癥是西方世界可預(yù)防性死亡的主要原因之 一。世界健康組織(WHO)將肥胖癥列為十大全球健康問題之一。各種遺傳因素和社會因素可能是引起人們肥胖的原因。當(dāng)能量吸收超多能量消耗 時(shí)，將產(chǎn)生肥胖癥，但為基礎(chǔ)水平。肥胖個體處于發(fā)生相關(guān)病癥如糖尿病和心血管疾病，特 別是急性心臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)之中。糖尿病是一種代謝病，其特征在于胰島素分泌、胰島素作用其中之一缺乏或全部 缺乏。這些缺乏導(dǎo)致慢性高血糖癥。糖尿病在全世界影響1.7億以上的人，并且預(yù)計(jì)在未 來20年會加倍。糖尿病分為兩種類型，稱作I型糖尿病和II型糖尿病。I型糖尿病是一種自身免 疫相關(guān)疾病，其中個體的免疫系統(tǒng)會破壞胰腺的β細(xì)胞?；加蠭型糖尿病的個體通常是饑 餓素依賴的。他們呈現(xiàn)有限的饑餓素分泌(若有的話)。II型糖尿病是最常見形式，占90至95%的病例。大多數(shù)II型糖尿病對象并不是 饑餓素依賴的，但呈現(xiàn)饑餓素分泌和饑餓素作用缺乏，從而導(dǎo)致高血糖癥。高血糖癥常常是 溫和的并具有難以識別的癥狀。因此，許多II型糖尿病對象許多年間都未被確診。在任何 特定時(shí)間，據(jù)估計(jì)，10至15%的群體可能具有發(fā)展成II型糖尿病的危險(xiǎn)，但未被確診。糖尿病最常見是基于用來評估葡萄糖代謝(葡萄糖處理，glucose handling)的 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)來診斷。在隔夜空腹以后給予個體葡萄糖飲料以測試個體對葡萄糖的 耐受性。該測試進(jìn)行數(shù)小時(shí)以測量反應(yīng)。不幸的是，葡萄糖耐量試驗(yàn)和空腹饑餓素水平測 試缺乏敏感性，并且存在假陽性，其限制了它們作為糖尿病的預(yù)后指標(biāo)的有用性。肥胖癥也是心血管疾病的重要的危險(xiǎn)因子，會使心臟事件的風(fēng)險(xiǎn)增加兩至三倍。 盡管認(rèn)識到需要診斷和預(yù)后工具來評估個體發(fā)展糖尿病、前體葡萄糖代謝障礙、以及相關(guān) 病癥如心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，但并沒有簡單而準(zhǔn)確的測試。糖尿病和前體葡萄糖代謝障礙、或任何其它形式的血糖代謝障礙或胰島素血異常 的早期診斷和正在進(jìn)行的評估是重要的，不僅用于處理糖尿病，而且用于處理相關(guān)病癥，如 心血管疾病。除為與血糖代謝障礙或胰島素血異常有關(guān)的病癥、疾病提供早期檢測方法以 外，例如，本發(fā)明在心血管領(lǐng)域還具有更廣泛的應(yīng)用。包括急性冠狀動脈綜合征(ACS)的急性心臟疾病涉及各種不同的心肌缺血事件 從不穩(wěn)定型心絞痛到急性心肌梗死(AMI)。AMI表現(xiàn)為這些事件中最嚴(yán)重的事件，因而需 要快速和準(zhǔn)確的診斷。呈現(xiàn)兩種或更多種所描述特點(diǎn)(缺血性胸部不適的病史、系列心電圖(ECG)跡線的進(jìn)化改變以及血漿心臟生物標(biāo)記物的起落)的對象被明確確定為正經(jīng)歷 AMI26。然而，相當(dāng)一部分呈現(xiàn)疑似AMI的對象(40% -50% )并不具有ECG的系列變化、或 典型的癥狀，因此更關(guān)注循環(huán)生物標(biāo)記物濃度，以獲得準(zhǔn)確的診斷26’27。心肌梗死的準(zhǔn)確的早期診斷便于立刻采用再灌注治療，包括有效的經(jīng)皮或溶栓血 管再生成以及附屬的抗凝血和抗血小板治療。隨著每小時(shí)的診斷和處理延遲，上述治療在 減小死亡率和發(fā)病率方面的有效性逐步降低2_4。鑒于在這種臨床情況中需要加速決策，所 以需要鑒定循環(huán)生物標(biāo)記物，以提供急性心臟疾病(尤其是，例如AMI)的早期和具體診斷。目前的臨床指南確實(shí)強(qiáng)調(diào)在鑒定心肌梗死和急性冠狀動脈綜合征中生物標(biāo)記物 測量的重要性26。許多生物標(biāo)記物已被提出用于此目的，包括肌酸激酶-MB (CK-MB)、肌鈣蛋 白T (TnT)、肌鈣蛋白I (TnI)、BNP、N-BNP (還稱作NP-BNP)、BNP信號肽(BNP-SP)以及肌紅 蛋白，但對它們的使用存在限制。至血漿心臟生物標(biāo)記物的可檢測或異常升高的時(shí)間可以 是6小時(shí)(肌紅蛋白，CK-MB)至12小時(shí)(TnT、TnI、BNP、N-BNP)，其中最高水平直到損傷發(fā) 作以后的24-48小時(shí)才發(fā)生，這對精確的診斷和治療強(qiáng)加了延遲窗口 H。此外，肌紅蛋白和 CK-MB均是非特異性的并且可以分泌自心外來源，尤其是在外傷或手術(shù)期間i。因而，已知標(biāo)記物的長期診斷/預(yù)測能力缺乏特異性標(biāo)記物的伴隨能力，其中特 異性標(biāo)記物在臨床表現(xiàn)的最初幾小時(shí)內(nèi)提供急性心臟疾病如急性心肌損傷的早期具體診 斷。因此仍然需要早期標(biāo)記物。本發(fā)明的另一個目的是提供急性心臟疾病的早期標(biāo)記物，和/或至少向公眾提供 有用的選擇。

發(fā)明內(nèi)容
人饑餓素信號肽(GRN-SP)是切割自饑餓素(前饑餓素原)(1-117) SEQ ID NO=I 的23個氨基酸肽。人前饑餓素原的處理示于圖5中。GRN-SP(l-23)被分開顯示在SEQ ID NO 15 中。本發(fā)明的申請人已首次發(fā)現(xiàn)，饑餓素信號肽GRN-SP以及其片段被釋放到循環(huán)中。 確定和提供了有用的循環(huán)生物標(biāo)記物。先前認(rèn)為，GRN-SP僅在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生25。基于此發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的申請人在本發(fā)明的一個方面提供了用于在對象中預(yù)測、診 斷、評估或監(jiān)測生物事件或障礙的方法，其中上述事件與一種或多種GRN-SP生物標(biāo)記物釋 放到循環(huán)中有關(guān)，該方法包括測量在獲自或源自對象的樣品中一種或多種GRN-SP生物標(biāo) 記物的水平，然后連同所述一種或多種生物標(biāo)記物的參考值或范圍對上述水平進(jìn)行分析。在一種實(shí)施方式中，GRN-SP生物標(biāo)記物是GRN-SP。在另一種實(shí)施方式中，GRN-SP 生物標(biāo)記物是GRN-SP片段。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，GRN-SP片段是人GRN-SP (1_9) (SEQ ID NO 17)。在另一種實(shí)施方式中，該方法包括比較在獲自或源自對象的一個或多個樣品中 GRN-SP生物標(biāo)記物、優(yōu)選GRN-SP片段的水平與來自對照的GRN-SP生物標(biāo)記物水平，其中測 量水平與對照水平的偏差指示生物事件或障礙。在糖尿病對象如I型糖尿病對象中，或在患有另一種血糖代謝障礙(由降低的胰 島素分泌水平造成)的對象中，饑餓素(胃促生長素，ghrelin)水平將不同于正常水平，如 GRN-SP和/或GRN-SP片段水平。此發(fā)現(xiàn)表明，GRN-SP可用作上述病癥的標(biāo)記物。取決于對象的胰島素狀態(tài)，在對象中的GRN-SP生物標(biāo)記物水平將比正常水平更高或更低。在糖尿病對象，如II型糖尿病對象中，或在患有另一種胰島素血異常 (dysinsulinemia)的對象中，饑餓素水平將高于正常水平，如GRN-SP和/或GRN-SP片段 水平。此發(fā)現(xiàn)表明，GRN-SP和/或GRN-SP片段也可用作上述病癥以及其它高胰島素血狀 態(tài)(hyperinsulinemic states)如代謝綜合征的標(biāo)記物。取決于對象的胰島素狀態(tài)，在對 象中的GRN-SP生物標(biāo)記物水平將比正常水平更高或更低。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)測、診斷、評估或監(jiān)測糖尿病或糖尿病 可能性(潛在糖尿病，diabetes potential)、以及特點(diǎn)在于血糖代謝障礙和/或胰島素血 異常的其它病癥的方法，該方法包括測量在獲自或源自對象的樣品中GRN-SP生物標(biāo)記物 的水平，然后連同所述一種或多種生物標(biāo)記物的各自的參考值對上述水平進(jìn)行分析。在另一種實(shí)施方式中，該方法包括比較在獲自或源自對象的一個或多個樣品中 GRN-SP生物標(biāo)記物、優(yōu)選GRN-SP片段的水平與來自對照的GRN-SP生物標(biāo)記物的水平，其中 偏離對照水平的GRN-SP的測量水平指示糖尿病或易患糖尿病的體質(zhì)、或與血糖代謝障礙 和/或胰島素血異常有關(guān)的另一種病癥。在一種實(shí)施方式中，GRN-SP生物標(biāo)記物水平可以 低于對照水平。本發(fā)明還提供了評估對象中的葡萄糖代謝的方法，該方法包括(a)在給予葡萄糖以后，測量對象中GRN-SP生物標(biāo)記物、優(yōu)選GRN-SP片段的水平； 以及(b)比較所述GRN-SP與來自對照GRN-SP的水平，其中GRN-SP的測量水平與對照水平的偏差指示葡萄糖代謝障礙。本發(fā)明的申請人還令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在疑似急性冠狀動脈綜合征(ACS)的發(fā)作或 臨床表現(xiàn)以后的最初幾小時(shí)內(nèi)GRN-SP生物標(biāo)記物的循環(huán)濃度是最高的。在上述最初的幾 小時(shí)內(nèi)，峰值是正常對照群體的例如1. 5至5倍。因此，在另外的方面，本發(fā)明提供了用于在對象中預(yù)測、診斷或監(jiān)測急性心臟疾病 (ACD)的方法，該方法包括測量在來自對象的生物樣品中GRN-SP生物標(biāo)記物、優(yōu)選GRN-SP 片段的水平，然后比較所述GRN-SP生物標(biāo)記物的水平與來自對照或參考值或數(shù)值范圍的 GRN-SP和/或GRN-SP片段的水平，其中高于對照水平、或預(yù)先確定的參考值或數(shù)值范圍的 GRN-SP生物標(biāo)記物的測量水平指示A⑶。本發(fā)明還提供了用于在對象中監(jiān)測對生物事件或障礙，尤其是急性心臟疾病 (ACD)的治療的響應(yīng)的方法，該方法包括測量在獲自或源自對象的生物樣品中GRN-SP生物 標(biāo)記物、優(yōu)選GRN-SP片段的水平，然后比較所述GRN-SP生物標(biāo)記物的水平與來自對照或參 考值或數(shù)值范圍的GRN-SP生物標(biāo)記物水平，其中GRN-SP生物標(biāo)記物的測量水平相比對照 水平、或預(yù)先確定的參考值或數(shù)值范圍的變化指示響應(yīng)治療。在另一個方面，本發(fā)明還提供了用于在對象中預(yù)測、診斷或監(jiān)測心臟移植排斥反 應(yīng)的方法，該方法包括在心臟移植以后測量在獲自或源自對象的生物樣品中GRN-SP生物 標(biāo)記物、優(yōu)選GRN-SP片段的水平，然后比較所述GRN-SP生物標(biāo)記物的水平與來自對照或參 考值或數(shù)值范圍的GRN-SP生物標(biāo)記物水平，其中高于對照水平、或預(yù)先確定的參考值或數(shù) 值范圍的GRN-SP生物標(biāo)記物的測量水平指示移植排斥或移植排斥反應(yīng)。本發(fā)明還提供了用于在對象中區(qū)別肺疾病和急性心臟疾病(ACD)的方法，該方法包括測量在獲自或源自對象的樣品中GRN-SP生物標(biāo)記物、優(yōu)選GRN-SP片段的水平，然后比 較所述GRN-SP生物標(biāo)記物的水平與來自對照、或預(yù)先確定的參考值或數(shù)值范圍的GRN-SP 生物標(biāo)記物水平，其中高于對照水平、或預(yù)先確定的參考值或數(shù)值范圍的GRN-SP生物標(biāo)記 物的測量水平指示ACD。本發(fā)明還提供了用于在對象中預(yù)測、診斷或監(jiān)測急性心臟疾病(ACD)、心臟移植 排斥、或ACD/肺疾病的方法，該方法包括在ACD、心臟移植排斥或ACD/肺疾病的發(fā)作或臨 床表現(xiàn)的約最初6或4小時(shí)內(nèi)，測量在獲自或源自對象的樣品中GRN-SP生物標(biāo)記物、優(yōu)選 GRN-SP片段的水平，比較GRN-SP生物標(biāo)記物的測量水平與來自對照、或參考值或數(shù)值范圍 的GRN-SP生物標(biāo)記物水平，其中高于對照水平、或預(yù)先確定的參考值或數(shù)值范圍的GRN-SP 生物標(biāo)記物的測量水平指示ACD或心臟移植排斥、或心臟移植排斥。在一種更廣泛的實(shí)施方式中，本發(fā)明的申請人的發(fā)現(xiàn)可以用來預(yù)測、診斷、評估或 監(jiān)測任何事件，其中GRN-SP、或GRN-SP片段被釋放到循環(huán)中。在本發(fā)明的心臟方法的一種實(shí)施方式中，在疾病表現(xiàn)或其發(fā)生的約6小時(shí)、或約4 小時(shí)、或約2小時(shí)、或約1小時(shí)、約30分鐘內(nèi)，或約15分鐘內(nèi)，測量獲自對象的樣品(樣品 衍生物)的GRN-SP生物標(biāo)記物水平一次或多次。本發(fā)明包括在6小時(shí)、4小時(shí)、2小時(shí)、1小 時(shí)、半小時(shí)、以及四分之一小時(shí)內(nèi)的單次或多次GRN-SP生物標(biāo)記物測量。還包括在6小時(shí) 以后，對隨后獲自或源自對象的樣品，測量GRN-SP生物標(biāo)記物或另外測量GRN-SP生物標(biāo)記 物。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法是體外方法。在一種實(shí)施方式中，樣品是血液、唾液、間質(zhì)液、血漿、尿液、血清或心臟組織。在一 種優(yōu)選實(shí)施方式中，樣品是血液或血漿。在一種實(shí)施方式中，測量步驟包括檢測GRN-SP生物標(biāo)記物和結(jié)合劑之間的結(jié)合， 其中結(jié)合劑選擇性地結(jié)合GRN-SP生物標(biāo)記物。在一種實(shí)施方式中，測量步驟包括(a)使GRN-SP生物標(biāo)記物結(jié)合于結(jié)合劑；以及(b)測量結(jié)合GRN-SP生物標(biāo)記物的水平。在一種實(shí)施方式中，結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段。最常見地，抗體是單克隆、 多克隆、雙特異性、嵌合或人源化抗體。在一種實(shí)施方式中，抗體是單克隆抗體。在另一種實(shí)施方式中，利用質(zhì)譜法來測量GRN-SP生物標(biāo)記物的水平。由抗體結(jié)合或檢測的GRN-SP生物標(biāo)記物是全長人GRN-SP分子(SEQ ID NO 15) 或其抗原變體或片段。在一種實(shí)施方式中，片段的長度為至少4個連續(xù)氨基酸。在另一種 實(shí)施方式中，結(jié)合或檢測的片段是人GRN-SP (1-9) SEQ ID NO :17?？贵w可以結(jié)合GRN-SP或 GRN-SP片段的N端或C端。結(jié)合劑選擇性地結(jié)合的特異性抗原肽包括人GRN-SP (1-9) (SEQ ID NO 17或它們 的抗原結(jié)合片段或變體。在一種實(shí)施方式中，利用固定在固相上的抗體或抗體片段來測量GRN-SP生物標(biāo) 記物的結(jié)合。通常可以借助于一種測定來測量GRN-SP生物標(biāo)記物的水平，其中上述測定選自 RIA、ELISA、熒光免疫測定法、免疫熒光測定試驗(yàn)、質(zhì)譜法以及免疫放射測定試驗(yàn)。因此，本發(fā)明還提供了用于在來自對象的生物樣品中對GRN-SP生物標(biāo)記物的測定，該測定包括利用任何已知方法來檢測和測量在樣品或樣品衍生物中的GRN-SP生物標(biāo) 記物的水平。本發(fā)明還提供了對GRN-SP生物標(biāo)記物的測定，包括(a)結(jié)合來自樣品的一種或多種GRN-SP生物標(biāo)記物；以及(b)測量結(jié)合的GRN-SP生物標(biāo)記物的水平。 可以利用本發(fā)明的GRN-SP生物標(biāo)記物-結(jié)合劑來結(jié)合GRN-SP生物標(biāo)記物。本發(fā)明還提供了 GRN-SP生物標(biāo)記物測定，用于預(yù)測、診斷、評估或監(jiān)測對象中的 生物事件或障礙。在一種實(shí)施方式中，該測定是體外測定。本發(fā)明的血糖代謝障礙相關(guān)方法可以進(jìn)一步包括測量例如糖尿病的一種或多種 非GRN-SP/GRN-SP片段標(biāo)記物的水平，并比較所述水平與來自對照的標(biāo)記物水平，其中 測量水平與非GRN-SP標(biāo)記物的對照水平的偏差、連同偏離或低于GRN-SP的對照水平的 GRN-SP的測量水平一起，可以預(yù)測或診斷例如糖尿病，或可以用來監(jiān)測例如糖尿病。用于糖尿病的非GRN-SP/GRN-SP片段標(biāo)記物可以包括葡萄糖、胰島素、乳酸酯以 及甘油三酯或脂肪酸水平。其它標(biāo)記物包括HbAlC和果糖胺。本發(fā)明的心臟相關(guān)方法可以進(jìn)一步包括測量所述A⑶、或心臟移植排斥、或AOT/ 肺疾病的一種或多種非GRN-SP或非GRN-SP片段標(biāo)記物的水平，并比較上述水平與來自對 照或參考值或數(shù)值范圍的標(biāo)記物水平，其中測量水平與非GRN-SP標(biāo)記物的對照或參考水 平的偏差、連同高于對照或參考GRN-SP生物標(biāo)記物水平的GRN-SP生物標(biāo)記物的測量水平 一起，可以預(yù)測或診斷ACD，或可以用來評估或監(jiān)測所述ACD (包括心臟移植排斥)或ACD/ 肺疾病。用于急性冠狀動脈綜合征情況下的標(biāo)記物包括肌鈣蛋白、肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白 I、肌酸激酶 MB、肌紅蛋白、BNP、NT-BNP, BNP-SP, BNP-SP 片段、ANP、ANP-SP, ANP-SP 片段、 LDH,天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、心臟特異性脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)、缺血修飾白蛋白、內(nèi)皮素、腎 上腺髓質(zhì)素以及血管緊張素II。在另一個方面，本發(fā)明還提供了 GRN-SP生物標(biāo)記物結(jié)合劑。在一種實(shí)施方式中， 本發(fā)明的GRN-SP生物標(biāo)記物結(jié)合劑結(jié)合或檢測(a) GRN-SP (1-23) SEQ ID NO: 15;(b) GRN-SP (1-9) SEQ ID NO: 17;(c)由選自SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 18的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；或(d) (a)至(c)的任何一種的變體或片段。結(jié)合劑可用于預(yù)測、診斷、評估或監(jiān)測生物事件或障礙，其與GRN-SP或GRN-SP片 段釋放到循環(huán)中有關(guān)。上述事件或障礙包括對象的糖尿病、葡萄糖代謝障礙、以及急性心臟 疾病(ACD)。在一種實(shí)施方式中，結(jié)合劑是抗GRN-SP抗體或抗GRN-SP片段抗體或任何一種的 抗原結(jié)合片段。本發(fā)明還提供了抗GRN-SP生物標(biāo)記物抗體或其抗原結(jié)合片段，其結(jié)合(a) GRN-SP 1-23 (SEQ ID NO: 15)；(b) GRN-SP 1-9 (SEQ ID NO: 17)；
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(c)由選自SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 18的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；或(d) (a)至(c)的任何一種的變體或片段?？贵w可以是單克隆、多克隆、雙特異性、嵌合、或人源化抗體，或任何一種的結(jié)合片 段或構(gòu)建體(construct)。本發(fā)明還涉及GRN-SP生物標(biāo)記物結(jié)合劑在制備(manufacture) GRN-SP生物標(biāo)記 物測定以評估對象中的生物事件或障礙中的應(yīng)用，或涉及GRN-SP生物標(biāo)記物結(jié)合劑在制 造一種工具中的應(yīng)用，該工具用于預(yù)后、診斷、評估或監(jiān)測對象中的生物事件或障礙。在一 種實(shí)施方式中，事件或障礙與GRN-SP和/或GRN-SP片段釋放到循環(huán)中有關(guān)，包括來自葡萄 糖代謝障礙、糖尿病、或急性心臟疾病(ACD)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段在制造用于評估生物事件或障礙的 預(yù)后、診斷、評估或監(jiān)測工具中的應(yīng)用，其中上述生物事件或障礙與GRN-SP和/或GRN-SP 片段釋放到循環(huán)中有關(guān)并且包括對象中的葡萄糖代謝障礙、糖尿病、急性心臟疾病(ACD)、 心臟移植排斥或AOT/肺疾病。在一種實(shí)施方式中，對預(yù)后、診斷或監(jiān)測工具進(jìn)行校準(zhǔn)以測量約0. 1至約 500pmol/L、或約1至約300pmol/L、約10至約250或約20至約150pmol/L范圍內(nèi)的GRN-SP 水平。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于在對象中預(yù)測、診斷或監(jiān)測生物事件的試劑盒， 該試劑盒包括本發(fā)明的GRN-SP生物標(biāo)記物結(jié)合劑。在一種實(shí)施方式中，對試劑盒進(jìn)行校準(zhǔn)以測量約0. 1至約500pmol/L、約1至約 300pmol/L、約10至約250pmol/L或約20至約150pmol/L范圍內(nèi)的GRN-SP生物標(biāo)記物水平。在一種實(shí)施方式中，試劑盒還包括用法說明書，用于根據(jù)在樣品或樣品衍生物中 測得的GRN-SP生物標(biāo)記物水平并通過比較測量水平與對照或參考水平，來預(yù)測、診斷、評 估或監(jiān)測對象中的生物事件或障礙，包括葡萄糖代謝障礙例如糖尿病或ACD。偏離對照或參 考水平的GRN-SP生物標(biāo)記物的測量水平指示生物事件或障礙，如，例如，ACD (包括移植排 斥)、葡萄糖代謝障礙或糖尿病。在一種實(shí)施方式中，樣品在發(fā)作或臨床表現(xiàn)的4小時(shí)內(nèi)獲 得。在另一個方面，本發(fā)明涉及編碼GRN-SP片段的核酸分子，其中所述核酸選自(a) SEQ ID NO 18或其變體或片段；(b)相對于 SEQ ID NO :18 具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、或 99%序 列同一性的序列；(c)能夠在嚴(yán)格條件下雜交于SEQ ID NO 18或其變體或片段的長度為至少10個 核苷酸的序列；以及(d) (a)至(C)的任何一種的補(bǔ)體條件是該序列不是SEQ ID NO :16。在一種實(shí)施方式中，由核酸分子編碼的GRN-SP片段是GRN-SP (1_9) (SEQ ID NO 17)。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的核酸分子的基因構(gòu)建體。在一種實(shí)施方式中，基因 構(gòu)建體是表達(dá)構(gòu)建體。本發(fā)明還提供了包含基因構(gòu)建體的載體，包含基因構(gòu)建體或載體的宿主細(xì)胞，由本發(fā)明的核酸分子編碼的多肽，選擇性地結(jié)合本發(fā)明的多肽的抗體，以及用于 重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了分離的GRN-SP生物標(biāo)記物或其變體或片段， 它們選自(a) GRN-SP (1-9) SEQ ID NO 17 或其變體或片段；(b)相對于 SEQ ID NO :17 的多肽具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、或
