專利名稱：檢測鈉/鈣交換體“正向模式”調(diào)節(jié)化合物的基于熒光的測定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鈉/鈣交換體(sodium/calcium exchanger)和檢測其活性的方法。 更準(zhǔn)確地講，本發(fā)明涉及用于檢測鈉/鈣交換體“正向模式”調(diào)節(jié)化合物的基于熒光的測定 法。本發(fā)明還涉及包含表達鈉/鈣交換體的細胞的組件試劑盒(kit of parts)及組件試 劑盒的用途。
背景技術(shù)：
生命的一個基本的必要條件是區(qū)室化——以生物膜作為實現(xiàn)這一原則的天然工 具。然而，脂雙層——構(gòu)成細胞膜基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)——對大多數(shù)離子和化合物是不滲透的，而這 些離子和化合物的轉(zhuǎn)運是維持細胞和生物體的生命機能所必需的。這種反論的答案在于細 胞膜的半滲透性質(zhì)——必須跨過膜的溶質(zhì)通過特定的膜蛋白轉(zhuǎn)運。這些轉(zhuǎn)運蛋白負(fù)責(zé)離子 梯度的產(chǎn)生和維持，營養(yǎng)物的攝取，代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的重攝取以及毒性和廢 棄化合物的清除。因此，在這種情況下，轉(zhuǎn)運蛋白是允許直接影響疾病相關(guān)性異常狀況的潛 在的藥物靶標(biāo)。人鈉/鈣交換體基因家族(亦稱為NCX或SLC8)包括三種截然不同的蛋白，NCXl、 NCX2 和 NCX3。SLC8 與 SLC24 —起構(gòu)成 Na+/Ca2+ 反向轉(zhuǎn)運蛋白(countertransporter)的超 家族。SLC24家族成員還轉(zhuǎn)運K+，亦稱為NCKX。NCXl是該家族中表征最充分的成員，在人衰竭性心臟中它的表達被上調(diào)，并在心 肌梗死后參與缺血-再灌注損傷(ischemia-r印erfusion damage)。抑制NCXl使衰竭性心 臟的心肌收縮性正?；?，并且在缺血再灌注后發(fā)揮心臟保護作用(Flesch等，Circulation 1996 ；Komuro 禾口 Ohtsuka，Journal of Pharmacological. Sciences. 2004)。 NCX2 主要在大 腦中表達，NCX3主要在大腦和骨骼肌中表達，其生理作用不詳。鈉/鈣交換體是從不同細胞中去除Ca2+的重要機制。在心臟中，它排除通過Ca2+ 通道進入的Ca2+引起收縮，同時使Na+進入心臟細胞。其在心血管疾病中的關(guān)聯(lián)性參見 例如 Hobai，JA 禾口 0’ Rourke，B (2004) Expert Opin. Investig. Drugs，13，653—664。因此， 制藥業(yè)已開發(fā)出抑制NCX的化合物，參見例如Iwamoto，Τ.等(2004) J. Biol. Chem.，279， 7544-7553。對于以相反方向移動的每個Ca2+，Na+/Ca2+交換體以產(chǎn)生電的方式轉(zhuǎn)運3_4個 Na+，例如Hinata，M.等(2002) J. Physiol. 545，453-461中的電生理學(xué)方法所示。NCX能夠 維持低于胞外Ca2+濃度([Ca2+]入)3-4個數(shù)量級的胞質(zhì)Ca2+濃度([Ca2+]出)。然而，凈 Ca2+轉(zhuǎn)運的方向取決于Na+的電化學(xué)梯度。有研究提出Na+和Ca2+轉(zhuǎn)運的同時轉(zhuǎn)運模型和 相繼轉(zhuǎn)運模型，大量證據(jù)支持后者。轉(zhuǎn)運蛋白是一個新興的靶標(biāo)家族，具有巨大的潛力，可提供科學(xué)和經(jīng)濟機會。另一 方面，就藥物開發(fā)技術(shù)而言轉(zhuǎn)運蛋白是困難的靶標(biāo)類別。鑒定例如通過阻斷鈣的流動和/或抑制鈣通道的活化來調(diào)節(jié)通道活性的化合物 是相當(dāng)有價值的。這樣做的一種標(biāo)準(zhǔn)方法是通過采用膜片鉗實驗。在這些實驗中，必須由技術(shù)嫻熟的操作人員，通過測量在響應(yīng)膜電位變化和/或試驗化合物應(yīng)用時跨越細胞膜的鈣流，依次個別地對細胞進行評價。