99%氨基酸同一性的氨基酸序列；以及(c)由本發(fā)明的核酸分子編碼的GRN-SP多肽。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多肽在制備抗GRN-SP生物標(biāo)記物抗體中的應(yīng)用。用于重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)包含本發(fā)明的基因構(gòu)建體并且能夠表達(dá)本發(fā)明的多肽的宿主細(xì)胞；(b)選擇表達(dá)本發(fā)明的多肽的細(xì)胞；(c)從細(xì)胞中分離表達(dá)的多肽；以及可選地(d)純化表達(dá)的多肽。在一種實(shí)施方式中，該方法包括用構(gòu)建體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的預(yù)先步驟。


現(xiàn)將參照附圖來描述本發(fā)明，其中圖IA是柱形圖，示出患者中的循環(huán)GRN-SP(1_9)生物標(biāo)記物濃度源自心臟來源。圖IB是柱形圖，示出循環(huán)成熟饑餓素由心臟清除。圖2示出放射免疫測定的結(jié)果，表明健康人體中GRN-SP(1-9)的血漿濃度與BMI 不表現(xiàn)任何相關(guān)性。圖3示出放射免疫測定的結(jié)果，表明正常健康個體血液中的饑餓素-SPn(l-9)免 疫反應(yīng)性與體重指數(shù)不表現(xiàn)相關(guān)性。圖4示出放射免疫測定的結(jié)果，表明通過口服攝入75g葡萄糖(一種用于代謝負(fù) 荷下胰島素敏感性和釋放的常用試驗(yàn))，免疫反應(yīng)性血漿饑餓素-SPn (1-9)，如饑餓素本 身，被顯著降低。圖5是示意圖，概述人前饑餓素原的加工，導(dǎo)致產(chǎn)生自由信號、N-饑餓素以及饑餓 素肽。圖6放射免疫測定結(jié)果，示出了上圖在患有文件證明的ST段抬高的心肌梗死 (STEMI)的患者體內(nèi)，從醫(yī)院急診科表現(xiàn)時(shí)(t = 0)起GHR-SPn (1-9)生物標(biāo)記物的連續(xù)血 漿濃度。注意GHR-SPn的峰值水平在表現(xiàn)后約1-2小時(shí)獲得并經(jīng)8_12小時(shí)返回正常水平。 正常范圍的數(shù)據(jù)由紅線標(biāo)出，其中示出了正常范圍的上百分位(upper percentiles)和下 百分位(lower percentiles) 0下圖在上圖中鑒別的相同STEMI患者體內(nèi)的伴隨Tnl、 CK-MB以及肌紅蛋白血漿水平。圖7示出GRN-SP(1-9)生物標(biāo)記物抗血清的交叉反應(yīng)性數(shù)據(jù)的表格。圖8示出分別來自大鼠、人、羊、豬、小鼠、狗和貓的饑餓素信號肽序列的共有序列 比X寸(——至文個生比X寸，consensus alignment)。定義
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急性心臟疾病(AOT)包括但不限于急性冠狀動脈綜合征，包括在呈現(xiàn)的ECG上具 有ST段抬高的急性心肌梗死(AMI)，不穩(wěn)定型心絞痛，以及急性非ST段抬高型心肌梗死； 心肌缺血；急性心肌損傷；急性藥物毒性造成的急性心肌損害，急性心肌病，以及心臟移植 排斥。這些疾病的充分描述、定義可參見參考文獻(xiàn)1。AOT/肺疾病是指患有未確診的、或疑似A⑶或肺疾病的對象。急性冠狀動脈綜合征(ACS)包括各種不同的心肌缺血事件，包括不穩(wěn)定型心絞 痛，在呈現(xiàn)的心電圖(ECG)上具有ST段抬高的急性心肌梗死，以及在ECG上沒有ST段抬高 的急性心肌梗死。術(shù)語"抗體"是指具有特定結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子，其特異性地相互作用(結(jié) 合)于包含抗原(用于合成抗體)的分子或特異性地相互作用(結(jié)合)于與它密切相關(guān)的 抗原。如在本文中所使用的，術(shù)語"抗體"廣泛地包括全長抗體并且還可以包括它們的某 些抗體片段。還包括單克隆和多克隆抗體、多價(jià)和單價(jià)抗體、多特異性抗體(例如雙特異性 抗體)、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體以及具有成熟親和力的抗體。如果抗體優(yōu)先結(jié)合于 GRN-SP,例如與非GRN-SP多肽具有小于25 %、或小于10 %、或小于1 %或小于0. 1 %的交叉 反應(yīng)性，則抗體選擇性地或特異性地結(jié)合于本發(fā)明的GRN-SP多肽。通常，對于抗原或表位， 抗體將具有不大于10_6、或1(TM、或小于約10_8M、或10_9M、或10_1(1、或10—11或ICT12M的結(jié)合 親和力(解離常數(shù)(Kd)值)?？梢岳缋帽砻娴入x子體共振、或Scatchard分析，來評估 結(jié)合親和力。如在本文中所使用的，“抗原結(jié)合片段"或"抗體片段"是指完整抗體的一部 分，該部分優(yōu)選保留抗體片段的大多數(shù)或全部、或者最低限度至少一種的正常功能?？贵w片 段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab' )2以及Fv片段、線性抗體、雙體分子(diabodies)、單鏈 抗體(ScFV)以及多特異性抗體。如在本文中所使用的，“單克隆抗體"是指這樣的抗體，其相對于單靶抗原是高 度特異性抗體。單克隆抗體可以獲自同源或基本同源抗體的群體，其中，除了可能少量發(fā)生 的自然突變，每個單克隆抗體是相同的和/或結(jié)合相同表位?！胺蛛x的抗體"是已鑒定的抗體，其已分離或回收(或分離并回收)自它的自然 環(huán)境的部分中。例如，分離自包括酶和激素的蛋白質(zhì)。在一種實(shí)施方式中，將抗體純化至按 重量計(jì)至少95 %、或96 %或97 %或98 %或99 %的抗體?？梢酝ㄟ^例如勞氏法來確定純度。 通常，通過至少一個純化步驟來制備抗體。如在本文中所使用的，術(shù)語"結(jié)合劑"是指任何固體或非固體材料，其能夠結(jié)合 GRN-SP或其片段或變體。在一種實(shí)施方式中，該術(shù)語是指任何天然或非天然分子，其結(jié)合于 GRN-SP或其片段或變體。結(jié)合劑的實(shí)例包括蛋白質(zhì)、肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、以及小分 子化合物。一種選擇性或特異性結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段。如在本文中所使用的，樣品或生物樣品是指獲自或源自待篩查對象的任何樣品。 樣品可以是本領(lǐng)域已知的任何樣品，其中可以檢測GRN-SP生物標(biāo)記物。包括任何體液如血 漿、血液、唾液、間質(zhì)液、血清、尿液、滑液、腦脊液、淋巴液、精液、羊膜液、心包液和腹水，以 及組織如心臟組織，但不限于此。術(shù)語"表位"包括任何蛋白質(zhì)決定子，其能夠特異結(jié)合于免疫球蛋白和/或T 細(xì)胞受體。即，在抗原上的B和/或T細(xì)胞對其響應(yīng)的位點(diǎn)?？乖瓫Q定簇(表位決定子，
13epitopic determinant)通常包括分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)如氨基酸或糖側(cè)鏈，并且通常 具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征、以及特定的電荷特性。表位通常包括至少3、5或通常8-10個氨 基酸。這些氨基酸可以是連續(xù)的、或通過三級折疊并列的非連續(xù)氨基酸。術(shù)語“在發(fā)作或臨床表現(xiàn)的6小時(shí)內(nèi)”包括在醫(yī)療設(shè)施處例如A⑶、心臟移植排斥 或未確診的或疑似ACD/肺疾病的發(fā)作或表現(xiàn)的1分鐘直至并包括360分鐘。可以在發(fā)作 或表現(xiàn)的4小時(shí)(從1分鐘直至并包括240分鐘)內(nèi)、在2小時(shí)(從1分鐘直至并包括120 分鐘)內(nèi)或在1小時(shí)(從1分鐘直至并包括60分鐘)內(nèi)、在發(fā)作或表現(xiàn)的5至45分鐘、15 至40分鐘、20至35分鐘內(nèi)、或在25至30分鐘內(nèi)，進(jìn)行測量。在一種實(shí)施方式中，比對照或參考值"更高"或"更低"的水平，或與對照或參 考值的變化、差異、或偏差是統(tǒng)計(jì)上顯著的。如果和對照或參考水平相比，與對照或參考水 平的水平差異為約5%或更大、約10%或更大、約20%或更大、或約50%或更大，則可以認(rèn) 為存在更高水平、更低水平，與對照或參考水平或平均對照或參考水平存在差異、或偏差， 或變化。統(tǒng)計(jì)上的顯著性可以可替換地被計(jì)算為05。在一種進(jìn)一步的可替換實(shí)施方 式中，可以通過借助于測定參考限度或參考區(qū)間來確定更高水平、更低水平、偏差、以及變 化。這些可以計(jì)算自直觀評估或非參數(shù)方法。一般來說，這些方法計(jì)算0.025以及0.975 分位數(shù)作為0.025* (n+1)以及0.975 (n+1)。這樣的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的22’23。存在 對照中不存在的標(biāo)記物(包括GRN-SP)，例如，也被設(shè)想為更高水平、偏差或變化。不存在在 對照中存在的標(biāo)記物(包括GRN-SP)也被設(shè)想為更低水平、偏差或變化。包括獲自或源自任何對象的樣品如來自沒有生物事件或障礙(包括葡萄糖代謝 障礙、糖尿病或ACD)的臨床病史的正常健康對象以及患有各種ACD的對象，其中上述ACD 包括但不限于在呈現(xiàn)的ECG上具有ST段抬高的急性冠狀動脈綜合征(AMI)，不穩(wěn)定型心絞 痛，以及急性非ST段抬高型MI ；心肌缺血；急性心肌損傷；急性藥物毒性造成的急性心肌 損害、急性心肌病、以及心臟移植排斥。如在本文中所使用的，術(shù)語〃心肌病〃是指心肌的疾病，其中心肌變虛弱。這可以 導(dǎo)致心臟抽吸減少。心肌病的常見原因是心臟病發(fā)作、病毒感染、高血壓、酒精中毒、以及自 身免疫病。如在本文中所使用的，“生物事件或障礙”是指這樣一類事件，其中GRN-SP生物標(biāo) 記物被釋放到對象的循環(huán)中，包括急性和慢性病癥。典型的病癥包括代謝病如肥胖癥、糖尿 病、腎病、葡萄糖代謝障礙，其包括代謝綜合征、葡萄糖不耐受、高血糖、以及胰島素抗性；非 酒精性脂肪肝病(包括非酒精性脂肪肝炎(steatoh印atitis))和脂肪肝病(包括酒精性 肝病)、心血管疾病(包括ACD如但不限于急性冠狀動脈綜合征)。慢性病癥的實(shí)例是糖尿 病和心血管疾病。術(shù)語GRN-SP是指用于人前饑餓素原序列(SEQ ID NO 1)的完全23個氨基酸GRN 信號肽。GRN-SP (1-23)分開顯示在SEQ IDNO 15中。GRN-SP生物標(biāo)記物包括GRN-SP以及 GRN-SP衍生或GRN-SP相關(guān)的多肽，其包括GRN-SP的變體或片段，或基本上由、或由GRN-SP 的變體或片段組成?？捎米鱃RN-SP生物標(biāo)記物的片段包括GRN-SP (1-9) (SEQ ID NO: 17)。 在一種實(shí)施方式中，GRN-SP作為信號多肽，或作為抗體可以與其結(jié)合的抗原多肽。GRN-SP 的變體和片段包括保留至少抗原性結(jié)合功能的變體和片段。如在本說明書和權(quán)利要求中所使用的，術(shù)語"包括"是指“至少部分由...組成”;這就是說，當(dāng)解釋在包括"包括"的本說明書和權(quán)利要求中的陳述時(shí)，在每個陳述中以此 術(shù)語為開端的特征均需存在，但也可以存在其它特征。以類似方式解釋相關(guān)術(shù)語如"包 含〃。如在本文中所使用的，術(shù)語"糖尿病"包括I型(糖尿病)和II型糖尿病。I型 糖尿病被定義為慢性高血糖的狀態(tài)。在葡萄糖耐量試驗(yàn)2小時(shí)以后、或在隨機(jī)樣品中，大于
7.Ommol/L和/或超過11. lmmol/L的數(shù)值的空腹靜脈血漿葡萄糖水平指示I型糖尿病(參 B Oxford Textbook of Medicine, Warrell et al ；4th Ed，2005，p317)。如在本文中所使用的，術(shù)語"葡萄糖代謝障礙"包括高血糖和低血糖的各種狀 態(tài)(包括代謝綜合征)。高血糖狀態(tài)包括糖耐量減低(IGT)和空腹血糖受損(ire)。小 于7. 0mmol/L的空腹靜脈血漿葡萄糖水平和在2小時(shí)的葡萄糖耐量試驗(yàn)值在7. 8和 11. lmmol/L之間指示IGT。6. 1至6. 9mmol/L的空腹血糖水平指示IFG (參見Oxford Textbook of Medicine,上文)。如在本文中所使用的，術(shù)語"葡萄糖耐量試驗(yàn)"是指眾所周知的葡萄糖試驗(yàn)， 其通常在空腹以后進(jìn)行，其中對象喝溶解在250ml水中的75g無水葡萄糖(參見Oxford Textbook of Medicine,上文)。如在本文中所使用的，術(shù)語"多核苷酸"是指任何長度的單或雙鏈脫氧核糖核苷 酸或核糖核苷酸聚合物，并且作為非限制性實(shí)例包括基因的編碼和非編碼序列、有義和反 義序列、外顯子、內(nèi)含子、基因組DNA、cDNA、mRNA前體、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA, tRNA、核 酶、重組多核苷酸、分離和純化的天然存在的DNA或RNA序列、合成RNA和DNA序列、核酸探 針、引物、片段、基因構(gòu)建體、載體以及修飾多核苷酸。可以類似地理解核酸分子。本文提供的多核苷酸序列的"片段"是連續(xù)核苷酸的亞序列，該亞序列能夠特異 性地雜交于感興趣的靶，例如，長度為至少10個核苷酸的序列。在一種實(shí)施方式中，本發(fā) 明的片段包含 SEQ ID NO 16 的多核苷酸中至少 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67 或 68 個連續(xù)核苷酸。 多核苷酸序列的片段可以用作引物、探針、包括在微陣列中、或用于本文的基于多核苷酸的 選擇方法中。應(yīng)當(dāng)類似地理解本發(fā)明的其它多核苷酸的片段(如SEQ ID NO 18)或本文描 述的多核苷酸。例如，對于GRN-SP多核苷酸SEQ ID NO 18，片段具有SEQ ID NO :18中的 至少 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 或 26 個連續(xù)核苷酸。術(shù)語"引物"是指短多核苷酸，通常具有自由的3' OH基團(tuán)，其雜交于模板并用 于引發(fā)互補(bǔ)于靶的多核苷酸的聚合作用。術(shù)語"探針"是指短多核苷酸，在基于雜交的測定中，該短多核苷酸用來檢測互 補(bǔ)于探針的多核苷酸序列。探針可以包括如本文所定義的多核苷酸的"片段"。如在本文中所使用的，術(shù)語"多肽"包括任何長度的氨基酸鏈，包括全長序列，其 中通過共價(jià)肽鍵來連接氨基酸殘基。可用于本發(fā)明的多肽可以是純化的天然產(chǎn)物，或可以 部分或全部地利用重組或合成技術(shù)來產(chǎn)生。該術(shù)語可以指多肽、多肽的聚集體如二聚體或 其它多聚體、融合多肽、多肽片段、多肽變體、或它們的衍生物。本文中的多肽可以具有全長 GRN-SP蛋白(SEQ ID NO 15)的至少4個氨基酸、至少5個氨基酸、或至少6、至少7、至少
8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至
15少19、至少20、至少21、至少22、或所有23個氨基酸的鏈長。應(yīng)當(dāng)類似地理解本發(fā)明的其 它多肽(如SEQ ID NO 17)、或本文描述的其它多肽。多肽的"片段"是多肽的亞序列，其執(zhí)行生物活性或結(jié)合所需要的功能和/或提 供多肽的三維結(jié)構(gòu)。該術(shù)語可以指多肽、多肽的聚集體如二聚體或其它多聚體、融合多肽、 多肽片段、多肽變體、或它們的衍生物。在一種實(shí)施方式中，片段能夠執(zhí)行上述信號肽活性， 或保留GRN-SP(l-23) ,GRN-SP(1-9)、或本發(fā)明的其它多肽或本文描述的多肽的抗原結(jié)合特 性。當(dāng)應(yīng)用于本文披露的多核苷酸或多肽序列時(shí)，術(shù)語"分離的"用來指從它們的天 然細(xì)胞環(huán)境中分離出來的序列?？梢酝ㄟ^任何方法或方法的組合來獲得分離的分子，包括 生化、重組、以及合成技術(shù)。可以通過至少一個純化步驟來制備多核苷酸或多肽序列。如在本文中所使用的，術(shù)語"純化的"并不需要絕對純度。在一種實(shí)施方式中，純 化的是指在樣品中多核苷酸、多肽抗體、或宿主細(xì)胞至少90%、或95%、或98%、或99%的 同源性。相對于本文描述的其它分子和構(gòu)建體，應(yīng)類似地理解該術(shù)語。當(dāng)用于細(xì)胞或宿主細(xì)胞時(shí)，術(shù)語"分離的"描述這樣的細(xì)胞或宿主細(xì)胞，其已獲 得或分離自生物體或其自然環(huán)境，并且隨后被保持在如本領(lǐng)域已知的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中。該術(shù) 語并不限于單細(xì)胞本身，而且指包含在細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞或宿主細(xì)胞，并且可以包括單細(xì) 胞或單宿主細(xì)胞。術(shù)語"重組"是指這樣的多核苷酸序列，其從自然情況下圍繞它的序列分離出來 和/或重組于在自然情況下并不存在的序列。由〃重組〃多核苷酸序列翻譯而產(chǎn)生〃重組〃多肽序列。如在本文中所使用的，術(shù)語"變體"是指不同于具體鑒定序列的多核苷酸或多肽 序列，其中1至18或更多核苷酸、以及1至6或更多氨基酸殘基被缺失、取代、或添加。具 體設(shè)想 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17 或 18 個核苷酸的取代。還設(shè)想 1、 2、3、4、5或6個氨基酸的取代、添加或缺失。變體可以是天然存在的等位基因變體、或非 天然存在的變體。變體可以來自相同或來自其它物種并且可以包括同源物、旁系同源物 (paralogies)以及直系同源物(orthologues)。在某些實(shí)施方式中，可用于本發(fā)明的多肽 的變體具有包括信號肽活性或抗原結(jié)合特性的生物活性，其相同于或類似于親代多肽或多 核苷酸的生物活性。關(guān)于多核苷酸和多肽的術(shù)語"變體"包括如本文所定義的所有形式的 多核苷酸和多肽。相對于本發(fā)明的序列，變體多核苷酸序列呈現(xiàn)至少50%、至少60%、至少70%、至 少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至 少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至 少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少 95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的同一性。借助于至少10個核苷酸位 置、至少15個核苷酸位置、至少20個核苷酸位置、至少27個核苷酸位置、至少40個核苷酸 位置、至少50個核苷酸位置、至少60或至少65個核苷酸位置的對比窗，或借助于SEQ ID NO 16的全長多核苷酸，來確定同一性。對于本文披露的其它多核苷酸，可以類似地確定同 一性。例如，對于 SEQ ID NO :18，對比窗可以是至少 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26或27個核苷酸位置。
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可以基于候選和主題多核苷酸序列之間的重疊序列的全長來計(jì)算多核苷酸序列 同一'性，其中利用全局序列比對(global sequence alignment)程序(例如Needleman， S. B. and ffunsch,C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48，443-453)。Needleman-Wunsch 全局比對算法 的全面實(shí)施參見EMBOSS程序包中的針程序(Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. EMBOSS The European Molecular Biology OpenSoftware Suite,Trends in Genetics June 2000, vol 16, No 6. pp. 276-277),其可以獲自 http: //www, hgmp. mrc. ac. uk/Software/EMBOSS/。 歐洲生物信息研究所服務(wù)器還提供設(shè)施以在兩個序列之間在線進(jìn)行EMBOSS-針全局比對 (http/www. ebi. ac. uk/emboss/align/) 0 可替換地，可以使用GAP程序，其計(jì)算兩個序列的最佳全局比對而沒有罰分末端間 隙。在以下論文中描述了 GAP :Huang，X. (1994) On Global Sequence Alignment (Computer Applications in the Biosciences 10,227-235)。多核苷酸變體還包括那些變體，其呈現(xiàn)與一個或多個具體鑒定序列的相似性，其 很可能保存那些序列的功能對等并且將不能合理地預(yù)計(jì)以隨機(jī)機(jī)會已發(fā)生。此程序發(fā)現(xiàn)在 序列之間相似性的區(qū)域并且對于每個這樣的區(qū)域報(bào)道"E值"，該E值是在包含隨機(jī)序列 的固定參考大小的數(shù)據(jù)庫中可以預(yù)計(jì)偶然看到這樣的配對的次數(shù)的預(yù)計(jì)數(shù)。這種數(shù)據(jù)庫的 大小在bl2seq程序中默認(rèn)設(shè)置。對于較小的E值(遠(yuǎn)小于1)，E值大約是這樣的隨機(jī)配對 的概率。當(dāng)和任何一種具體鑒定序列比較時(shí)，變體多核苷酸序列優(yōu)選呈現(xiàn)小于IX 10_5、小 于 IX 10-6、小于 IX 10-9、小于 IX 1(Γ12、小于 IX 1(Γ15、小于 IX IO-18 或小于 IXlO-21 的 E 值。還可以下述方式來確定多核苷酸序列同一性和相似性。利用序列比對算法和序列 相似性搜索工具如在Genbank、EMBL、Swiss-PROT以及其它數(shù)據(jù)庫中，比較主題多核苷酸序 列和候選多核苷酸序列。Nucleic Acids Res 29:1-10 and 11-16，2001提供了在線資源 的實(shí)例。BLASTN優(yōu)選用于確定根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸變體的序列同一性。BLASTN(來自 BLAST成套程序，版本2. 2.，2008年 4 月 18 日，在bl2seq 中(Tatiana A. et al，F(xiàn)EMS Microbiol Lett. 174 :247_250 (1999)、Altschul et al. ,Nuc. Acis Res 25: 3389-3402，(1997))可公開獲自 NCBI (ftp //fto. ncbi. nih. Rov/blast/)或獲自 NCBl (于 Bethesda, Maryland, USA)。除了應(yīng)關(guān)閉低復(fù)雜性部分的過濾，采用bl2seq的默認(rèn)參數(shù)?？梢允褂靡韵耈NIX命令行參數(shù)來檢查多核苷酸序列的同一性bl2seq-i nucleotideseql-jnucleotideseq2_F F_p blastn參數(shù)-F F關(guān)閉低復(fù)雜性部分的過濾。參數(shù)-P選擇用于序列對的適當(dāng)?shù)乃惴āＴ?行〃 Identities="中，bl2seq程序?qū)⑿蛄型恍詧?bào)道為相同核苷酸的數(shù)量和百分比?？商鎿Q地，變體多核苷酸是這樣的多核苷酸，該多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交于指 定的多核苷酸序列、或其補(bǔ)體。術(shù)語"在嚴(yán)格條件下雜交"、以及其語法等效表述，是指在溫度和鹽濃度的規(guī)定 條件下，多核苷酸分子雜交于靶多核苷酸分子(如固定在DNA或RNA印跡上的靶多核苷酸 分子，如Southern印跡或Northern印跡)的能力?？梢酝ㄟ^在較低嚴(yán)格條件下的最初雜 交，然后增加嚴(yán)格性至所期望的嚴(yán)格性，來確定在嚴(yán)格雜交條件下雜交的能力。關(guān)于長度大于約100個堿基的多核苷酸分子，典型的嚴(yán)格雜交條件是低于天然雙鏈體的解鏈溫度(Tm)不大于25至30°C (例如，10°C )( 一般地參見，Sambrook et al, Eds,1987,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press ； Ausubel et al,1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 其以引用方式結(jié)合于本文)?？梢酝ㄟ^公式Tm = 81. 5+0. 41% (G+C-log(Na+)來計(jì)算大 于約 100 個堿基的多核苷酸分子的 Tm(Sambrook et al, Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press ；Bolton and McCarthy,1962, PNAS 84:1390)。用于長度大于100個堿基的多核苷酸的典型的嚴(yán)格條件將是雜交條件如 在6X SSC、0. 2% SDS的溶液中預(yù)洗滌；在65°C、6X SSC、0. 2% SDS下雜交過夜；接著兩次 30分鐘的洗滌，每次在IX SSC、0. SDS中，于65°C下，以及兩次30分鐘的洗滌，每次在 0. 2X SSC,0. 1% SDS 中，于 65°C下。在一種實(shí)施方式中，嚴(yán)格條件使用在42°C下的50%甲酰胺、5x SSC、50mM磷酸鈉 (pH6. 8)、0. 1 %焦磷酸鈉、5x登哈特溶液、經(jīng)超聲處理的鮭魚精子DNA(50 μ g/ml)、0. 1 % SDS,以及10%硫酸葡聚糖，在42°C下在0. 2x SSC中洗滌以及在55°C下在50%甲酰胺中洗 滌，接著在55°C下用包含EDTA的0. Ix SSC洗滌。關(guān)于長度小于100個堿基的多核苷酸分子，典型的嚴(yán)格雜交條件是低于Tm 5至 10°C。平均來說，長度小于IOObp的多核苷酸分子的Tm被降低大約(500/寡核苷酸長 度)°C。關(guān)于DNA 模擬物，其稱作肽核酸(PNA) (Nielsen et al, Science. 1991 Dec 6 ； 254(5037) =1497-500), Tm值高于DNA-DNA或DNA-RNA雜交體的Tm值，并且可以利用在 Giesen et al,Nucleic Acids Res. 1998 Nov 1 ；26(21) :5004_6 中描述的公式來計(jì)算。對 于長度小于100個堿基的DNA-PNA雜交體，典型的嚴(yán)格雜交條件是低于Tm 5至10°C。變體多核苷酸也包括這樣的多核苷酸，其不同于本發(fā)明的序列，但是由于遺傳密 碼的簡并性，其編碼與由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽具有類似活性的多肽。并不改變多 肽的氨基酸序列的序列改變是"沉默變化(silent variation)“。除了 ATG(蛋氨酸)和 TGG(色氨酸)，通過技術(shù)領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)，可以改變用于相同氨基酸的其它密碼子，例如， 以在特定宿主生物體中優(yōu)化密碼子表達(dá)。在編碼多肽序列中導(dǎo)致一個或若干氨基酸的保守取代而沒有顯著改變其生物活 性的多核苷酸序列改變也包括在本發(fā)明中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了用于進(jìn)行表型沉默氨基 酸取代的方法(參見,例如，Bowie et al，1990，Science 247，1306)。利用bl2seq程序并借助于tblastx算法(如上所述)，可以確定由于編碼多肽序 列中的沉默變化和保守取代而產(chǎn)生的變體多核苷酸。相對于多肽，術(shù)語"變體"還包括天然存在的、重組和合成產(chǎn)生的多肽。相對于本 發(fā)明的序列，變體多肽序列優(yōu)選呈現(xiàn)至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少71 %、至少72 %、 至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至 少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至 少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、或至少99%的同一性?；谥辽?、至少7、至少10、至少15、至少20、至 少21或至少22個氨基酸位置的對比窗，或基于SEQ ID NO 15的多肽、或在本發(fā)明中披露 或使用的其它多肽的全長，來確定同一性。例如，對于SEQ ID NO :17，對比窗可以是至少5、6、7、8或氨基酸位置，或多肽的全長。多肽變體還包括那些變體，其呈現(xiàn)與一個或多個具體鑒定序列的相似性，其很可 能保存那些序列的功能對等(funtional equivalence)并且將不能合理地預(yù)計(jì)通過隨機(jī)機(jī) 會已發(fā)生。正如上面所討論的，在GRN-SP變體的情況下，功能可以是作為信號多肽、或抗原 多肽、或這兩者?？梢韵率龇绞絹泶_定多肽序列同一性和相似性。利用bl2seq中的BLASTP(來自 BLAST 成套程序，版本 2. 2. 18 [2008 年 4 月])，其可公開獲自 NCBI (ftp//ftp, ncbi. nih. gov/blast/)，比較主題多肽序列和候選多肽序列。除了應(yīng)關(guān)閉低復(fù)雜性區(qū)域的過濾，采用 bl2seq的默認(rèn)參數(shù)?？梢允褂靡韵耈NIX命令行參數(shù)來檢查多肽序列的相似性bl2seq-i peptideseql-j peptideseq2_F F_p blastp參數(shù)-F F關(guān)閉低復(fù)雜性部分的過濾。參數(shù)-P選擇用于序列對的適當(dāng)?shù)乃惴?。?程序發(fā)現(xiàn)在序列之間具有相似性的區(qū)域并且對于每個這樣的區(qū)域報(bào)道"E值"，該E值是 在包含隨機(jī)序列的固定參考大小的數(shù)據(jù)庫中可以預(yù)計(jì)偶然看到這樣的配對的次數(shù)的預(yù)計(jì) 數(shù)。對于較小的E值(遠(yuǎn)小于1)，E值大約是這樣的隨機(jī)配對的概率。當(dāng)和任何一種具體鑒定序列比較時(shí)，變體多肽序列通常呈現(xiàn)小于1X10_5、小于 1 X 10-6、小于 IX 10-9、小于 IX 1(Γ12、小于 IX 1(Γ15、小于 IX IO-18 或小于 1Χ1(Γ21 的 E 值。也可以基于在候選和主題多肽序列之間重疊序列的全長并利用全局序列比對程 序來計(jì)算多肽序列同一性。EMBOSS針(可獲自http:/www. ebi. ac. uk/emboss/align/)和 GAP(Huang, Χ. (1994)On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the BioscienceslO，227-235.)，正如上面所討論的，也是適宜的用來計(jì)算多肽序列同一性的全 局序列比對程序。如上所述的BLASTP的應(yīng)用優(yōu)選用于確定根據(jù)本發(fā)明的多肽變體。在一種實(shí)施方式中，變體包括這樣的肽，其序列與本文中的人GRN-SP(1_23)SEQ ID NO 15或GRN-SP (1-9) SEQ ID NO :17相差1、2、3、4、5、6或更多保守性氨基酸取代、缺失、 添加或插入，其并不影響肽的生物活性。保守取代通常包括一種氨基酸取代另一種具有類 似特性的氨基酸，例如，在以下組內(nèi)的取代纈氨酸、甘氨酸；甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮 氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；以 及苯丙氨酸、酪氨酸。保守取代的實(shí)例還可以參見如示于序列表中的GRN-SP的序列，從而 示出和人序列相比在不同哺乳動物物種中的取代。其它保守取代可以獲自圖8和以下表1。表 1
19原有殘基典型取代其它取代
Ala (A)val; leu; ile
Arg (R)lys; gin; asn
Asn (N)gin; his; lys; arg
Asp (D)glu
Cys (C)sertyr
Gln (Q)asn
Glu (E)asp
Gly (G)pro; alaarg, ser
His (H)asn; gin; lys; arg
^0170]Ile (I)leu; val; met; ala; phe;正亮氨酸
Leu (L)正亮氨酸；ile; val; met; ala; phe
Lys (K)arg; gin; asn
Met (M)leu; phe; ileval
Phe (F)leu; val; ile; ala; tyr
Pro (P)alaval, leu, ser, thr
Ser(S) α
Thr(T)serala
Trp (W)tyr; pheleu
Tyr (Y)trp; phe; thr; ser
Val (V)ile; leu; met; phe; ala;正亮氨酸基于常見的側(cè)鏈性能，天然存在的殘基被分組(1)疏水的正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile ；(2)中性親水的cys、ser、thr ；(3)酸性的asp、glu ；(4)喊個生的:asn> gln>his> lys> arg ；(5)影響鏈定向的殘基gly、pro ；以及(6)芳族的trp、tyr、phe。非保守取代將意味著這些中的一種類型的一個成員替換為另一種類型的一個成
員O其它變體包括具有影響肽穩(wěn)定性的修飾的肽。這樣的類似物可以包含，例如，在肽 序列中的一個或多個非肽鍵(其代替肽鍵)。還包括類似物，這些類似物包括不同于天然存 在的L-氨基酸的殘基，例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸，例如β或γ氨基酸以 及環(huán)狀類似物?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的誘變方法來進(jìn)行取代、缺失、添加或插入。技術(shù)人員將明了 用于進(jìn)行表型沉默氨基酸取代的方法。參見例如Bowie et al. , 1990, Science 247，1306.9， Kunkel, T ； 1985, PNAS,85p 488.27。本發(fā)明的多肽還包括那些在合成期間或以后已被修飾的多肽，例如通過生物素化、芐基化、糖基化、磷酸化、酰胺化，通過衍化，其中使用封閉/保護(hù)基團(tuán)等。上述修飾可 以提高多肽的穩(wěn)定性或活性。上述修飾在本領(lǐng)域是眾所周知的。參見例如，Sambrook and Ausubel (上文)、以及 Lundblad，R, CRC Press, 1995.28。術(shù)語"基因構(gòu)建體"是指多核苷酸分子，通常是雙鏈DNA，其可以在其中已插入另 一種多核苷酸分子(插入多核苷酸分子)如但不限于cDNA分子?；驑?gòu)建體可以包含必要 元件，其允許轉(zhuǎn)錄插入多核苷酸分子，并且可選地，將轉(zhuǎn)錄物翻譯到多肽中。插入多核苷酸 分子可以源自宿主細(xì)胞，或可以源自不同的細(xì)胞或生物體和/或可以是重組多核苷酸。在 宿主細(xì)胞內(nèi)以后，基因構(gòu)建體可以被整合于宿主染色體DNA。基因構(gòu)建體可以連接于載體。術(shù)語"載體"是指多核苷酸分子，通常是雙鏈DNA，其用來將基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)運(yùn)到宿 主細(xì)胞中。載體能夠在至少一種另外的宿主系統(tǒng)如大腸桿菌(E.coli)中復(fù)制。術(shù)語"表達(dá)構(gòu)建體"是指基因構(gòu)建體，該基因構(gòu)建體包括必要元件，其允許轉(zhuǎn)錄 插入片段多核苷酸分子，并且可選地，將轉(zhuǎn)錄物翻譯到多肽中。表達(dá)構(gòu)建體通常在5'至 3'方向包含(a)啟動子，其在構(gòu)建體將被轉(zhuǎn)化進(jìn)入的宿主細(xì)胞中起作用，(b)待表達(dá)的多核苷酸，以及(c)終止子，其在構(gòu)建體將被轉(zhuǎn)化進(jìn)入的宿主細(xì)胞中起作用。術(shù)語〃編碼區(qū)〃或〃開放閱讀框〃(ORF)是指基因組DNA序列或cDNA序列的有 義鏈，其能夠在適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的控制下產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品和/或多肽。通過5'翻譯起始密碼子 和3'翻譯終止密碼子的存在來鑒定編碼序列。當(dāng)被插入基因構(gòu)建體時(shí)，并且當(dāng)它可操作連 接于啟動子和終止子序列和/或其它調(diào)節(jié)元件時(shí)，“編碼序列"能夠被表達(dá)。“調(diào)節(jié)元件"和"多核苷酸調(diào)節(jié)元件"是指任何元件，其控制或影響多核苷酸插 入(片段)表達(dá)自載體、基因構(gòu)建體或表達(dá)框，并且包括啟動子、轉(zhuǎn)錄控制序列、翻譯控制序 列、復(fù)制起點(diǎn)、組織特異性調(diào)節(jié)元件、時(shí)間調(diào)節(jié)元件(temporal regulatory element)、增強(qiáng) 子、聚腺苷?；盘?、阻遏物以及終止子。根據(jù)本發(fā)明，相對于待表達(dá)自載體、基因構(gòu)建體或 表達(dá)框的多核苷酸插入(片段)，調(diào)節(jié)元件可以是同源的或異源的。如在本文中所使用的，關(guān)于多核苷酸調(diào)節(jié)元件(PRE)和在基因構(gòu)建體中PRE可操 作連接的序列之間的關(guān)系，“同源"是指，PRE通常在性質(zhì)上與在構(gòu)建體中它可操作連接 的編碼序列有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明，同源多核苷酸調(diào)節(jié)元件可以可操作連接于感興趣的多核苷 酸以致感興趣的多核苷酸可以表達(dá)自載體、基因構(gòu)建體或表達(dá)框。如在本文中所使用的，關(guān)于多核苷酸調(diào)節(jié)元件(PRE)和在基因構(gòu)建體中PRE可操 作連接的序列之間的關(guān)系，“異源"是指PRE并不通常在性質(zhì)上與在構(gòu)建體中它可操作連 接的編碼序列有關(guān)。上述PRE可以包括通常與不同基因(不同于GRN)有關(guān)的啟動子，和/ 或分離自任何其它細(xì)菌、病毒、真核細(xì)胞、或哺乳動物細(xì)胞的啟動子?！翱刹僮鬟B接"是指待表達(dá)的序列置于調(diào)節(jié)元件的控制下，其中上述調(diào)節(jié)元件包 括啟動子、轉(zhuǎn)錄控制序列、翻譯控制序列、復(fù)制起點(diǎn)、組織特異性調(diào)節(jié)元件、時(shí)間調(diào)節(jié)元件、 增強(qiáng)子、聚腺苷?；盘枴⒆瓒粑镆约敖K止子。術(shù)語“非編碼區(qū)“是指非翻譯序列，其是翻譯起始位點(diǎn)的上游和翻譯終止位點(diǎn)的 下游。這些序列還分別稱作5' UTR和3' UTR。這些區(qū)包括為轉(zhuǎn)錄起始和終止以及為翻譯 效率調(diào)節(jié)所需要的元件。
終止子是這樣的序列，其終止轉(zhuǎn)錄并存在于在翻譯序列下游的基因的3'未翻譯 末端。終止子是mRNA穩(wěn)定性的重要的決定子(determinants)并在某些情況下已發(fā)現(xiàn)具有 空間調(diào)節(jié)功能。術(shù)語"啟動子"是指在編碼區(qū)上游的非轉(zhuǎn)錄順式調(diào)節(jié)元件，其調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。啟 動子包括順式起始元件，其指定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及保守盒如TATA盒，以及由轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 的基序。術(shù)語本發(fā)明的多核苷酸或多肽的"改變表達(dá)"用來包括這樣的情況，其中對應(yīng)于 本發(fā)明的多核苷酸的基因組DNA被修飾，從而導(dǎo)致本發(fā)明的多核苷酸或多肽的改變表達(dá)。 基因組DNA的修飾可以通過基因轉(zhuǎn)化或本領(lǐng)域已知的用于誘導(dǎo)突變的其它方法進(jìn)行。“改 變表達(dá)"可以涉及所產(chǎn)生的信使RNA和/或多肽的量的增加或減少并且還可以導(dǎo)致多肽的 改變的活性，這是由于所產(chǎn)生的多核苷酸和多肽的序列的改變。如在本文中所使用的，“對象"優(yōu)選是哺乳動物并且包括人、以及非人哺乳動物 如貓、狗、馬、牛、羊、鹿、小鼠、大鼠、靈長類動物(包括大猩猩、獼猴以及黑猩猩)、負(fù)鼠以及 其它家庭農(nóng)場或動物園動物。在一種實(shí)施方式中，哺乳動物是人。如在本文中所使用的，術(shù)語"表現(xiàn)"是指對象在醫(yī)療設(shè)施如診所或醫(yī)院中的表 現(xiàn)。如在本文中所使用的，“治療有效量"或"治療有效劑量"是指足以產(chǎn)生所期望 的生理效應(yīng)的量或能夠?qū)崿F(xiàn)所期望的結(jié)果的量，尤其用于治療所期望的疾病或病癥，包括 減少或消除疾病或病癥的一種或多種癥狀或表現(xiàn)。術(shù)語"治療"以及"預(yù)防"是指治療或預(yù)防措施，其緩和、改善、處理、防止、抑 制、阻止或逆轉(zhuǎn)生物事件的進(jìn)展，其中上述生物事件的特征在于GRN-SP水平顯示與正常對 照水平的偏差并且包括葡萄糖代謝障礙、糖尿病、高血糖癥、肥胖癥、心血管疾病、ACD、或心 臟移植排斥或其效應(yīng)，尤其是ACS。對象可以顯示以下一種或多種的可觀測或可測量的(統(tǒng) 計(jì)上顯著的)減小葡萄糖、乳酸酯、胰島素、脂肪酸、甘油三酯、Τη, TnI, TnT, BNP, N-BNP, BNP-SP (及其片段)、ANP、ANP-SP (及其片段)、肌酸激酶-MB、肌紅蛋白、LDH、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨 酶、H-FABP、缺血修飾白蛋白、內(nèi)皮素、腎上腺髓質(zhì)素、腎素、血管緊張素II、以及本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的其它常用臨床標(biāo)記物，這表明得到改善。如在本文中所使用的，術(shù)語"質(zhì)譜法"是指基于它們的質(zhì)荷比來過濾、檢測、以及 測量離子的方法。參見例如 US 5，719，060、US6, 204，500,US 6，107，623,US 6，124，137,US 6，225，047、US 6，268，144、US 7，057，165、以及 US 7，045，366。通常的質(zhì)譜技術(shù)包括基質(zhì) 輔助激光解吸電離(MALDI)和表面增強(qiáng)激光解吸電離(SELDI)。兩者均可結(jié)合飛行時(shí)間分 析器(MALDI-T0F和SELDI-T0F)，其便于分析在非常短的離子脈沖中的毫微微摩爾水平的 分析物。例如在US 5，719，600,US 6，124，137、以及US 6，225，047中討論的并可用于本發(fā) 明的SELDI的版本包括表面增強(qiáng)親和捕獲(Surface-Enhanced Affinity Capture (SEAC))、 表面增強(qiáng)完全解吸(Surface-Enhanced Neat Desorption (SEND))、以及表面增強(qiáng)感光性附 著與釋放(Surface-Enhanced Photolabile Attachment and Release (SEPAR))。提及本文披露的一系列的數(shù)字(例如1至10)還旨在包括在所述范圍內(nèi)的所有相 關(guān)數(shù)字(例如，1、1. 1、2、3、3.9、4、5、6、6. 5、7、8、9以及10)以及在上述范圍內(nèi)的任何范圍的有理數(shù)(例如2至8、1.5至5. 5以及3. 1至4. 7)，因而，明確披露了本文明確披露的所有范 圍的所有子范圍。這些僅是具體設(shè)想的實(shí)例并且在列舉的最低值和最高值之間的數(shù)值的所 有可能的組合被認(rèn)為以類似方式明確陳述在本申請中。