研究了 Sea0400(NCX 的一種新的特異性抑制劑)對狗心室乳頭肌的動作電位的作用，參見K. Acsai在“2004年 ESC 大會，，期間發(fā)表于 Munich on Poster Nr. 2886 的文獻(標(biāo)題Effect of a specific sodium-calcium exchanger blocker Sea0400on the ventricular action potential and triggered activity in dog ventricular muscle and Purkinje fiber (特異j"生 內(nèi) _ f丐 交換體阻斷劑Sea0400對心室動作電位的作用和引發(fā)的狗心室肌和浦肯野纖維的活性)) 以及 C· Lee 等(The journal of pharmacology and experimental therapeutics ；第 311 卷748-757，2004 ；標(biāo)題！Inhibitory profile of SEA0400 [2-[4-[ (2, 5-Difluorophenyl) methoxy]phenoxy]-5-ethoxyaniline]assessed on the cardiac Na+/Ca2+exchanger， NCXl·l(評價SEA0400[2-[4-[(2，5-二氟苯基)甲氧基]苯氧基]_5_乙氧基苯胺]對心臟 NaVCa2+交換體NCX1. 1的抑制特征))。采用離子選擇電極技術(shù)定量測定巨膜片(giant patch)中離子流的研究表明，心 臟 Na+/Ca2+交換體具有多種轉(zhuǎn)運模式(Tong Mook Kang 和 Donald W. Hilgemann ；Nature ； % 427 2004 ^ 2 B 5 H ；豐示H :Multiple transport modes of the cardiac Na+/Ca2+ exchanger (心臟Na+/Ca2+交換體的多種轉(zhuǎn)運模式))。這些實驗雖然有效并提供大量信息，但卻非常耗時而且不適于對調(diào)節(jié)鈣離子通道 活性的化合物進行高通量測定。多種技術(shù)已發(fā)展成為電生理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法的備選方法。例如，已采用放射性流量 測定法(radioactive flux assay)，其中將細胞暴露于放射性示蹤物(例如45Ca)中并 監(jiān)測放射性標(biāo)記的Ca流量。將負(fù)載有示蹤物的細胞暴露于化合物中，增加或減少示蹤物 流出的那些化合物被鑒定為潛在的細胞膜離子通道的激活劑或抑制劑。一個具體實例 0β Τ. Kuramochi φ ；Bioorganic & Medicinal Chemistry ； 12 (2004) 5039-5056 ； feH Synthesis and structure-activity relationships of phenoxypyridine derivates as novel inhibitors of the sodium-calcium exchanger (作為 內(nèi) _ f丐交換體新型才IpfU齊[J的 苯氧基吡啶衍生物的合成和結(jié)構(gòu)_活性關(guān)系)。EP1031556公開了其中使用肌膜囊泡測定 NaVCa2+交換體活性的方法，通過測量45Ca的放射性來測定肌膜囊泡中Ca2+攝取的濃度。多種放射性離子轉(zhuǎn)運蛋白測定法的靈敏度有限，因此數(shù)據(jù)質(zhì)量不佳。另外，與放射 性篩選技術(shù)有關(guān)的成本和安全問題是妨礙廣泛應(yīng)用的障礙。在上述藥物開發(fā)技術(shù)中，應(yīng)用放射性流量測定法來鑒定調(diào)節(jié)離子通道和離子轉(zhuǎn)運 蛋白活性的化合物是與本發(fā)明最接近的現(xiàn)有技術(shù)，因為該技術(shù)可以通過監(jiān)測細胞的Ca2+流 量來將試驗化合物鑒定為潛在激活劑或抑制劑。放射性測定法的主要問題出在檢測每秒約1-1000個分子的離子轉(zhuǎn)運蛋白的周轉(zhuǎn) 受限(小于大多數(shù)離子通道的約104倍)的困難上。因此，由現(xiàn)有技術(shù)水平所產(chǎn)生的問題是確定在高通量篩選鈉/鈣交換體調(diào)節(jié)劑和 分析其特征方面具有極佳靈敏度和實用性的穩(wěn)健測定法。本發(fā)明提供了對此問題的解決方案。發(fā)明概述本發(fā)明的一個主題涉及用于測定鈉/鈣交換體活性的測定法，其中a)提供表達鈉/鈣交換體的細胞；