具體實(shí)施例方式饑餓素(胃促生長素，GRN)是通過胎盤、腎臟、下丘腦和垂體的內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的 一種多肽激素。在胃里(饑餓素產(chǎn)生的主要場所)，胃底內(nèi)層的上皮細(xì)胞產(chǎn)生饑餓素。饑 餓素參與調(diào)節(jié)能量平衡。饑餓素通過激活下丘腦攝食中樞用于增強(qiáng)個體的食欲、攝食量和 最終體重。饑餓素誘發(fā)高血糖癥，并抑制胰島素的釋放。在心血管組織中也發(fā)現(xiàn)了饑餓素 及其受體(Garcia, E et al ；Ghrelin and cardiovascular health, Current opinion in Pharmacology, vol 6，Issue 2,2006, pl42_147)。如在 SEQ ID NO 1 中所示，前饑餓素原 是一種117個氨基酸分子。它由通過二硫橋連接的兩個多肽鏈(A和B)構(gòu)成。前饑餓素原 (1-117)被剪切以產(chǎn)生23個氨基酸的信號肽(SEQ ID NO 15)、94個氨基酸的饑餓素原以 及28個氨基酸的饑餓素激素。人前饑餓素原的加工示于圖5中。長期以來一直認(rèn)為，GRN-SP的功能作用限于控制饑餓素在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的運(yùn)輸。據(jù)推 斷，一旦做到這一點(diǎn)后，信號肽即被降解，甚至不再被細(xì)胞所分泌25。不同于慣常觀點(diǎn)，本發(fā)明的申請人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，GRN-SP，通常以GRN-SP片段的形 式，出現(xiàn)在循環(huán)中。此發(fā)現(xiàn)本身意味著GRN-SP和GRN-SP片段可用作一系列的生物事件 的循環(huán)生物標(biāo)記物。例如，可預(yù)計(jì)在糖尿病對象和未確診的糖尿病對象中，例如，ISN-SP 的水平將高于或低于正常對照或參考水平，其取決于對象是低胰島素血還是高胰島素血 (insulinemic)。更低水平則指示缺乏饑餓素作用或分泌。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了用于在對象中預(yù)測、診斷或監(jiān)測生物事件或障礙 的方法，其中事件或障礙與GRN-SP生物標(biāo)記物釋放到循環(huán)中有關(guān)，該方法包括(a)測量在來自對象的生物樣品中GRN-SP生物標(biāo)記物的水平；以及(b)比較GRN-SP生物標(biāo)記物的水平和來自對照的GRN-SP水平或參考值。其中測量水平與對照或參考水平的偏差指示生物事件或障礙。生物事件或障礙包括葡萄糖代謝障礙、糖尿病以及A⑶。因此，本發(fā)明還提供了用于在對象中評估葡萄糖代謝的方法，該方法包括(a)在給予葡萄糖以后測量在對象中GRN-SP生物標(biāo)記物的水平；以及(b)比較所述GRN-SP生物標(biāo)記物的水平和來自對照的GRN-SP水平或參考水平。其中GRN-SP的測量水平與對照或參考水平的偏差指示葡萄糖代謝障礙。通常，和對照水平相比，偏差將是更低的GRN-SP測量水平。例如，在患有高血糖癥 的對象中31。在此方法中，按照眾所周知的葡萄糖耐量試驗(yàn)規(guī)程(Oxford Textbook of Medicine，上文)，可以作為第一步驟給予葡萄糖?？梢栽诎凑諛?biāo)準(zhǔn)規(guī)程進(jìn)行葡萄糖試驗(yàn)以后2小時(shí)，來評估GRN-SP生物標(biāo)記物的血 漿濃度，通常為靜脈血漿GRN-SP。然而，例如在給予葡萄糖以后的15、30、45、60、90以及105 分鐘進(jìn)行中間測量也是有用的。本發(fā)明還提供了用于在對象中預(yù)測、診斷、評估或監(jiān)測糖尿病、或糖尿病可能性
23(潛在糖尿病，diabetic potential)的方法，該方法包括 (a)測量在來自對象的生物樣品中GRN-SP生物標(biāo)記物的水平；以及 (b)比較GRN-SP生物標(biāo)記物的水平和來自對照或參考的GRN-SP水平，其中GRN-SP生物標(biāo)記物的測量水平比對照或參考水平更高或更低指示糖尿病或 易患糖尿病體質(zhì)31。GRN-SP生物標(biāo)記物水平是高于還是低于正常水平，將取決于對象的胰島素狀態(tài)。本發(fā)明的申請人還已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在患有急性心肌梗死(AMI)的患者中，在 患者的癥狀發(fā)作以后的最初幾小時(shí)內(nèi)(實(shí)際是在醫(yī)院或診所表現(xiàn)時(shí))，GRN-SP的循環(huán)濃度 為最高。在最初2小時(shí)至6小時(shí)、或4小時(shí)內(nèi)觀測到的水平令人驚訝地非常高，經(jīng)常達(dá)到峰 值，該峰值為正常對照群體中水平的大約1. 5至5倍、通常2至3倍。過去沒有暗示饑餓素 或GRN-SP或GRN-SP片段可用作ACD、心臟移植排斥的標(biāo)記物或用于未確診或疑似ACD或肺 疾病的標(biāo)記物。這些發(fā)現(xiàn)暗示，GRN-SP生物標(biāo)記物可用作心臟移植排斥、A⑶包括急性冠狀動脈 綜合征(ACS)如AMI，尤其是非ST段抬高M(jìn)I，以及急性心肌缺血的非常清楚的早期標(biāo)記物， 并且可以用來區(qū)分A⑶和肺疾病?；谶@些令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的申請人已首次確定，在獲自對象的生物樣品 中篩查循環(huán)GRN-SP或其變體或片段，以及或可替換地編碼GRN-SP或其變體和片段的核苷 酸序列(尤其是在疾病發(fā)作或臨床表現(xiàn)的約6、約4或約2小時(shí)內(nèi))，將是有用的?？捎糜诒景l(fā)明的是GRN-SP的抗原片段或變體，其長度為至少4或5個氨基酸。 已知具有少至4個氨基酸的肽具有生物活性。參見例如Gilchrist et al，Biology and Iteproduction，21，732-739，2004;W&Sela et al. ,Behring GRN. Mitt.，91，54-66，1992。 特別有用的片段是在GRN-SP的N端(1-19)或C端。特異性抗原肽的實(shí)例是GRN-SP (1_9) SEQ ID N0:17。在SEQ ID NO 18給出相應(yīng)的核苷酸序列。由本發(fā)明的申請人首次提供這 些序列。核酸分子和肽均形成本發(fā)明的多個方面。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼GRN-SP片段的核酸分子，其中所述核酸 是(a) SEQ ID NO 18或其變體或片段；(b)相對于 SEQ ID NO :18 具有至少 70%、75%、80%、90%、95%或 99%序列同一 性的序列；(c)能夠在嚴(yán)格條件下雜交于SEQ ID NO 18的長度為至少10個核苷酸的序列；(d) (a)至(c)任何一種的補(bǔ)體；條件是該序列不是SEQ ID N0:16。SEQ ID NO 16是編碼信號肽的全長核酸序列。本發(fā)明還提供了由本發(fā)明的核酸分子編碼的分離的GRN-SP多肽和GRN-SP片段。本發(fā)明的具體多肽包括具有SEQ ID NO :17的氨基酸序列的多肽，如所附序列表中 所列出的。還設(shè)想如本文定義的這些多肽的變體和片段，或相對于SEQ ID N0:17的多肽具 有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%氨基酸同一性的氨基酸序列。在一種實(shí)施 方式中，變體或片段是功能等效變體或片段。即，變體或片段保持SEQ ID N0:17作為抗原 或信號肽的功能。當(dāng)然并不要求已知的全長GRN-SP (1-23) SEQ ID NO 15本身，但可用于本 發(fā)明。例如，這些多肽可以用于抗GRN-SP抗體的制備。
在一種實(shí)施方式中，分離了本發(fā)明的或本文描述的核酸分子。利用本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的各種技術(shù)，它們可以分離自生物樣品。例如，可以通過使用在Mullis et al., Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser 中描述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 來分離上述多核苷酸。可以利用源自本發(fā)明的多核苷酸序列的引物(如本文定義的)來擴(kuò) 增本發(fā)明的核酸分子。(參見例如Mullis，Sambrook，上文；以及Molecular Diagnostic PCR Handbook Gerrit, V et al. , Springer,2005)。用于分離多核苷酸的另外的方法包括使用所有、或部分的本發(fā)明的多核苷酸，尤 其是具有在SEQ ID NO :18中陳述的序列的多核苷酸，作為雜交探針。將標(biāo)記多核苷酸探針 雜交于固定在固體載體如硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上的多核苷酸的技術(shù)可以用來篩選基 因組或cDNA文庫。類似地，可以將探針結(jié)合于珠粒以及雜交于靶序列?？梢岳靡阎募?術(shù)領(lǐng)域的規(guī)程如磁性分離來進(jìn)行分離。典型的嚴(yán)格的雜交和洗滌條件如上文所給出的?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)如限制性內(nèi)切酶消化和寡核苷酸合成來產(chǎn)生多 核苷酸片段。在本領(lǐng)域眾所周知的方法中，部分多核苷酸序列可以用作探針，以鑒定樣品中的 相應(yīng)全長多核苷酸序列。上述方法包括基于PCR的方法、5' RACE (Methods Enzymol. 218 340-56(1993) ；Sambrook et al，上文)以及雜交為基礎(chǔ)的方法、計(jì)算機(jī)/數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)的 方法?？蓹z測標(biāo)記如放射性同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記以及生物發(fā)光標(biāo)記可以用 來方便檢測?；谝阎獏^(qū)域起始于引物，反向PCR還允許獲得未知序列，其側(cè)接本文披露的 多核苷酸序列(Triglia et al. ,Nucleic Acids Res 16，8186，(1998))。該方法使用若干 種限制性內(nèi)切酶，以在基因的已知區(qū)域中產(chǎn)生適宜的片段。然后通過分子內(nèi)連接作用，片段 被環(huán)化，并用作PCR模板。趨異性引物設(shè)計(jì)自已知區(qū)。為了實(shí)際組裝全長克隆，可以采用標(biāo) 準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法(Sambrook et al，上文)。便于本發(fā)明的多核苷酸的擴(kuò)增的引物和引 物對還形成本發(fā)明的另一方面?？梢酝ㄟ^所描述的方法來鑒定變體(包括直系同源物)?？梢岳没赑CR的 方法來鑒定變體多核苷酸(Mullis et al, Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser)。通常，引物的多核苷酸序列，其可用來擴(kuò)增多核苷酸分子的變體(通過PCR)， 可以基于編碼相應(yīng)氨基酸序列的保守區(qū)的序列。用于鑒定變體多核苷酸的另外的方法包括使用所有、或部分的指定的多核苷酸作 為雜交探針來篩選如上所述的基因組或cDNA文庫。通常，可以使用這樣的探針，其基于編 碼相應(yīng)氨基酸序列的保守區(qū)的序列。與篩選相同于探針的序列時(shí)所用的那些雜交條件相 比，雜交條件的嚴(yán)格性也可以較弱。變體序列，包括多核苷酸和多肽變體，還可以通過上述基于計(jì)算機(jī)的方法來鑒定。此外，相關(guān)序列的組的多序列比對可以借助于CLUSTALff (Thompson, et al， Nucleic Acids Research, 22 4673~4680(1994)，http//www-igbmc.u~strasbg.fr/ Biolnfo/Clustalff/Top. html)或 T-C0FFEE(Cedric Notredame et al, J. MoI. Biol. 302 205-217(2000)))或PILEUP(其采用累進(jìn)的、成對對比)而進(jìn)行。(Feng et al.，J. Mol. Evol. 25，351 (1987))。模式識別應(yīng)用軟件可用來發(fā)現(xiàn)基序或標(biāo)簽序列(特征序列，signature sequence)。例如，MEME (基序啟發(fā)的多 Em (Multiple Em for MotifElicitation))發(fā)現(xiàn)
25在一組序列中的基序和標(biāo)簽序列，以及MAST (基序比對和搜索工具(Motif Alignment and Search Tool))使用這些基序以在查詢序列中鑒定類似或相同基序。MAST結(jié)果提供為一系 列的與所發(fā)現(xiàn)的基序的適當(dāng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和可視概觀的序列比對。MEME和MAST由加利福尼亞 大學(xué)(圣迭哥)開發(fā)。PROSITE(Bairoch et al. , Nucleic Acids Res. 22，3583(1994) ；Hofmann et al, Nucleic Acids Res. 27，215 (1999))是鑒定由基因組或cDNA序列翻譯的未識別蛋白的功 能的方法。PROSITE數(shù)據(jù)庫(www, expasy. org/prosite)包含生物學(xué)上重要的模式和線譜 (profiles)并且被加以設(shè)計(jì)，以致它可以和適當(dāng)?shù)挠?jì)算工具一起用來將新序列指定給已知 家族的蛋白質(zhì)，或確定哪個(哪些)已知結(jié)構(gòu)域存在于序列中(Falquet et al, Nucleic Acids Res. 30,235(2002))。Prosearch (蛋白搜索)是一種工具，該工具可以搜索具有給 定序列模式或特征的SWISS-PR0T和EMBL數(shù)據(jù)庫。可以按照它們與在相同基因組(旁系同源物)或不同基因組(直系同源物)中的 其它蛋白質(zhì)的序列相關(guān)性來對蛋白質(zhì)進(jìn)行分類。直系同源基因(orthologous)是這樣的基 因，其通過物種形成而由共同的祖先基因進(jìn)化得到并且在它們進(jìn)化時(shí)通常保留相同功能。 旁系同源基因(paralogous)是這樣的基因，其被復(fù)制在基因組中并且基因可以獲得新特 異性或改變的功能，其可以與最初的特異性和功能有關(guān)。在Tatusov et al, Science 278， 631-637，1997中述評了種系發(fā)育分析方法。如上所述，本發(fā)明還涉及由本發(fā)明的核酸分子編碼的GRN-SP多肽，并且包括這些 多肽的變體和片段。除上述計(jì)算機(jī)/數(shù)據(jù)庫方法以外，還可以通過物理方法來鑒定多肽變體，例如 通過使用相對于本發(fā)明的多肽產(chǎn)生的抗體來篩查表達(dá)文庫(Sambrook et al, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987),通過同樣由 Sambrook等描述的重組DNA技術(shù)，或通過在上述抗體的幫助下鑒定來自天然來源的多肽。多肽(包括變體多肽)的制備可以利用本領(lǐng)域眾所周知的肽合成方法如使用固相 技術(shù)的直接肽合成(例如 Merrifield，1963，in J.Am Chem. Soc. 85,2149 ；Stewart et al, 1969, in Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco California ； Matteucci et al. J. Am. Chem. Soc. 103 :3185-3191,1981, L^l^Atherton et al. , in Solid Phase Peptide Synthesis -.a practical approach,. IRL press (1989)) il^ft.'pfj^ M 如利用來自Applied Biosystems (California, USA)的合成儀。還可以利用合成方法來產(chǎn) 生多肽的突變形式，如編碼氨基酸序列的DNA的位點(diǎn)特異性誘變，如由Adelmen et al ；DNA 2，183(1983)所描述的。還參見 Protein Protocols Handbook ；Walker, J. Humana Press 2002。在一種實(shí)施方式中，分離了本文中的多肽以及變體多肽。它們可以分離或純化 自天然來源，其中利用本領(lǐng)域眾所周知的各種技術(shù)(例如Deutscher，1990，Ed, Methods in Enzymology, Vol. 182, Guide to Protein Purification,以及 Protein Protocols Handbook,上文)。這些技術(shù)包括但不限于HPLC、離子交換色譜、以及免疫色譜?？商鎿Q地，多肽和變體多肽可以重組表達(dá)在適宜的宿主細(xì)胞中并分離自細(xì)胞(如 下文所述)。多肽和變體可用于產(chǎn)生抗體，以及在其它用途中產(chǎn)生配體。本文描述的基因構(gòu)建體可以包含一種或多種所披露的多核苷酸序列和/或本發(fā)明的編碼所披露的多肽的多核苷酸，并且可以用于轉(zhuǎn)化，例如，細(xì)菌、真菌、昆蟲、哺乳動物 或植物生物體。本發(fā)明的基因構(gòu)建體旨在包括如本文所定義的表達(dá)構(gòu)建體。包括有載體 (如 pBR322、pUC18、pU19、Mp 18、Mp 19、ColEl、PCRl 以及 pKRC)，噬菌體(如 λ gtlO)，以及 M13 質(zhì)粒(如 pBR322、pACYC184、pT127、RP4、plJ101、SV40 以及 BPV)，粘粒，YACS，BAC 穿梭 載體如pSA3，PAT28轉(zhuǎn)座子(如在US 5，792，294中所描述的)等。構(gòu)建體可以方便地包括選擇基因或選擇性標(biāo)記。通常使用抗生素抗性標(biāo)記如氨芐 青霉素、氨甲蝶呤、或四環(huán)素?？捎糜跇?gòu)建體中的啟動子包括β -內(nèi)酰胺酶、堿性磷酸酶、色氨酸、以及tac啟動 子體系，其是本領(lǐng)域中眾所周知的。酵母啟動子包括但不限于3-磷酸甘油酸激酶、烯醇化 酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、葡糖激酶、以及甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶。增強(qiáng)子還可以用來作用于啟動子以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。用于本文的適宜的增強(qiáng)子包括SV40 增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒(cytomeglovirus)早期啟動子增強(qiáng)子、珠蛋白、白蛋白、胰島素等。關(guān)于構(gòu)建體、啟動子、增強(qiáng)子、以及宿主細(xì)胞的一般性討論，參見Principles of Gene Manipulation and Genomics ；Primrose, S et al. , Blackwell Publishing 2006, Ed. 7.,以及 From Genes to Genomes :Concepts and Applications of DNA Technology, Dale, J et al. , Wiley-Interscience, 2007, Ed. 2。用于產(chǎn)生和使用基因構(gòu)建體和載體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的并且一般性描 述在 Sambrook et al.(上文)、以及 Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing，1987中。用于用載體轉(zhuǎn)化所選擇的宿主細(xì)胞的方法也是已 知的，例如，由Cohen, SN ；PNAS 69，2110，1972描述的氯化鈣處理。包含所描述的基因構(gòu)建體和載體的宿主細(xì)胞可以源自原核或真核來源，例如酵 母、細(xì)菌、真菌、昆蟲(例如桿狀病毒)、動物，哺乳動物或植物生物體。在一種實(shí)施方式 中，宿主細(xì)胞是分離的宿主細(xì)胞。最常用作宿主細(xì)胞的原核細(xì)胞是大腸桿菌的菌株。其 它原核宿主包括但不限于假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏 菌屬(Serratia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、鏈霉菌屬(Str印tomyces)、李斯特氏 菌屬(Listeria)、酵解屬(Sachharomyces)、沙門菌屬(Salmonella)以及分枝桿菌屬 (Mycobasteria)。用于表達(dá)重組蛋白的真核細(xì)胞包括但不限于Vero細(xì)胞、HeLa、CH0(中國倉鼠卵巢 細(xì)胞)、293、BHK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、COS細(xì)胞，以及前列腺癌細(xì)胞系如PrEC、LNCaP、Du 145以 及RWPE-2。這些細(xì)胞可獲自ATCC (維吉尼亞，USA)。與本發(fā)明的核酸分子的表達(dá)相容的原核啟動子包括本領(lǐng)域已知的組成型啟動子 (如λ噬菌體的int啟動子和pBR322的β -內(nèi)酰胺酶基因序列的bla啟動子)和可調(diào)節(jié) 啟動子(如lacZ、reCA以及gal)。為了表達(dá)，還可能需要在編碼序列上游的核糖體結(jié)合位
點(diǎn)ο包含基因構(gòu)建體如表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞可用于重組生產(chǎn)多肽的方法。這樣的方 法在本領(lǐng)域是眾所周知的(參見例如Sambrooket al，上文)。這些方法通常涉及在適當(dāng)介 質(zhì)中并在適合于或有利于本發(fā)明的多肽的表達(dá)和選擇的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞?？梢粤硗庠?適合于選擇宿主細(xì)胞(表達(dá)本發(fā)明的多肽)的介質(zhì)中生長包含選擇性標(biāo)記的細(xì)胞。在適合 于表達(dá)多肽的條件下，選擇和培養(yǎng)表達(dá)本發(fā)明的多肽的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。利用本領(lǐng)域眾所周知的方法，表達(dá)的重組多肽可以分離和純化自培養(yǎng)基，上述方法包括硫酸銨沉淀、離子交換 色譜、凝膠過濾、親和色譜、電泳等 G^i^nDeutscher，Ed，1990，Methods in Enzymology, Vol 182，Guide to Protein Purification)。宿主細(xì)胞還可以用于這樣的方法，這些方法用于 生產(chǎn)由本發(fā)明的表達(dá)的多肽產(chǎn)生的產(chǎn)物。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于在對象中預(yù)測、診斷或監(jiān)測急性心臟疾病(ACD) 的方法，該方法包括測量在獲自或源自對象的生物樣品中GRN-SP生物標(biāo)記物的水平并比較所述 GRN-SP的水平和來自對照或參考值或參考范圍的GRN-SP生物標(biāo)記物水平，其中高于對照 或參考水平的GRN-SP生物標(biāo)記物的測量水平指示A⑶。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于在對象中監(jiān)測對急性心臟疾病(ACD)的治療的 響應(yīng)的方法，該方法包括測量在來自對象的生物樣品中GRN-SP生物標(biāo)記物的水平并比較 所述GRN-SP生物標(biāo)記物的水平和來自對照、參考、或參考范圍的GRN-SP水平，其中GRN-SP 生物標(biāo)記物的測量水平相比于對照或參考水平的變化指示響應(yīng)于治療。本領(lǐng)域已知，BNP前體如 BNP27-102 前體(proBNP27_102)、BNP27-47 前體 (proBNP27-47)可以用于預(yù)測或診斷心臟移植排斥反應(yīng)(印isode)以及用來區(qū)分呼吸困難 (呼吸短促)的肺原因和心血管原因。參見US 2005/0244902。設(shè)想，GRN-SP可以用作心 臟移植排斥的早期標(biāo)記物(基于心臟組織分析)，以及用來區(qū)分肺疾病和急性心臟疾病。因此，本發(fā)明還提供了用于在對象中預(yù)測、診斷或監(jiān)測心臟移植排斥反應(yīng)的方法， 該方法包括測量在心臟移植以后在來自對象的生物樣品中GRN-SP生物標(biāo)記物的水平并比 較所述GRN-SP生物標(biāo)記物的水平和來自對照、參考或參考范圍的GRN-SP水平，其中高于對 照或參考水平的GRN-SP生物標(biāo)記物的測量水平指示移植排斥。本發(fā)明還提供了用于在對象中區(qū)別肺疾病和急性心臟疾病(ACD)的方法，該方法 包括測量在來自對象的生物樣品中GRN-SP生物標(biāo)記物的水平，然后比較所述GRN-SP生物 標(biāo)記物的水平與來自對照、或參考或參考范圍的GRN-SP生物標(biāo)記物水平，其中高于對照或 參考水平的GRN-SP生物標(biāo)記物的測量水平指示A⑶。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于在對象中預(yù)測、診斷或監(jiān)測急性心臟疾病 (ACD)、心臟移植排斥、或ACD/肺疾病的方法，該方法包括在ACD、心臟移植排斥或ACD/肺疾 病的發(fā)作或臨床表現(xiàn)的最初約2小時(shí)內(nèi)測量在來自對象的生物樣品中GRN-SP生物標(biāo)記物 的水平。對GRN-SP生物標(biāo)記物的測量水平和來自對照、參考或參考范圍的GRN-SP生物標(biāo) 記物水平進(jìn)行比較，其中高于對照或參考水平的GRN-SP生物標(biāo)記物的測量水平指示ACD或 移植排斥。技術(shù)性讀者將明了，為了評估的目的，GRN-SP生物標(biāo)記物水平將通常與參考值或 范圍或?qū)φ罩迪嚓P(guān)。如在本文中所使用的，對照可以是個體或組，從其獲得GRN-SP生物標(biāo)記物樣品并 確定平均GRN-SP生物標(biāo)記物水平。通常，個體或組將包括正常健康個體或不知道患有待 監(jiān)測的生物事件的個體組，如葡萄糖代謝障礙、糖尿病、A⑶(包括心臟移植排斥)、或AOT/ 肺疾病。在大多數(shù)個體中GRN-SP生物標(biāo)記物水平為35-50pmol/L，并且平均對照水平為約 43pmol/L?？商鎿Q地，可以基于來自先前測試個體或組的多個讀數(shù)來評估對照水平。
對照水平的另一個實(shí)例是在心臟組織或來自糖尿病或肥胖個體或患有葡萄糖代 謝障礙的個體的組織中在GRN-SP生物標(biāo)記物和饑餓素水平之間的比例量度(ratiometric measure)?？梢员容^對象的GRN-SP生物標(biāo)記物水平和對照群體的平均GRN-SP生物標(biāo)記物 水平。在心臟組織對照群體中的GRN-SP水平可以為正常對照群體中GRN-SP水平的約1. 5 至5、通常約2至3或約2. 5至3倍(或更多倍)。和正常對照群體中的GRN-SP水平相比， 在糖尿病對象、或葡萄糖代謝障礙對照群體中的GRN-SP水平可以為約2倍更高或更低31。可替換地，對照可以是在較早時(shí)間獲自相同對象的一個或多個讀數(shù)或上述讀數(shù)的 平均值。為特定方法確定適當(dāng)?shù)膶φ蘸蛯φ账绞潜绢I(lǐng)域眾所周知的。應(yīng)當(dāng)明了，測量樣品中GRN-SP生物標(biāo)記物水平的步驟可以是對單一樣品的單次 測量、或?qū)θ舾蓸悠返闹貜?fù)測量，這取決于待研究的生物事件。在ACD的情況下，測量可以 包括，例如，在不同時(shí)間，對獲自或源自對象的樣品，進(jìn)行GRN-SP生物標(biāo)記物的1至20次測 量、1至10次、1至5次、1至3次、1或2次、或2或3次測量。在一種實(shí)施方式中，在疾病 發(fā)作或臨床表現(xiàn)的約最初6、5、4、3、2小時(shí)內(nèi)、或在1小時(shí)內(nèi)，進(jìn)行測量。還可以在以上采樣 周期之外進(jìn)行單次或重復(fù)測量，以確定和正常對照水平、或心臟組織對照水平、或有關(guān)參考 水平或范圍相比，GRN-SP水平生物標(biāo)記物是否已升高或降低。在一種實(shí)施方式中，該方法包括測量在發(fā)作或表現(xiàn)的約最初1小時(shí)內(nèi)獲得的1或 2個樣品中的GRN-SP生物標(biāo)記物水平，接著測量在發(fā)作或表現(xiàn)、或初始測量GRN-SP水平的 約2至約4小時(shí)、或約2至約3小時(shí)內(nèi)獲得的1或2個樣品中的GRN-SP生物標(biāo)記物水平。如上所述，在發(fā)作或表現(xiàn)的最初6、4、或2小時(shí)內(nèi)測得的GRN-SP水平可以為在正常 對照中測得的GRN-SP生物標(biāo)記物水平的1. 5至5倍、通常2至3倍。在另一種實(shí)施方式中，在樣品中，約65至約250pmol/L、約65至約200pmol/L、約 70至約150pmol/L、或約70至約130pmol/L范圍內(nèi)的GRN-SP生物標(biāo)記物的水平指示ACD、 心臟移植排斥，或用來區(qū)分ACD和肺疾病。在生物事件或障礙如糖尿病、或葡萄糖代謝障礙的情況下，例如，測量可以包括多 次計(jì)算并連同確定的臨床評估，如經(jīng)常用于胰島素。如上述所定義的生物樣品可以是任何生物材料，其中可以定位(locate)或分泌 GRN-SP生物標(biāo)記物。在一種實(shí)施方式中，生物樣品是循環(huán)生物樣品，例如血液、血清或血漿。 在一種實(shí)施方式中，生物樣品是心臟組織。核酸測定可以按照本領(lǐng)域已知方法來確定在樣品中GRN-SP的存在以及其表達(dá)水平，如 Southern印跡法、Northern印跡法、FISH或定量PCR(用來量化mRNA的轉(zhuǎn)錄)[(Thomas， Proc. Nat, Acad. Sci. USA77 :5201_52051980)，(Jain KK, Med Device Technol. 2004May ； 15(4) :14-7)]、斑點(diǎn)印跡(DNA分析)或原位雜交，其中利用適當(dāng)標(biāo)記的探針并基于本文提 供的序列。因此，本發(fā)明還提供了用于在樣品中檢測本發(fā)明的核酸分子的存在的測定方法， 該方法包括(a)使樣品接觸多核苷酸探針，該探針在嚴(yán)格雜交條件下雜交于核酸序列；以及(b)檢測樣品中雜交復(fù)合體的存在。在一種實(shí)施方式中，核酸分子是SEQ ID NO 18或它們的變體或片段。
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在一種實(shí)施方式中，雜交探針是標(biāo)記探針。標(biāo)記的實(shí)例包括熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo) 記、放射酶標(biāo)記以及生物素_親和素標(biāo)記。按照本領(lǐng)域已知的方法如上述那些方法來進(jìn)行 標(biāo)記探針的標(biāo)記和可視化(顯現(xiàn)，visulisation)。為方便起見，可以將核酸探針固定于固體載體上，其中固體載體包括但不限于樹 脂(如聚丙烯酰胺)、碳水化合物(如瓊脂糖)、塑料(如聚碳酸酯)、以及乳膠珠粒。正如上面所討論的，核酸分子探針可以優(yōu)選為RNA、cDNA或DNA分子。在一種實(shí)施 方式中，探針是、或包括SEQ ID NO: 18。嚴(yán)格雜交條件是如上面所討論的。可以利用已知技術(shù)如RT-PCR和電泳技術(shù)(包括SDS-PAGE)來確定核酸標(biāo)記物的 表達(dá)水平。利用這些技術(shù)，可以擴(kuò)增在對象樣品中的本發(fā)明的核酸分子的DNA或cDNA序列， 以及測量DNA或cDNA或RNA的水平。在一種可替換的方法中，可以直接在樣品中而沒有擴(kuò)增的情況下測量DNA、cDNA 或RNA水平。在一種實(shí)施方式中，該方法是Northern印跡雜交分析?？梢曰诒疚蔫b定的 GRN-SP生物標(biāo)記物序列來制備用于Northern印跡雜交分析的探針。在一種實(shí)施方式中，探 針包括參考序列的至少10、12、15、18、21、24、27、30、36、42、51、60、63、66或69或更多連續(xù)
核苷酸?？商鎿Q地，可以利用基于逆轉(zhuǎn)錄的PCR(RT-PCR)測定并利用對于核酸序列具有特 異性的引物來測量表達(dá)水平。如果需要的話，可以相對于對照核酸分子來比較樣品中NS-SP 生物標(biāo)記物多核苷酸的水平，其中對照核酸分子的表達(dá)與待測量的參數(shù)或條件無關(guān)。對照 核酸分子是指一種分子，其中在疾病或移植排斥狀態(tài)和健康狀態(tài)之間水平并沒有差異。對 照分子的水平可以用來歸一化在比較群體中的水平。這樣的對照分子的實(shí)例是GAP-DH。本 發(fā)明的GRN-SP生物標(biāo)記物多核苷酸的水平將隨著生物事件或障礙而變化。肽測定在一種實(shí)施方式中，測量步驟包括檢測GRN-SP生物標(biāo)記物和結(jié)合劑之間的結(jié)合， 其中結(jié)合劑結(jié)合(包括選擇性地或特異性地結(jié)合)GRN-SP或其片段或變體。作為測量的預(yù) 先步驟，可以使GRN-SP生物標(biāo)記物多肽結(jié)合于結(jié)合劑，該結(jié)合劑結(jié)合GRN-SP或其片段或變 體。因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于測定生物樣品的GRN-SP生物標(biāo)記物 的方法，該測定方法包括利用任何已知方法來檢測和測量在樣品中的GRN-SP生物標(biāo)記物 的水平。在一種實(shí)施方式中，生物樣品是在A⑶、心臟移植排斥、或AOT/肺疾病發(fā)作的6或 4小時(shí)內(nèi)、或在ACD、心臟移植排斥、或ACD/肺疾病的臨床表現(xiàn)的6或4小時(shí)內(nèi)獲自對象。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于測定GRN-SP生物標(biāo)記物的方法，該方法包 括(a)結(jié)合來自生物樣品的一種或多種GRN-SP生物標(biāo)記物多肽；以及(b)測量結(jié)合GRN-SP生物標(biāo)記物多肽的水平。在一種實(shí)施方式中，GRN-SP生物標(biāo)記物多肽選自組GRN-SP1-9 (SEQ ID NO 17)或 其變體或片段。應(yīng)當(dāng)明了，在一種實(shí)施方式中，在測定中可以結(jié)合多于一種類型的GRN-SP多月太，例如 GRN-SP1-9 和 GRN-SP1-23。在一種實(shí)施方式中，利用結(jié)合劑來結(jié)合GRN-SP生物標(biāo)記物多肽。上述結(jié)合劑是選 擇性(特異性)結(jié)合劑。即，它與生物事件的其它標(biāo)記物，并且更具體地說饑餓素，具有低 交叉反應(yīng)性。在一種實(shí)施方式中，結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段。在抗體用于測定的情 況下，可以相對于GRN-SP生物標(biāo)記物的任何抗原部分來產(chǎn)生(raise)抗體，包括在N端或 C 端。在一種實(shí)施方式中，相對于 GRN-SP (1-23) SEQ ID NO 15 ；GRN-SP (1-9) SEQ ID NO 17 或由本發(fā)明的核苷酸序列編碼的氨基酸序列來產(chǎn)生抗體；或它們的變體或片段。本發(fā)明還涉及上述結(jié)合劑、抗體、抗體的抗原結(jié)合片段、以及它們的應(yīng)用。應(yīng)用包 括在測定中的應(yīng)用，或在制造GRN-SP生物標(biāo)記物的測定、預(yù)后、診斷或監(jiān)測工具中的應(yīng)用。 上述測定或工具可以用來監(jiān)測對象中的生物事件或障礙，其包括葡萄糖代謝障礙、糖尿病 以及ACD。抗體可以具有分離或純化形式。結(jié)合于GRN-SP或其片段或變體的抗體可以具有 任何形式，包括所有類型的多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、單鏈抗體、人抗體、人 源化抗體以及嵌合抗體(通過基因重組產(chǎn)生)。還包括通過用GRN-SP或其片段或變體來 免疫動物如小鼠、大鼠或兔而獲得的抗血清?？贵w可以結(jié)合于在一組GRN-SP片段中的共同 GRN-SP序列，或結(jié)合于特異性GRN-SP片段，或甚至結(jié)合于GRN-SP片段的組。本文中還可以使用抗體或修飾抗體的片段，只要它結(jié)合BNP-SP或其片段或變體。 抗原結(jié)合片段可以是Fab、F(ab' )、F(ab' )、Fc或Fv片段或單鏈Fv(scFv)，其中通過 適當(dāng)?shù)慕宇^連接來自H和L鏈的Fv片段(Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83(1988))。抗體的〃 Fe"部分是指免疫球蛋白重鏈的一部分，其包含一個或多個重 鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域、CHI、CH2以及CH3，但并不包括重鏈可變區(qū)?？贵w的"Fv"部分是包含完全抗原識別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該區(qū)由 緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個重鏈和一個輕鏈可變域的二聚體構(gòu)成。Fab片段包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHI)。Fab'片段具有加入CHI 域的Fab羧基末端的幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。F(ab' )2片 段表示其間具有半胱氨酸鉸鏈并已被分開的成對的Fab'片段。F(ab' )2片段具有兩個抗 原結(jié)合位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^抗體的木瓜蛋白酶消化來產(chǎn)生Fab片段。關(guān)于抗體和片段的討論，參見例如PNAS USA 81 :6851_6855 (1984)，Protein Eng 8(10) 1057-1062(1995) ；The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Springer-verlag 1994，Rosenburg and Moore Eds ；PNAS USA 90 =6444-6448(1993)； Nature 321:522-525(1986) ；Nature 332 :323_329 (1988)，以及 WO 2005/003154。用于制備、檢測、修飾以及分離抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的(參見列如 Maintaining and using Antibodies :A Practical Handbook, Howard, G et al. , CRC Press 2006 ；Protein-protein Interactions :A Molecular Cloning Manual, Golemis E (Ed), CSHL Press, 2002 ；Harlow and Lane (1998,11 Milstein18，Suresh19，以及Brennan20)。 在一種實(shí)施方式中，通過免疫適宜的宿主哺乳動物來產(chǎn)生所使用的抗體。包含GRN-SP生物 標(biāo)記物的融合蛋白也可以用作免疫原?？梢酝ㄟ^與各種分子的結(jié)合來修飾抗體，如聚乙二醇(PEG)、生物素、鏈霉親合素、 化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、熒光標(biāo)記、量熱標(biāo)記、以及放射免疫標(biāo)記(如本文討論的)?？梢酝ㄟ^化學(xué)修飾抗體來獲得修飾抗體。這些修飾方法是本領(lǐng)域中的常規(guī)方法。可替換地，抗體可以獲得為嵌合抗體，在源自非人抗體的可變區(qū)和源自人抗體的 恒定區(qū)之間，或獲得為人源化抗體，其包含源自非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、源自人抗體 的框架區(qū)(FR)、以及恒定區(qū)?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知方法來制備上述抗體16’17’22。簡而言之，制備多克隆抗體的方法是技術(shù)人員已知的?？梢栽诓溉閯游镏挟a(chǎn)生多 克隆抗體，例如，通過一次或多次注射免疫劑以及，如果需要的話，佐劑。通常，將通過多 次皮下或腹膜內(nèi)注射在哺乳動物中注射免疫劑和/或佐劑。免疫劑可以包括GRN-SP或 其片段或變體或其融合蛋白?？梢杂欣氖?，在要免疫的哺乳動物中，將免疫劑結(jié)合于已 知為免疫原性的蛋白。上述免疫原性蛋白的實(shí)例包括但不限于鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、牛血清白蛋白、牛甲狀球蛋白、以及大豆胰蛋白酶抑制劑?？梢圆捎?的佐劑的實(shí)例包括弗氏完全佐劑和MPL TDM佐劑(單磷酰脂質(zhì)A、合成海藻糖二霉菌酸脂 (dicorynomycolate))。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以無需過度實(shí)驗(yàn)而選擇免疫方案?？梢岳帽绢I(lǐng)域眾所周知的雜交瘤方法來制備單克隆抗體。參見例如Kohler and Milstein，1975n、US 4, 196, 265,US 4, 816, 567 以及 Golemis (上文)?？梢栽谶m宜的培養(yǎng) 基中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，可替換地，雜交瘤細(xì)胞可以在哺乳動物體內(nèi)生長為腹水。優(yōu)選的永生 細(xì)胞系(immortalized cell lines)是小鼠骨髓瘤細(xì)胞系，其可以獲自，例如，美國典型培 養(yǎng)物庫(American Type Culture Collection)(維吉尼亞，USA)。免疫測定可以用來篩選 分泌感興趣抗體的永生細(xì)胞系。在篩選中可以使用GRN-SP或其片段或變體的序列。因此，本文還設(shè)想雜交瘤，其是能夠分泌GRN-SP特異性單克隆抗體的永生細(xì)胞 系。用于確定由雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性的眾所周知的方式包 括免疫沉淀、放射性連接免疫測定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)以及Western印跡。 (Lutz et al.，Exp. Cell. Res. 175 109-124 (1988)、Golemis (上文)、以及Howard(上文))。 例如，單克隆抗體的結(jié)合親和力可以，例如，通過在Munson et al.，Anal Biochem 107 220(1980)中描述的斯卡查德分析法來確定。對于來自免疫動物的樣品，可以類似地篩查多 克隆抗體的存在。單克隆抗體還可以獲自重組宿主細(xì)胞。編碼抗體的DNA可以獲自雜交瘤細(xì)胞 系。然后將DNA置于表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞(例如，COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、大腸桿菌 (E. coli)細(xì)胞)以及在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體。然后可以利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來分離和/或純化 抗體。還可以使用用于單克隆抗體生產(chǎn)的其它已知技術(shù)如從噬菌體文庫生產(chǎn)。參見例 如，Nature 352 :624_628 (1991)。為了方便檢測，本文的抗體和片段可以標(biāo)記有可檢測標(biāo)記如熒光化合物、生物發(fā) 光化合物、以及化學(xué)發(fā)光化合物，以及放射性同位素、磁珠和親和標(biāo)記(例如生物素和親和 素)。允許間接測量結(jié)合的標(biāo)記的實(shí)例包括酶，其中底物可以提供有色熒光產(chǎn)物，適宜的酶 包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、蘋果酸脫氫酶等?？梢赃B同熒光激活細(xì)胞分選儀一起使 用熒光色素(例如得克薩斯紅、熒光素、藻膽蛋白、以及藻紅蛋白)。標(biāo)記技術(shù)在本領(lǐng)域是眾 所周知的。通過常規(guī)的免疫球蛋白純化程序如，例如，反相HPLC、蛋白質(zhì)A-瓊脂糖、羥基磷
32灰石色譜、凝膠電泳、透析、或親和色譜，可以從培養(yǎng)基或腹水流體分離或純化由細(xì)胞分泌 的單克隆抗體° 參見例如，Scopes, Protein Purification Principles and Practice, Springer-Verlag, NY(1982)。還可以通過重組DNA方式來產(chǎn)生單克隆抗體或片段(參見例如美國專利號 4，816，567)。DNA修飾如人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列替代來代替同源鼠序列(以上美 國專利號4，816，567)也是可能的?？贵w可以是單價(jià)抗體。用于制備單價(jià)抗體的方法在本 領(lǐng)域是眾所周知的(美國專利號5，334，708、5，821，047、以及7，476，724)。本文還設(shè)想(US 6,020, 153)嵌合(US 4，816，567)、雙價(jià)抗體(US 5，843，708)以及多價(jià)抗體的生產(chǎn)。嵌合單克隆抗體是這樣的抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分相同于或同源于源 自特定物種或?qū)儆谔囟贵w(亞)類的抗體中的相應(yīng)序列。鏈的剩余部分相同于或同源于 源自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w(亞)類的抗體中的相應(yīng)序列、以及其片段，只要它們呈現(xiàn)所 需的生物活性。(參見US 4，816，567上文)。本發(fā)明的抗體可以進(jìn)一步包括人源化抗體或人抗體。人源化抗體包括人免疫球蛋 白，其中來自受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被來自非人物種的CDR的殘基取代。由非人 來源如兔、大鼠以及小鼠生產(chǎn)人源化抗體是眾所周知的13’14’15。還可以利用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)來產(chǎn)生人抗體，包括噬菌體展示文庫16 ；以及 轉(zhuǎn)基因方法，參見，例如 Neuberger 199617 ；以及 Vaughan et al，199818。雙特異性抗體也可以是有用的。這些抗體是單克隆抗體，優(yōu)選人抗體或人源化抗 體，其對于至少兩種不同的抗原具有結(jié)合特異性。例如GRN-SP或其變體或片段，以及抗原， 該抗原選自包括前饑餓素原、ANP、ANP-SP、BNP、CK-MB, TnT、TnI、BNP、BNP-SP、NT-BNPjjUl 蛋白、LDH、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、H-FABP、缺血修飾白蛋白、內(nèi)皮素、腎上腺髓質(zhì)素、腎素以及血 管緊張素II的組。本文還設(shè)想具有多于兩種特異性的抗體例如三特異性抗體。用于制備雙特異性抗體的方法在本領(lǐng)域是已知的。參見例如Milstein and Cuello 198319、Suresh et al，19862 以及 Brennan et al.，198521。由抗體結(jié)合或選擇性地結(jié)合的GRN-SP生物標(biāo)記物是GRN-SP或其變體或片段(正 如上面所討論的)。在一種實(shí)施方式中，抗體結(jié)合GRN-SP的N端(1_9)。結(jié)合劑選擇性地結(jié)合的特異 性抗原肽的實(shí)例包括GRN-SP (1-9) (SEQ ID NO 17)。可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式來檢測GRN-SP生物標(biāo)記物的結(jié)合，包括特異的 (基于抗體)和非特異的(如HPLC固相)。最常見地，利用測定方法如ELISA或RIA(如上 所述)來檢測本文的抗體。競爭性結(jié)合測定、夾心測定、非競爭性測定、熒光免疫測定法、 免疫熒光測定試驗(yàn)、或免疫放射測定試驗(yàn)、發(fā)光測定、化學(xué)發(fā)光測定以及質(zhì)譜分析如表面增 強(qiáng)激光解吸和電離(SELDI)、電噴霧電離(ESI)、基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)、傅立葉變 換離子回旋共振質(zhì)譜(FTICR)，單獨(dú)或連同非特異性結(jié)合劑，如色譜形式(chromatography format)，也是可行的。參見例如，Golemis, E以及Howard G.(上文)。方便地，可以將抗體固定于固態(tài)底物以方便GRN-SP/抗體復(fù)合物的洗滌和 分離。利用本領(lǐng)域已知技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)抗體與固體載體的結(jié)合。參見例如Handbook of Experimental Immunology,4th edition， Blackwell Scientific Publications， 0xfOrd(1986)。用于抗體的有用固態(tài)底物包括玻璃、尼龍、紙以及塑料。類似地，可以將
33GRN-SP吸附于固態(tài)底物如吸附性二氧化硅、或樹脂顆粒、或硅片，其可選地涂布或衍化有 (derivatise)離子交換、反相(例如C18涂層)或其它材料。底物可以具有珠粒、平板、 管、棒或生物芯片的形式。生物芯片的實(shí)例包括Ciphergen，ProteinChip陣列(Ciphergen Biosystems(CAUSA))、以及可獲自 Perkin Elmer，USA 的 Packard BioChip。還參見 US 6, 225, 047,US 6，329，209。生物芯片可以包括色譜表面。具有可尋址位置的生物芯片或平 板(plates)以及分立的(discreet)微量滴定板是特別有用的。此外優(yōu)選使用的是多重系 統(tǒng)，其中包含針對多種分析物的抗體的珠粒用來測量單一樣品中的分析物水平。待測量的 分析物可以包括其它心臟標(biāo)記物以及GRN-SP或其變體或片段。本文使用的適宜的多重珠 粒系統(tǒng)的一個實(shí)例是 Luminex Flurokine Multianalyte Profiling 系統(tǒng)?？贵w測定方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，參見例如US 5，221，685、US 5，310, 687、 US 5, 480, 792,US 5, 525, 524,US 5, 679, 526,US5, 824, 799,US 5, 851, 776,US 5,885,527、 US 5, 922, 615,US 5, 939, 272,US 5, 647, 124,US 5, 985, 579,US 6, 019, 944,US 6113,855、 US6, 143，576 和 US 5，955，377 (關(guān)于未標(biāo)記測定)、以及 US 5，631，171，還參見 Zola， Monoclonal Antibodies :A Manual of Techniques ppl47_158(CRC Press, Inc 1987), Harlow and Lane(1998)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Publications, New York，以及US 2005/0064511 (關(guān)于測定形式和條件的描述)。所有上 述參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。免疫測定分析儀也是眾所周知的并且除其它很好描述的系統(tǒng)22以外還包括 Beckman Access、Abbott AxSym、Roche ElecSys 以及 Dade Behring Status 系統(tǒng)?？梢灾苯踊蜷g接檢測GRN-SP生物標(biāo)記物和抗體結(jié)合形成復(fù)合物。利用標(biāo)記如熒 光、發(fā)光、放射性核素、金屬、染料等來進(jìn)行直接檢測。間接檢測包括結(jié)合可檢測標(biāo)記如地高 辛或酶如辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶以形成標(biāo)記抗體，接著為通過添加檢測試劑來檢測 標(biāo)記的步驟。辣根過氧化物酶(例如)可以用底物，如，鄰苯二胺二鹽酸鹽(OPD)和過氧化物 溫育而產(chǎn)生可以測量其吸光度的有色產(chǎn)物，或用魯米諾和過氧化物加以溫育而產(chǎn)生化學(xué)發(fā) 光，其可以用光度計(jì)加以測量(如在本領(lǐng)域中已知的)。生物素或地高辛可與強(qiáng)烈結(jié)合于它 們的結(jié)合劑進(jìn)行反應(yīng)。例如，蛋白質(zhì)親和素和鏈霉親合素將強(qiáng)烈結(jié)合于生物素。然后另一 種可測量的標(biāo)記與其共價(jià)結(jié)合或連接，其中通過與蛋白質(zhì)的直接反應(yīng)、或通過使用通?？?獲得的交聯(lián)劑如MCS和碳二亞胺、或通過添加螯合劑結(jié)合或連接。通常，復(fù)合物分離自未復(fù)合試劑，例如通過離心。如果抗體被標(biāo)記，則復(fù)合物的量 將由所檢測的標(biāo)記的量來反映。可替換地，可以通過結(jié)合于抗體來標(biāo)記GRN-SP生物標(biāo)記 物，然后在競爭性測定中通過測量當(dāng)用包含未標(biāo)記GRN-SP生物標(biāo)記物的生物樣品溫育抗 體標(biāo)記GRN-SP生物標(biāo)記物時(shí)所結(jié)合的標(biāo)記GRN-SP生物標(biāo)記物的減少來檢測GRN-SP生物 標(biāo)記物。可以使用其它免疫測定例如夾心測定。在一種實(shí)施方式中，與抗體接觸以后，通常在4°C下過夜18至25小時(shí)、或在25°C 至40°C下1至2至4小時(shí)，將結(jié)合于結(jié)合劑(抗體)的標(biāo)記GRN-SP生物標(biāo)記物與未結(jié)合的 標(biāo)記GRN-SP生物標(biāo)記物分離。在溶液相測定中，可以通過添加結(jié)合于固相顆粒如纖維素、 或磁性材料的抗Y球蛋白抗體(二抗)來完成分離。二抗(secondary antibody)在不同 于用于產(chǎn)生一抗的物種中產(chǎn)生并結(jié)合一抗(primary antibody)。因此，經(jīng)由二抗，所有一抗結(jié)合于固相。通過離心或磁吸引從溶液移除這種復(fù)合物，然后利用結(jié)合于它的標(biāo)記來測量 所結(jié)合的標(biāo)記肽。用于分離與自由標(biāo)記結(jié)合的其它可選方法包括形成免疫復(fù)合物(其沉淀 自溶液)，通過聚乙二醇沉淀抗體，或?qū)⒆杂蓸?biāo)記的肽結(jié)合于活性炭并通過離心或過濾從溶 液除去。通過適當(dāng)方法(如上述那些方法)來測量在分離的結(jié)合或自由相中的標(biāo)記。競爭性結(jié)合測定還可以設(shè)計(jì)為固相測定，其更易于進(jìn)行，因而優(yōu)于上述那些方法。 這種類型的測定使用具有孔的平板(通常稱作ELISA或免疫測定平板)、固體珠粒或管表 面。一抗被吸附或共價(jià)結(jié)合于平板、珠?；蚬艿谋砻妫蛲ㄟ^吸附或共價(jià)結(jié)合第二抗Y球 蛋白或抗Fc區(qū)抗體被間接結(jié)合于平板。一起或順序地將樣品和標(biāo)記肽(如上述)加入平 板，然后在便于在樣品中的GRN-SP和標(biāo)記肽之間進(jìn)行抗體結(jié)合競爭的條件下加以溫育。可 以隨后吸出未結(jié)合的標(biāo)記肽并沖洗平板，從而留下附著于平板的抗體結(jié)合的標(biāo)記肽。然后 可以利用上述技術(shù)測量標(biāo)記肽。夾心型測定具有更高的特異性、速度以及更大的測量范圍。在這種類型的測定中， 借助于吸附、共價(jià)結(jié)合、或用于固相競爭結(jié)合測定的抗Fc或γ球蛋白抗體(如上所述)，將 相對于GRN-SP生物標(biāo)記物過量的一抗附著于ELISA平板的孔、珠?；蚬?。使樣品液或提取 物接觸附著于固相的抗體。由于抗體過量，所以這種結(jié)合反應(yīng)通常是快速的。還用樣品并和 一抗同時(shí)或順序地溫育相對于GRN-SP生物標(biāo)記物的二抗。選擇這種二抗以結(jié)合于GRN-SP 生物標(biāo)記物上的位點(diǎn)，該位點(diǎn)不同于一抗的結(jié)合位點(diǎn)。上述兩種抗體反應(yīng)導(dǎo)致夾層，其中來 自樣品的GRN-SP生物標(biāo)記物被夾在兩種抗體之間。二抗通常標(biāo)記有如上文詳細(xì)描述的用 于競爭性結(jié)合測定的容易測量的化合物。可替換地，可以使標(biāo)記的第三抗體(其特異性地 結(jié)合于二抗)接觸樣品。在沖走未結(jié)合材料以后，可以通過針對競爭性結(jié)合測定所概述的 方法來測量和量化結(jié)合的標(biāo)記抗體。還可以使用浸漬片型測定(dipstick type assay) 0這些測定方法在本領(lǐng)域是眾 所周知的。它們可以例如，采用較小顆粒如附著有特異性抗體的金或有色乳膠顆粒?？梢詫?待測量的液體樣品加入預(yù)加載有顆粒的膜或紙條帶的一端，并允許沿著條帶進(jìn)行遷移。樣 品中的抗原與顆粒的結(jié)合會改善顆粒結(jié)合于捕獲位點(diǎn)的能力，其中進(jìn)一步沿著條帶，上述 捕獲位點(diǎn)包含用于顆粒的結(jié)合劑，如抗原或抗體。有色顆粒在這些位點(diǎn)的累積導(dǎo)致顯色并 取決于樣品中競爭性抗原的濃度。其它浸漬片可以采用共價(jià)結(jié)合于紙或膜條帶的抗體以捕 獲樣品中的抗原。采用結(jié)合于酶如辣根過氧化物酶的二抗的隨后反應(yīng)以及用底物溫育以產(chǎn) 生顏色、熒光或化學(xué)發(fā)光輸出，將使得能夠量化樣品中的抗原。如在以下實(shí)施例中所討論的，在一種實(shí)施方式中，放射免疫測定(RIA)是所使用 的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。在一種RIA中，放射性標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原用于與抗體的競爭性結(jié)合。常 見放射性標(biāo)記包括125I、131I、3H以及14C。涉及用特異性抗體和放射性標(biāo)記抗體結(jié)合蛋白沉淀GRN-SP生物標(biāo)記物的放射免 疫測定可以測量在沉淀物中標(biāo)記抗體的量，其與樣品中GRN-SP生物標(biāo)記物的量成正比?？?替換地，產(chǎn)生了標(biāo)記的GRN-SP生物標(biāo)記物并使用未標(biāo)記的抗體結(jié)合蛋白。然后添加要測試 的生物樣品。來自標(biāo)記GRN-SP生物標(biāo)記物的計(jì)數(shù)的減少與樣品中GRN-SP生物標(biāo)記物的量 成正比。在RIA中，還可以分離結(jié)合GRN-SP生物標(biāo)記物和自由的GRN-SP生物標(biāo)記物。這 可能涉及用二抗沉淀GRN-SP生物標(biāo)記物/抗體復(fù)合物。例如，如果GRN-SP生物標(biāo)記物/抗體復(fù)合物包含兔抗體，則驢抗兔抗體可以用來沉淀復(fù)合物并計(jì)數(shù)標(biāo)記的量。例如在LKB， 伽瑪主計(jì)數(shù)器(Gammamaster counter)中。參見 Hunt et al22。本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括測量葡萄糖代謝障礙、糖尿病、腎病、心血管疾病、ACD、 心臟移植排斥、或ACD/肺疾病的一種或多種其它標(biāo)記物的水平，其不是GRN-SP生物標(biāo)記 物。可以比較其它(一種或多種)標(biāo)記物的水平和來自對照群體的平均對照水平。測量水 平與平均對照水平的偏差可以預(yù)測或診斷糖尿病或易患該病的體質(zhì)、心血管疾病、ACD或心 臟移植排斥。已經(jīng)依據(jù)GRN-SP生物標(biāo)記物水平的不同、偏差或更低或水平降低指示葡萄糖代 謝障礙或糖尿病、以及GRN-SP生物標(biāo)記物水平的更高或水平提高指示ACD或心臟移植排 斥，描述了本發(fā)明的方法。還可以是，在某些事件或障礙中，GRN-SP生物標(biāo)記物的水平將降 低或更低或?qū)⑸呋蚋?，這取決于事件或障礙的代謝作用。還設(shè)想高于或低于對照水平 的測量偏差。本文中對于ACD和心臟移植排斥特別有用的其它標(biāo)記物包括肌鈣蛋白、肌鈣蛋 白T、肌鈣蛋白I、肌酸激酶MB、肌紅蛋白、BNP、NT-BNP、BNP-SP、BNP-SP片段、ANP、ANP-SP、 ANP-SP片段、LDH、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、H-FABP、內(nèi)皮素、腎上腺髓質(zhì)素、缺血修飾白蛋白、腎素、 以及血管緊張素II1。這些標(biāo)記物均涉及心臟功能不良或疾病。對于糖尿病、以及葡萄糖代 謝障礙，其它標(biāo)記物包括胰島素、乳酸酯、葡萄糖、脂肪酸以及甘油三酯或它們的標(biāo)記物。用 于上述標(biāo)記物的測定方法是眾所周知的并用于本領(lǐng)域。例如，各種上述測定例行用于臨床 環(huán)境，如由 Vogel, H, (2007)Drug Discovery and Evaluation :Pharmacological Assays Ed 3. Springer pp. Ed. :3, pp 2071 禾口由 Runge et al. (2006)Principles of Molecular medicine Ed. 2 Springer, pp 1268所描述的。用于進(jìn)行上述測定的試劑盒和試劑可商 業(yè)上獲自若干供應(yīng)商，包括QuantiChrom 和EnzyChrome 葡萄糖、脂肪酸和甘油三酯測 定(BioAssay Systems，加利福尼亞，USA)以及葡萄糖、甘油三酯和自由脂肪酸測定試劑盒 (BioVision，加利福尼亞，USA)。使GRN-SP生物標(biāo)記物水平相關(guān)于其它標(biāo)記物可以提高GRN-SP的預(yù)測、診斷或監(jiān) 測價(jià)值。在A⑶、心臟移植排斥或AOT/肺疾病的情況下，GRN-SP標(biāo)記物水平與已知心臟標(biāo) 記物的結(jié)合可以增加患者結(jié)果的預(yù)測或診斷價(jià)值?？梢允褂脝卧嚇油瑫r(shí)或分別進(jìn)行若干肽標(biāo)記物的分析。同時(shí)、兩個或多位點(diǎn)形 式測定是優(yōu)選的。多重珠粒、微量測定物或生物芯片系統(tǒng)是特別有用的。上述珠粒、測定 物或芯片可以具有若干分立的、經(jīng)?？蓪ぶ返奈恢茫ㄏ鄬τ谝环N或多種標(biāo)記物(包括 GRN-SP和GRN-SP片段)的抗體。上述一種或多種標(biāo)記物包括多于一種的GRN-SP標(biāo)記物。 例如，它可以有利于測定N端和C端GRN-SP生物標(biāo)記物片段以及結(jié)合測定結(jié)果。許多其它 這樣的標(biāo)記物組合是可行的。US2005/0064511、US 6，019，944、以及 Ng and Hang, J. Cell MoI.Med.，6 =329-340(2002)描述了可用于本發(fā)明的微陣列、芯片、毛細(xì)管裝置以及技術(shù)。 Luminex提供了可用于本發(fā)明的多重珠粒系統(tǒng)。還參見The Protein Protocols Handbook, 上文。適用于單獨(dú)或順序測定的實(shí)驗(yàn)室分析儀包括AXSym(Abbott，USA) ,ElecSys(Roche)、 Access(Beckman)、ADVIA CENTAUR (Bayer)以及 Nichols Advantage (Nichols GRNtitute)免疫測定系統(tǒng)。在一種實(shí)施方式中，在單一表面如芯片或陣列上進(jìn)行多種多肽的同時(shí)測定。
在另一種實(shí)施方式中，進(jìn)行一種或多種非GRN-SP標(biāo)記物的單獨(dú)測定，并且結(jié)果對 照或合并于GRN-SP生物標(biāo)記物結(jié)果。在監(jiān)測對象的情況下，可以隨著時(shí)間的推移獲取若干生物樣品。連續(xù)取樣便于隨 著時(shí)間的推移測量標(biāo)記物水平的變化，尤其是GRN-SP生物標(biāo)記物。采樣可以提供關(guān)于事件 的大概發(fā)作時(shí)間、事件的嚴(yán)重性的信息，表明哪些治療方案可能是合適的、響應(yīng)于所采用的 治療方案、或長期預(yù)后?？梢栽卺t(yī)療點(diǎn)如在救護(hù)車中、醫(yī)生辦公室，在臨床表現(xiàn)時(shí)、在住院期 間，對門診患者，或在例行健康檢查期間，進(jìn)行分析。還可以連同一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因素的分析一起進(jìn)行本發(fā)明的方法，其中風(fēng)險(xiǎn)因素如 但不限于年齡、體重、身體活動水平、性別以及事件(如肥胖癥、糖尿病、葡萄糖代謝障礙、 以及心臟事件)的家史。還可以連同本發(fā)明的方法一起來使用測試結(jié)果。例如，葡萄糖耐 量試驗(yàn)、ECG結(jié)果以及臨床檢查。GRN-SP的循環(huán)水平的統(tǒng)計(jì)上顯著的變化、連同一種或多種 另外的風(fēng)險(xiǎn)因素或測試結(jié)果，可以用來更準(zhǔn)確地診斷或預(yù)后對象的病癥。本文的方法還可以用作治療指南(guide)。例如開始何種治療以及何時(shí)治療監(jiān)測、 檢測治療的陽性或不利影響(例如抗有絲分裂藥物的心臟毒性)、胰島素、葡萄糖代謝、甘 油三酯以及脂肪酸濃度，以及如果需要或在需要時(shí)(取決于結(jié)果)治療方案的調(diào)節(jié)。這可 以改善患者的短期、中期和長期結(jié)果。關(guān)于治療指南，參見Troughton et al8。急性心臟疾病本發(fā)明的申請人已表明，GRN-SP生物標(biāo)記物的濃度與急性心臟疾病相關(guān)(圖6)。 此外，在患者呈現(xiàn)有疑似急性心肌梗死(AMI)或心臟病發(fā)作的情況下，在臨床表現(xiàn)以后， GRN-SP生物標(biāo)記物水平處于最高值。呈現(xiàn)有急性心臟疾病，以及尤其是由(心臟病發(fā)作，在 心臟肌肉或心肌中留下瘢痕)引起的急性心肌缺血冠狀動脈疾病的對象可以或可以不經(jīng) 歷隨后的心肌梗死(Ml)。利用目前的臨床技術(shù)和標(biāo)記物，并不能容易地診斷不經(jīng)歷MI的 組。因此本發(fā)明的申請人提供了有用的早期和特異性標(biāo)記物，用于與MI有關(guān)的心肌損傷。 這可以便于起因于不良事件(AE)的心肌損傷的早期診斷以及便于醫(yī)師區(qū)分上述情況與其 它急性冠狀動脈綜合征以及區(qū)分其與胸痛的其它原因。例如心絞痛、胃腸疾病、肺/胸膜疾 病等。這顯著縮短了在等待目前的心臟生物標(biāo)記物如肌紅蛋白、CK-MB、TnT以及TnI的水 平升高所經(jīng)歷的6小時(shí)至12小時(shí)的窗口。因而可以更早進(jìn)行更準(zhǔn)確的診斷和治療，從而減 小發(fā)病率和死亡率并產(chǎn)生更好的預(yù)后結(jié)果。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明可用于監(jiān)測在心臟病患者中的再灌注治療。再灌注 治療通常包括經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(例如血管成形術(shù))和/或藥物治療。在藥物治療中 通常采用用于血管再生的溶栓藥物。輔助療法包括抗凝和抗血小板治療。當(dāng)在診斷以后盡 快采用時(shí)，再灌注治療是最有效的。為加速診斷所進(jìn)行的GRN-SP測試便于再灌注治療的快 速采用。還可以通過重復(fù)測試來監(jiān)測治療的有效性，并在適當(dāng)情況下調(diào)整療法。關(guān)于再灌 注治療的全面討論，參見本文的Braunwald et al1。心臟疾病本發(fā)明的方法還可以用于診斷或預(yù)測對象的心臟疾病。心臟移值排斥本發(fā)明還用于監(jiān)測心臟移植，通常心臟異體移植排斥反應(yīng)，其中在移植期間和以 后之后通過定期組織活檢并利用GRN-SP生物標(biāo)記物測量進(jìn)行檢測。相對于對照水平，在心
37臟移植的約6、4或2小時(shí)內(nèi)測得的GRN-SP生物標(biāo)記物水平的增加可以用來預(yù)測或診斷排 斥反應(yīng)。本發(fā)明還提供了在生物樣品中測定GRN-SP生物標(biāo)記物的方法。在一種實(shí)施方式 中，樣品是在ACD、心臟移植排斥或ACD/肺疾病發(fā)作約6、4或2小時(shí)內(nèi)、或在ACD、心臟移 植排斥或ACD/肺疾病臨床表現(xiàn)約6、4或2小時(shí)內(nèi)獲自對象。該測定方法包括利用任何已 知方法來檢測和測量樣品中的GRN-SP生物標(biāo)記物水平。在一種實(shí)施方式中，該測定方法是 體外測定方法。這樣的方法包括但不限于所有上面討論的已知的測定技術(shù)以及凝膠電泳 技術(shù)、Western 印跡、氣相光譜(gas phase spectroscopy)、原子力顯微術(shù)(atomic force microscopy)、表面等離子體共振、質(zhì)譜法23。在一種實(shí)施方式中，該測定方法包括一種或多種核酸序列，其結(jié)合于本發(fā)明的一 種或多種GRN-SP生物標(biāo)記物核酸序列。大范圍的有義和反義探針和引物可以設(shè)計(jì)自本文 的核酸序列。利用上面討論的已知技術(shù)來確定GRN-SP生物標(biāo)記物序列的表達(dá)水平。陣列可 以是固態(tài)底物例如"芯片"(如在美國專利號5，744，305中所描述的)或硝酸纖維素膜。 關(guān)于有用陣列的討論，參見例如Microarray Technology and its Application, Μ ΙΙβΓ, U et al. , Springer 2005,以及 Gene Expression Profiling by Microarrays :Clinical Implications, Hofmann, ff-K ；Cambridge University Press 2006。由本文的GRN-SP生物標(biāo)記物表達(dá)的蛋白質(zhì)還可以用于測定，并且結(jié)果與表達(dá)在 正常對照樣品中的相同蛋白質(zhì)的表達(dá)水平加以比較?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的和本文討論的 測定形式來評估蛋白質(zhì)的存在和量。優(yōu)選通過使GRN-SP生物標(biāo)記物結(jié)合于結(jié)合劑如抗體，包括本本發(fā)明的抗體，并測 量結(jié)合GRN-SP生物標(biāo)記物的存在量，來檢測樣品中GRN-SP生物標(biāo)記物的存在。如上所述，結(jié)合或選擇性地結(jié)合GRN-SP的抗體(包括其變體和片段)形成本發(fā)明 的另一方面并且通過上面討論的技術(shù)可以制備這些抗體。這些抗體可用于本發(fā)明的方法和 測定。在另外的方面，本發(fā)明提供了用于在對象中預(yù)測、診斷、評估或監(jiān)測生物事件或障 礙的試劑盒，其中生物事件包括葡萄糖代謝障礙、糖尿病、新血管疾病、急性心臟疾病(ACD， 包括心臟移植排斥)、或ACD/肺疾病，上述試劑盒包括GRN-SP生物標(biāo)記物結(jié)合劑(或用于 多種GRN-SP生物標(biāo)記物的結(jié)合劑)，該結(jié)合劑包括本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段。當(dāng)試劑 盒用于診斷ACD、心臟移植排斥、或ACD/肺疾病時(shí)，在一種實(shí)施方式中，生物樣品，例如，是 在ACD、心臟移植排斥、或ACD/肺疾病的發(fā)作或臨床表現(xiàn)的約6、4或2小時(shí)內(nèi)獲自對象。本發(fā)明還提供了用于預(yù)測、診斷、評估或監(jiān)測急性心臟疾病(ACT)、心臟移植排斥、 或ACD/肺疾病的試劑盒，該試劑盒包括本發(fā)明的結(jié)合劑，其中對試劑盒進(jìn)行校準(zhǔn)以測量約 0. 1至約500pmol/L、約1至約300pmol/L、約10至約250或約20至約150pmol/L范圍內(nèi)的 GRN-SP 水平。可以按照已知技術(shù)，例如利用具有已知水平的GRN-SP生物標(biāo)記物的血液樣品、或 各自具有不同已知水平的GRN-SP的一組校準(zhǔn)，來進(jìn)行測定校準(zhǔn)。用于診斷試劑盒的試驗(yàn)條 帶(test strips)通常是在制造期間加以校準(zhǔn)。參見例如US 6，780，645。試劑盒可用于測 量生物樣品中的GRN-SP生物標(biāo)記物水平。檢測試劑可以是互補(bǔ)于GRN-SP或GRN-SP標(biāo)記 物的片段的寡核苷酸序列、或結(jié)合于由標(biāo)記物編碼的多肽的抗體。試劑可以結(jié)合于固態(tài)基質(zhì)(如上面所討論的)或包裝(packaged)有用于將它們結(jié)合于基質(zhì)的試劑。固態(tài)基質(zhì)或 底物可以具有珠粒、平板、管、浸漬片、條帶或生物芯片的形式(所有如上面所討論的)。檢測試劑包括洗滌劑和能夠檢測結(jié)合抗體(如標(biāo)記二抗)的試劑、或能夠和標(biāo)記 抗體反應(yīng)的試劑。試劑盒還將方便地包括對照試劑(陽性和/或陰性)和/或用于檢測核酸、多肽、 或抗體的裝置。試劑盒還可以包括用法說明書，如在ACD、心臟移植排斥或ACD/肺疾病發(fā)作 或表現(xiàn)的6、4或2小時(shí)內(nèi)從對象獲取生物樣品，測量樣品中的GRN-SP水平，比較測量水平 與對照水平，以及關(guān)聯(lián)比較結(jié)果和心臟狀況。通常，和對照相比，GRN-SP標(biāo)記物水平的增加 指示ACD或心臟移植排斥、或ACD (與肺疾病相對)。在糖尿病的情況下，和對照相比，更低或更高GRN-SP生物標(biāo)記物水平指示糖尿病 或易患糖尿病體質(zhì)，是更高還是更低則取決于糖尿病的特性和對象的糖尿病狀態(tài)。最常見地，試劑盒形式化為用于本領(lǐng)域已知的測定，在一種實(shí)施方式中用于PCR、 Northern雜交或Southern ELISA測定(如在本領(lǐng)域中已知的)。試劑盒還可以包括用于A⑶、移植排斥、或A⑶/肺疾病的標(biāo)記物的一種或多種另 外的測定。在ACS的情況下，另外的標(biāo)記物測定可以包括用于以下一種或多種的測定肌鈣 蛋白T、肌鈣蛋白I、肌酸激酶MB、肌紅蛋白、ANP、BNP、BNP-SP, BNP-SP片段、ANP、ANP-SP, ANP-SP片段、NT-BNP, LDH、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、H-FABP、內(nèi)皮素、腎上腺髓質(zhì)素、缺血修飾白蛋 白、腎素以及血管緊張素II。在一種實(shí)施方式中，所有標(biāo)記物包括在試劑盒中。在糖尿病的情況下，另外的試劑盒成分可以是用于標(biāo)記物的測量裝置，其中標(biāo)記 物可以包括葡萄糖、胰島素、乳酸酯、甘油三酯或脂肪酸水平或其標(biāo)記物。試劑盒將包括一個或多個容器并且還可以包括收集裝置，例如，瓶、袋(如靜脈輸 液袋)、小瓶、注射器、以及試管。至少一個容器容納產(chǎn)品，該產(chǎn)品可有效用于預(yù)測、診斷、或 監(jiān)測生物事件如肥胖癥、糖尿病、腎病、心血管疾病、ACD(尤其是ACS)、移植排斥、或ACD/肺 疾病。上述產(chǎn)品通常是核酸分子、多肽或結(jié)合劑，尤其是本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段，或 包含任何這些成分的組合物。在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，在容器上或伴隨容器的用法說明或 標(biāo)簽指明，上述組合物可用于預(yù)測、診斷、或監(jiān)測生物事件。其它成分可以包括針、稀釋劑以 及緩沖劑。有益地，試劑盒可以包括至少一個容器，該容器包含緩沖液，如磷酸緩沖鹽溶液、 林格氏液以及葡萄糖溶液。試劑盒中理想地包括結(jié)合或選擇性地結(jié)合GRN-SP生物標(biāo)記物(以及，可選地，非 GRN-SP生物標(biāo)記物)的結(jié)合劑。在一種實(shí)施方式中，結(jié)合劑是抗體，優(yōu)選本發(fā)明的抗體或 抗原結(jié)合片段。在測定和試劑盒中所使用的抗體，在一種實(shí)施方式中，可以是單克隆或多克 隆抗體，并且可以在任何哺乳動物(如上面所討論的)中制備?？贵w可以針對由本發(fā)明的 GRN-SP生物標(biāo)記物核酸序列、GRN-SP(1-23)、GRN-SP(1-9)或基于或包括上述肽的合成肽 而制備，或可以相對于外源性序列而產(chǎn)生，其中外源性序列融合于編碼本發(fā)明的GRN-SP生 物標(biāo)記物肽的核酸序列。在一種試劑盒的實(shí)施方式中，將GRN-SP生物標(biāo)記物檢測試劑固定于固態(tài)基質(zhì)如 多孔條帶或芯片以形成至少一個GRN-SP生物標(biāo)記物檢測位點(diǎn)。多孔條帶的測量或檢測區(qū) 可以包括多個檢測位點(diǎn)，這樣的檢測位點(diǎn)包含GRN-SP生物標(biāo)記物檢測試劑?？梢砸蚤L條、 交叉或點(diǎn)或其它排列方式來安排位點(diǎn)。測試條帶或芯片還可以包含用于陰性和/或陽性對
39照的位點(diǎn)。對照位點(diǎn)可以可替換地是在不同條帶或芯片上。不同的檢測位點(diǎn)可以包含不同 量的固定核酸或抗體，例如在第一檢測位點(diǎn)有較高量以及在隨后的位點(diǎn)有較低量。在添加 生物試樣以后，顯示可檢測信號的位點(diǎn)的數(shù)目提供了在樣品中存在的GRN-SP生物標(biāo)記物 的量的定量或半定量指示。在試劑盒中還可以包括用于樣品分析的裝置，該裝置包括包含適當(dāng)成分(標(biāo)記 物、抗體以及試劑)的一次性測試筒以進(jìn)行樣品測試。該裝置將適宜地包括測試區(qū)和測試 結(jié)果窗口。免疫色譜筒是上述裝置的實(shí)例。參見例如US 6, 399, 398,US 6，235，241以及US 5，504，013?？商鎿Q地，該裝置可以是電子裝置，其便于輸入、存儲以及評價(jià)所測得的標(biāo)記 物水平(相對于對照水平)以及其它標(biāo)記物水平。US 2006/0234315提供了上述裝置 的實(shí)例。此外可用于本發(fā)明的是Ciphergen' s Protein Chip ,利用Ciphergen ‘ s Protein Chip 軟件包，其可以用來處理SELDI結(jié)果。在本說明書中，其中已參考專利說明書、其它外部文件、或其它來源的信息，這通 常是為了給討論本發(fā)明的特點(diǎn)提供背景。除非另有具體說明，參考上述外部文件并不認(rèn)為 是承認(rèn)上述文獻(xiàn)、或上述來源的信息(在任何司法中)是現(xiàn)有技術(shù)、或形成本領(lǐng)域的公知常 識的一部分?，F(xiàn)將以非限制性方式參照以下實(shí)施例來說明本發(fā)明。實(shí)施例1方法所有人方案得至IjUpper South Regional Ethics Committee of the Ministry of Health (新西蘭)的準(zhǔn)予，并按照赫爾辛基宣言進(jìn)行。化學(xué)制品合成人GRN 信號肽 GRN-SP (1-9) (SEQ ID NO 17)由 Mimotopes (澳大利亞)合成， 其中利用溫和Fmoc固相合成方法30。所有緩沖試劑購買自BDH (UK)和/或Sigma (Mo， USA)。借助于用于定向載體結(jié)合的半胱氨酸，合成C-末端延伸的GRN-SP(l-9)。還借助于 用于在相同肽上示蹤物(tracer)制備的酪氨酰殘基對GRN-SP(1_9)進(jìn)行C-末端延伸。人類研究為了進(jìn)行健康志愿者參考范圍研究，血液樣品獲自隔夜空腹以后的28位健康志 愿者(16位婦女，平均年齡50. 3士2. 5歲(范圍21-72歲)，BMI 26. 0士0. 8kg/m2)。該研究 擴(kuò)展至總共86位志愿者。將樣品放入冰上的管中并于+4. 0°C和2700g下離心5分鐘，然后 將血漿儲存于-80°C直至分析。隨后該研究擴(kuò)展至23位STEMI患者。在克賴斯特徹奇醫(yī)院的心臟特診室中表現(xiàn)。 在隔夜空腹后，將18規(guī)格(18-gauge)的靜脈插管插入前臂靜脈以采血。在進(jìn)入心臟特診 室(時(shí)間0)時(shí)以及在作為住院患者以后的0、0. 5、1、2、4、8、12、24以及72小時(shí)抽取靜脈樣 品(IOml)，將樣品放入冰上的管中并+4°C和2700g下離心5分鐘，然后將血漿儲存于_80°C 直至分析。血漿提取如先前所描述的22，用S印Pak Cartridges (Waters, USA)提取所有血漿樣品，并在 RIA和HPLC以前，干燥和儲存于_20°C。
激素濃度分析根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)制造商方案，RocheDiagnostics17，在Elecsys 2010 (Roche，USA)上使用 異種免疫測定并使用釕標(biāo)記的生物素化抗體，分析血漿樣品中的Tnl、CK-MB和肌紅蛋白。通過特異性RIA如下測量GRN-SP GRN-SP RIA為了測量推定的人GRN-SP生物標(biāo)記物肽，我們產(chǎn)生了新的RIA，其針對人前饑餓 素原(1-23)信號序列(SEQ ID NO 15)的 GRN-SP 氨基酸 1-9 (SEQ ID N0:17)。抗體生成在室溫下通過溫和混合，將前GRN原(1-9) Cysl°結(jié)合于經(jīng)順丁烯二酰亞胺 (malemide)處理的在PBS (pH7. 0)中的N_e_馬來酰亞胺己酸琥珀酰亞胺酯(EMCS)衍生的 BSA。用弗氏佐劑(2ml)乳化結(jié)合肽并以每月間隔在4-5個部位皮下注射(總共2ml)給2 只新西蘭白兔。在注射后12天對兔進(jìn)行放血以評估抗體滴度直至達(dá)到適當(dāng)水平。關(guān)于RIA， 利用最終稀度為1 15，000的抗血清來確定GRN-SPIR。這種抗血清沒有可檢測到與多肽及 藥物的交叉反應(yīng)(示于圖7)，包括人BNP原(proBNP) (1-13)、BNP原(1-76)、ANP原(1-30)、 胰島素、血管緊張素II、血管緊張素(1-7)、尾加壓素11丄呢、饑餓素丄-饑餓素(52-117)、 CNP原(1-15)、腎上腺髓質(zhì)素、尿促皮素I、尿促皮素II、BNP-SPn (1-10)，ANP-SPc (16-25)、 ANP-SP(I-IO)、INS-SPn(1-9)。按照 Klee，G G. Interference in immunoassays Clin Lab Bed, 2004, 24 1-18.來評價(jià)交叉反應(yīng)。碘化和測定方法借助于氯胺T法來碘化前GRN原(1_9)Tyri°，然后用反相HPLC(RP-HPLC)加以純化， 如先前描述的21。按照這種制備，測試了 RP-HPLC以后的碘化示蹤物形式。將所有樣品、 標(biāo)準(zhǔn)物、放射性示蹤物以及抗血清溶液稀釋在基于鉀的測定緩沖液中22。測定溫育液包含 100 μ L樣品或標(biāo)準(zhǔn)(0-640pmol)人前GRN原(1-9)結(jié)合100 μ L抗血清，在4 °C下對其進(jìn)行 旋轉(zhuǎn)和溫育24小時(shí)。然后添加100 μ L示蹤物(4000-5000cpm)并在4°C下進(jìn)一步溫育24 小時(shí)。通過固相二抗方法(驢抗羊Sac-Cel ，iDS Ltd，英國)最終分離自由和結(jié)合的免 疫反應(yīng)活性并用Gammamaster計(jì)數(shù)器(LKB，烏普薩拉，瑞典)加以計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)分析所有結(jié)果表示為平均值士SEM。利用用于重復(fù)測量的雙因素(two-way)AN0VA， 接著最低顯著性差異事后測試(post-hoctesting)，分析了時(shí)間過程數(shù)據(jù)(time-course data) 0利用一般線性回歸模型，進(jìn)行了血漿激素濃度的相關(guān)分析。在所有分析中，P值 <0. 05被認(rèn)為是顯著的。結(jié)果為了確定饑餓素的23個氨基酸信號肽或從其衍生的片段是否存在于人類的循環(huán) 中，我們開發(fā)了特異的放射免疫測定(RIA)，其針對前饑餓素原(1-23)的殘基1-9。血漿 提取物的稀釋顯示了與標(biāo)準(zhǔn)曲線(未示出)的平行性。在健康人中GRN-SP(1-9)的血漿 濃度最初確定為31. 3士2. 4pmol/L(n = 28)。隨后更大的研究(η = 86)給出血漿濃度為 42. 9士 1. 5pmol/L(見圖6)。在健康人體中，血液中GRN-SPIR的濃度沒有顯示與BMI顯著 相關(guān)(圖3)。在已確定了免疫反應(yīng)性(IR)GRN-SP(1_9)肽存在于人血漿中以后，我們測量了在
41患有文件證明的AMI的患者中IR GRN-SP (1-9)的連續(xù)濃度(圖6)。在入院后1_2小時(shí)觀 測到IR GRN-SP的最高濃度，然后經(jīng)72小時(shí)緩慢下降至穩(wěn)定水平。重要的是，平均峰值水 平是正常的健康志愿者中水平的2至3倍(2至5倍范圍)。肌紅蛋白的峰值濃度在入院后 1-2小時(shí)出現(xiàn)，而峰值TnI和CK-MB水平直到入院后8_12小時(shí)才得到。優(yōu)選地，檢測IR GRN-SP片段。為了評價(jià)GRN-SP在控制代謝和/或能量平衡中的作用，給7個正常的健康志愿者 口服75g葡萄糖。如圖4所示，GRN-SP(1-9)和饑餓素本身的血漿水平在攝取葡萄糖后有 顯著減少，這與其在能量平衡中發(fā)揮作用相一致。實(shí)施例2對具有臨床上穩(wěn)定的疑似ACS的8位患者進(jìn)行插管并從多個器官部位獲得血液樣 品，上述多個器官部位是股動脈FA(I)和FA(2)、股靜脈(FV)、腎靜脈(RV)、肝靜脈(HV)、下 腔靜脈(IVC)、頸靜脈(JUG)、心臟冠狀竇靜脈(CS)以及肺動脈(PA)。血液被收集到冷凍 EDTA管中，通過離心從血漿制備以及對血漿進(jìn)行GRN-SPRIA。圖1清楚示出，GRN-SP (1-9) 濃度最高的部位是CS，排出心臟特別是心室的靜脈。這是有力的證據(jù)，證實(shí)心臟是GRN-SP 分泌的主要場所。與此一致，GRN-SP的冠狀竇水平與另一種已知的心臟肽BNP-SP強(qiáng)烈相 關(guān)(圖2)。結(jié)論在臨床上穩(wěn)定的患者中，循環(huán)GRN-SP生物標(biāo)記物濃度可能來源于心臟來源。大量 的心臟分泌與GRN-SP肽和亞肽(subp印tides)作為心臟激素相一致。響應(yīng)文件證明的AMI 的GRN-SP肽和亞肽的增加支持以下想法它們具有作為心臟疾病的生物標(biāo)記物的作用。此 外，GRN-SP生物標(biāo)記物血漿水平對血漿葡萄糖的增加的響應(yīng)還暗示它在能量平衡中可能發(fā) 揮作用。討論此證據(jù)首次證實(shí)在患者表現(xiàn)ACD的兩個小時(shí)內(nèi)或在ACD發(fā)作的兩個小時(shí)內(nèi)，前饑 餓素原的信號肽、以及其片段存在于循環(huán)和細(xì)胞外腔隙(extracellular space)中。我們表 明了，首先血液中GRN-SPIR的測量具有潛力作為急性心肌缺血和/或隨后損傷的快速生物 標(biāo)記物，以及其次事件以后GRN-SP的測量具有潛在價(jià)值可作為長期預(yù)后和結(jié)果的標(biāo)記物。我們還表明，血漿中GRN-SP生物標(biāo)記物的測量可潛在地用于代謝作用和/或能量 平衡領(lǐng)域，尤其用于葡萄糖代謝的評估。本領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)然明了，以上描述是通過舉例方式來提供且本發(fā)明并不限于 此。參考文獻(xiàn)1. Braunwald E,Zipes DP,Libby P. Acute myocardial infarction Chp. 35 Heart disease -.a textbook of cardiovascular medicine, 6th ed. 2001. pgs. 1114-1231.2. Richards AM, Nicholls MG, Yandle TG, Frampton C, Espiner EA,Turner JG, Buttimore RC, Lainchbury JG, Elliott JM, Ikram H, Crozier IG, Smyth Dff. Plasma N—terminal pro-brain natriuretic peptide and adrenomedullin :new neurohormonal predictors of left ventricular function and prognosis after myocardial infarction. Circulation 199897 :1921—1929.
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440. Low plasma ghrelin is associated with insulin resistance,hypertension,and the prevalence of type 2 diabetes Diabetes. 20030ct ；52 (10) :2546_53·本發(fā)明并不限于上述特定的優(yōu)選實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對所披露的優(yōu)選 實(shí)施方式進(jìn)行各種改進(jìn)而沒有偏離本發(fā)明的構(gòu)思。所有這樣的改進(jìn)都將在本發(fā)明的范圍 內(nèi)。本文參考或提及的所有專利、出版物、科學(xué)論文、萬維網(wǎng)站、以及其它文件和材料 表明與本發(fā)明有關(guān)領(lǐng)域中的技術(shù)人員的水平，并且每個上述引用的文件和材料以引用方式 結(jié)合于本文，其結(jié)合程度等同于如果其單獨(dú)地以引用方式作為整體結(jié)合或作為整體在本文 中描述。申請人保留物理上將來自任何上述專利、出版物、科學(xué)論文、萬維網(wǎng)站、以電子方 式可獲得的信息、以及其它引用的材料或文件的任何及所有材料和信息加入本說明書的權(quán) 利。本專利的書面說明部分包括所有權(quán)利要求。另外，所有權(quán)利要求，包括所有原權(quán)利 要求以及所有來自任何及所有優(yōu)先權(quán)文件的權(quán)利要求，其全部內(nèi)容以引用方式結(jié)合于本說 明書的書面說明部分，并且申請人保留將任何及所有上述權(quán)利要求物理上加入本申請的書 面說明或任何其它部分的權(quán)利。因此，例如，在任何情況下本專利都不可以解釋為據(jù)宣稱未 提供權(quán)利要求的書面說明(基于權(quán)利要求的精確措辭未用這些文字陳述在本專利的書面 說明部分中)。在本說明書中披露的所有特點(diǎn)可以以任何組合加以結(jié)合。因此，除非另有明確陳 述，所披露的每個特點(diǎn)僅是等效或類似特點(diǎn)的通用系列的一個實(shí)例。應(yīng)當(dāng)明了，雖然已連同詳細(xì)描述來描述了本發(fā)明，但上述描述用來說明而不是限 制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍是由所附權(quán)利要求的范圍加以限定。因此，根據(jù)上述內(nèi)容， 應(yīng)當(dāng)明了，雖然為說明的目的本文已描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但可以進(jìn)行各種改進(jìn) 而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。其它方面、優(yōu)點(diǎn)、以及改進(jìn)是在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)并且 本發(fā)明僅受限于所附權(quán)利要求。本文描述的具體方法和組合物代表優(yōu)選實(shí)施方式并且是示例性的，而不是用于限 制本發(fā)明的范圍。鑒于本說明書，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了其它目的、方面、以及實(shí)施方式，并 且包括在本發(fā)明的精神內(nèi)，如由權(quán)利要求的范圍所限定的。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是， 可以對本文披露的本發(fā)明進(jìn)行多種替代和改進(jìn)而不偏離本發(fā)明的范圍和精神。本文說明性 地描述的發(fā)明可以適當(dāng)?shù)卦跊]有任何要素或多種要素、或限制或多種限制(其在本文中并 沒有明確披露為必不可少的)的條件下實(shí)施。因此，例如，在本文的每種情況下，在本發(fā)明 的實(shí)施方式或?qū)嵤├?，術(shù)語"包含"、“包括"、“含有"等要廣泛而沒有限制地加以 理解。本文說明性地描述的方法和過程可以適當(dāng)?shù)匾圆襟E的不同次序來實(shí)施，以及它們不 一定限于在本文或權(quán)利要求中所指定的步驟次序。已采用的術(shù)語和措辭是用作描述而不是限制的術(shù)語，并且并不是要使用這樣的術(shù) 語和措辭來排除所示和所描述的特點(diǎn)的任何等同替代或其一部分，而是應(yīng)當(dāng)明了，在如要 求的本發(fā)明的范圍內(nèi)各種改進(jìn)是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解，雖然通過各種實(shí)施方式和/或優(yōu) 選實(shí)施方式以及可選的特點(diǎn)，已具體披露了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采取的本文所 披露構(gòu)思的任何及所有改進(jìn)和變化被認(rèn)為是在如所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文已廣泛和一般地描述了本發(fā)明。屬于屬類披露內(nèi)容的每個更窄的種和亞屬組也形成本發(fā)明的一部分。這包括本發(fā)明的帶有附帶條件或負(fù)面限制而從屬中消除任何主題 的屬類描述，不論本文中是否明確列舉缺失的材料。還應(yīng)當(dāng)明了，如在本文中以及在所附權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式"一"、“一 種"以及"該"包括復(fù)數(shù)指稱(除非上下文另有明確規(guī)定)，術(shù)語"X和/或Y"是指"X" 或"Y"或者"X"和"Y"，以及名詞后的字母"S"是指上述名詞的復(fù)數(shù)和單數(shù)形式。此 外，在按照馬庫什組來描述本發(fā)明的特點(diǎn)或方面的情況下，它是指，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將 明了，本發(fā)明包括馬庫什組的任何個體成員和成員的任何亞組并且還按照馬庫什組的任何 個體成員和成員的任何亞組加以描述，以及申請人保留修改申請或權(quán)利要求的權(quán)利以具體 提到馬庫什組的任何個體成員或成員的任何亞組。其它實(shí)施方式落在以下權(quán)利要求內(nèi)。本專利不可以解釋為限于本文具體和/或明 確披露的具體實(shí)施例或?qū)嵤┓绞交蚍椒āＴ谌魏吻闆r下，本專利不可以解釋為限于由專利 局的任何審查員或任何其它官員或雇員作出的任何陳述，除非這樣的陳述是由申請人采用 書面回應(yīng)形式確定地表達(dá)和無限定條件或保留地表達(dá)。
4權(quán)利要求
一種饑餓素信號肽(GRN SP)結(jié)合劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GRN-SP結(jié)合劑，所述GRN-SP結(jié)合劑結(jié)合(a)GRN-SP(1-23)SEQID NO 15 ；(b)GRN-SP(1-9)SEQID NO 17 ；(c)由選自SEQID NO 16或SEQ ID NO 18的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；或(d)(a)至(c)中任何一種的變體或片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的GRN-SP結(jié)合劑，所述GRN-SP結(jié)合劑是抗 GRN-SP抗體或其抗原結(jié)合片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的結(jié)合劑，所述結(jié)合劑選擇性結(jié)合GRN-SP(1-9) (SEQ ID NO 17)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的結(jié)合劑，所述結(jié)合劑是多克隆、單克隆、雙特異 性、嵌合或人源化抗體或它們的抗原結(jié)合片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的結(jié)合劑，所述結(jié)合劑標(biāo)記有可檢測標(biāo)記。
7.一種編碼GRN-SP片段的分離的核酸分子，其中，所述核酸選自(a)SEQ ID NO 18或其變體或片段；(b)相對于SEQ ID NO :18 具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%或 99%序列同 一性的序列；(c)長度為至少10個核苷酸、能夠在嚴(yán)格條件下雜交于SEQID N0:18或其變體或片 段的序列；(d)(a)至(c)中任何一種的補(bǔ)體，條件是所述序列不是SEQ ID NO :16ο
8.一種包含根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸分子的基因構(gòu)建體，其包括載體、表達(dá)構(gòu)建體、 或宿主細(xì)胞。
9.一種分離的GRN-SP多肽，選自(a)GRN-SP (1-9) (SEQ ID NO 17)或其變體或片段；(b)相對于SEQ ID NO :17 的多肽具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%或 99% 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；以及(c)由根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸分子編碼的GRN-SP多肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多肽在制備抗GRN-SP抗體中的應(yīng)用。
11.一種對來自對象的生物樣品中的GRN-SP的測定法，所述測定法包括利用任何已知 方法檢測和測量在所述樣品中的GRN-SP水平。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的測定法，其中，通過使GRN-SP結(jié)合于結(jié)合劑來檢測所述樣 品中的GRN-SP水平，所述結(jié)合劑結(jié)合或選擇性結(jié)合GRN-SP。
13.一種對GRN-SP的測定法，包括(a)結(jié)合來自生物樣品的一種或多種GRN-SP；以及(b)測量結(jié)合GRN-SP的水平。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的測定法，其中，利用根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所 述的GRN-SP結(jié)合劑結(jié)合所述GRN-SP。
15.根據(jù)權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)所述的測定法，其中，所述生物樣品是來自循環(huán)來源的樣品。
16.根據(jù)權(quán)利要求11至15中任一項(xiàng)所述的測定法，其中，利用質(zhì)譜法，包括通過 SELDI、ESI、MALDI或FTICR，或利用選自RIA、ELISA、熒光免疫測定法以及免疫放射測定法 的測定法，來測量GRN-SP的水平。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的測定法，其中，所述測量包括提供SELDI探針，所述探針包 含附著于底物的抗GRN-SP抗體或其抗原結(jié)合片段；使所述抗體或片段接觸所述生物樣品 使得所述抗體或片段捕獲來自所述樣品的一種或多種GRN-SP ；以及利用SELDI測量結(jié)合 GRN-SP的水平。
18.一種GRN-SP測定法，用于在對象中預(yù)測、診斷或監(jiān)測生物事件或障礙。
19.一種用于在對象中預(yù)測、診斷或監(jiān)測生物事件或障礙的方法，其中，所述事件或障 礙與GRN-SP釋放到循環(huán)中有關(guān)，所述方法包括(a)測量來自所述對象的生物樣品中的GRN-SP水平；以及(b)比較GRN-SP的水平與來自對照的GRN-SP水平，其中所述測量水平與所述對照水平的偏差指示生物事件或障礙。
20.一種用于在對象中預(yù)測、診斷或監(jiān)測糖尿病、或糖尿病可能性的方法，所述方法包括(a)測量來自所述對象的生物樣品中的GRN-SP水平；以及(b)比較GRN-SP的水平與來自對照的GRN-SP水平，其中，GRN-SP的測量水平低于所述 對照水平指示糖尿病或易患糖尿病體質(zhì)。
21.一種用于評估對象中葡萄糖代謝的方法，所述方法包括(a)在給予葡萄糖后測量對象中的GRN-SP水平；以及(b)比較所述GRN-SP的水平與來自對照的GRN-SP，其中，GRN-SP的測量水平與所述對照水平的偏差指示葡萄糖代謝障礙。
22.一種用于在對象中預(yù)測、診斷或監(jiān)測急性心臟疾病(ACT)的方法，所述方法包括(a)測量來自所述對象的生物樣品中的GRN-SP水平；以及(b)比較所述GRN-SP的水平與來自對照的GRN-SP水平，其中，GRN-SP的測量水平高于所述對照水平指示ACD。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述方法用于評估或監(jiān)測對象中對急性心臟 疾病(ACD)的治療的響應(yīng)，其中GRN-SP的測量水平相比于所述對照水平的變化指示響應(yīng)所 述治療。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或權(quán)利要求23所述的方法，所述方法包括在ACD發(fā)作或臨床表現(xiàn) 的最初6小時(shí)、4小時(shí)或2小時(shí)內(nèi)測量來自所述對象的生物樣品中的GRN-SP水平。
25.根據(jù)權(quán)利要求20至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在ACD發(fā)作或臨床表現(xiàn)ACD的 最初6小時(shí)、4小時(shí)、2小時(shí)、1小時(shí)、或30分鐘內(nèi)測量GRN-SP水平。
26.根據(jù)權(quán)利要求22至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在所述樣品中GRN-SP水平在 65 至 250pmol/L、65 至 200pmol/L、70 至 150、或 70 至 130pmol/L 的范圍內(nèi)則指示 ACD。
27.根據(jù)權(quán)利要求22至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在所述樣品中GRN-SP水平為所 述對照水平的1. 5至5倍、或2至3倍則指示A⑶。
28.根據(jù)權(quán)利要求22至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述急性心臟疾病是在呈現(xiàn)的ECG上具有ST段抬高的急性心肌梗死(AMI)、不穩(wěn)定型心絞痛、急性非ST段抬高型心肌梗 死；心肌缺血、急性心肌損傷、急性藥物毒性造成的急性心肌損害、急性心肌病、或心臟移植 排斥反應(yīng)。
29.根據(jù)權(quán)利要求20至28中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述生物樣品是血液、血漿、血 清、唾液、間質(zhì)液、尿液或心臟組織樣品。
30.根據(jù)權(quán)利要求20至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述測量步驟包括(a)使GRN-SP結(jié)合于結(jié)合劑；以及(b)測量結(jié)合GRN-SP的水平。
31.根據(jù)權(quán)利要求20至30中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述結(jié)合劑是根據(jù)權(quán)利要求1 至6中任一項(xiàng)所述的結(jié)合劑。
32.根據(jù)權(quán)利要求20至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中，利用選自質(zhì)譜法(包括SELDI、 ESI、MALDI或FTIC)、RIA、ELISA、熒光免疫測定法、免疫熒光測定法、以及免疫放射測定法 的測定法測量GRN-SP水平。
33.根據(jù)權(quán)利要求22至32中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括測量所述ACD的 一種或多種非GRN-SP標(biāo)記物的水平，以及比較所述水平和來自對照的標(biāo)記物水平，其中所 述測量水平與所述對照水平的偏差、連同高于GRN-SP對照水平的GRN-SP測量水平，可預(yù)測 或診斷所述ACD，或可以用來監(jiān)測所述ACD。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述非GRN-SP標(biāo)記物選自由肌鈣蛋白T、肌鈣 蛋白I、肌酸激酶-MB、肌紅蛋白、ANP、ANP-SP、BNP、NT-BNP、BNP-SP、LDH、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、 H-FABP、缺血修飾白蛋白、內(nèi)皮素、腎上腺髓質(zhì)素、腎素以及血管緊張素II構(gòu)成的組。
35.根據(jù)權(quán)利要求20以及權(quán)利要求29至32中任一項(xiàng)所述的方法，當(dāng)從屬于權(quán)利要 求20時(shí)，所述方法進(jìn)一步包括測量糖尿病的一種或多種非GRN-SP標(biāo)記物的水平并比較所 述水平與來自對照的標(biāo)記物水平，其中，所述測量水平與非GRN-SP標(biāo)記物的對照水平的偏 差、連同低于GRN-SP對照水平的GRN-SP測量水平，可以預(yù)測或診斷糖尿病或可以用來監(jiān)測 糖尿病。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述非GRN-SP標(biāo)記物選自由葡萄糖、胰島素、 乳酸酯、甘油三酯以及脂肪酸或其標(biāo)記物組成的組。
37.GRN-SP結(jié)合劑在制備用于評估對象中生物事件或障礙的GRN-SP測定物中的應(yīng)用。
38.GRN-SP結(jié)合劑在制造用于評估對象中生物事件或障礙的預(yù)后、診斷或監(jiān)測工具中 的應(yīng)用。
39.根據(jù)權(quán)利要求37或權(quán)利要求38所述的應(yīng)用，其中，所述生物事件或障礙是糖尿病 或糖尿病可能性。
40.根據(jù)權(quán)利要求37或權(quán)利要求38所述的應(yīng)用，其中，所述生物事件或障礙是葡萄糖 代謝障礙。
41.根據(jù)權(quán)利要求37或權(quán)利要求38所述的應(yīng)用，其中，所述生物事件或障礙是ACD。
42.根據(jù)權(quán)利要求37至41中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述結(jié)合劑是根據(jù)權(quán)利要求1 至6中任一項(xiàng)所述的結(jié)合劑。
43.根據(jù)權(quán)利要求37至41中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，利用根據(jù)權(quán)利要求11至18中 任一項(xiàng)所述的測定法、或根據(jù)權(quán)利要求19至36中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)行所述評估、預(yù)測、診斷或監(jiān)測。
44.一種用于預(yù)測、診斷或監(jiān)測生物事件或障礙的試劑盒，包括GRN-SP結(jié)合劑；以及可 選的用法說明書，用于根據(jù)在來自對象的生物樣品中測得的GRN-SP水平來預(yù)測、診斷或監(jiān) 測所述對象中的生物事件或障礙。
45.一種用于預(yù)測、診斷或監(jiān)測急性心臟疾病(ACD)的試劑盒，包括GRN-SP結(jié)合劑；以 及可選地包括用法說明書，用于在對象中在發(fā)作或臨床表現(xiàn)的6或4小時(shí)內(nèi)，根據(jù)在ACD發(fā) 作或臨床表現(xiàn)的6或4小時(shí)內(nèi)獲得的生物樣品中測得的GRN-SP水平來預(yù)測、診斷或監(jiān)測 ACD。
46.根據(jù)權(quán)利要求44或權(quán)利要求45所述的試劑盒，其中，所述GRN-SP結(jié)合劑是根據(jù)權(quán) 利要求1至6中任一項(xiàng)所述的結(jié)合劑。
47.根據(jù)權(quán)利要求44至46中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中，所述試劑盒被校準(zhǔn)以測量 0. 1 至 350pmol/L、l 至 300pmol/L、10 至 250、或 20 至 150pmol/L 范圍內(nèi)的 GRN-SP 水平。
全文摘要
本發(fā)明提供了饑餓素信號肽的結(jié)合劑和測定法。上述試劑和測定法可用于預(yù)測、診斷、評估或監(jiān)測對象中的急性心臟疾病、葡萄糖代謝障礙以及糖尿病的方法中。還提供了可用于本發(fā)明的方法中的核苷酸、多肽、以及試劑盒。
文檔編號G01N33/487GK101977933SQ200980108631
公開日2011年2月16日 申請日期2009年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月12日
發(fā)明者克里斯托弗·約瑟夫·彭伯頓, 蒂莫西·格蘭特·揚(yáng)德爾, 邁克爾·加里·尼科爾斯, 阿瑟·馬克·理查茲 申請人:奧塔哥創(chuàng)新有限公司