b)提供用于測定胞內(nèi)鈣的有色物質(zhì)；c)使細胞與鈉/鈣交換體激活劑接觸；和d)將來自所述有色物質(zhì)的發(fā)光信號中鈣介導(dǎo)的變化與對照實驗中產(chǎn)生的發(fā)光信 號相比較。本發(fā)明另一個主題涉及用于測定在響應(yīng)化合物的加入中鈉/鈣交換體的活性的 測定法，其中a)提供表達鈉/鈣交換體的細胞；b)提供用于測定胞內(nèi)鈣的有色物質(zhì)；c)使細胞與化合物接觸，其中所述細胞在用所述化合物處理前已經(jīng)過鈉/鈣交換 體激活劑處理；和d)將來自所述有色物質(zhì)的發(fā)光信號中鈣介導(dǎo)的變化與對照實驗中產(chǎn)生的發(fā)光信 號相比較。一般而言，所用鈉/鈣交換體來源于哺乳動物，特別來源于人。鈉/鈣交換體選自 下列鈉 / 鈣交換蛋白之一 NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6 和 / 或 NCX7，特別是 NCXl、 NCX2和/或NCX3 ；和/或選自下列鈉/鈣/鉀交換蛋白之一 NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4 禾口 / 或 NCKX5。一般而言，用于本發(fā)明測定法的細胞可來源于任何真核生物。在一個優(yōu)選的 實施方案中，細胞是哺乳動物細胞。在一個更優(yōu)選的實施方案中，細胞是CH0(CCL-61)、 HEK(CCL-1573)、C0S7(CRL-1651)和 / 或 JURKAT (CRL-1990)細胞。用于本發(fā)明測定法的鈉/鈣交換體激活劑特別為洛諾霉素(ionomycin)。在一個優(yōu)選的實施方案中，將作為染料前體的能夠進入細胞并能夠水解成染料 的所述有色物質(zhì)加入細胞中，從而染料與鈣在所述細胞中絡(luò)合并且發(fā)出發(fā)光信號。此外， 所述染料前體可優(yōu)選為乙酰氧基甲基酯衍生物，并且所述染料可優(yōu)選為鈣敏感熒光染料 fluo-4。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述發(fā)光信號是熒光，所述監(jiān)測步驟c)采用FLira
直ο本發(fā)明還涉及采用前述測定法檢驗化合物作為鈉/鈣交換體的激動劑或拮抗劑 的活性。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及采用前述測定法診斷與鈉/鈣交換體表 達發(fā)生改變有關(guān)的疾病。本發(fā)明還涉及包含以下組件試劑盒a)表達(expriming)鈉/鈣交換體的凍干細胞；b)有色物質(zhì)；c)化合物緩沖液；和d)有色物質(zhì)緩沖液。在本發(fā)明組件試劑盒的一個優(yōu)選的實施方案中，所述有色物質(zhì)是鈣敏感熒光染料 fluo-4。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所用的鈉/鈣交換體來源于哺乳動物，特別來源于 人。鈉/鈣交換體選自下列鈉/鈣交換蛋白之一 NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6和/ 或NCX7，特別是NCX1、NCX2和/或NCX3 ；和/或選自下列鈉/鈣/鉀交換蛋白之一 =NCKXl、 NCKX2、NCKX3、NCKX4 禾口 / 或 NCKX5。本發(fā)明還涉及采用前述組件試劑盒檢驗化合物作為鈉/鈣交換體的激動劑或拮抗劑的活性。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及采用前述組件試劑盒診斷與鈉/鈣 交換體表達發(fā)生改變有關(guān)的疾病。發(fā)明詳述術(shù)語“測定法”是指測定某一系統(tǒng)或?qū)ο蟮男再|(zhì)的方法。測定法是常用術(shù)語生物測定法的省略形式，并且是體外實驗的一種類型。通常進 行測定法以測量某一物質(zhì)對活生物體的作用。測定可以是定性或定量的，它們在新藥開發(fā) 中是必不可少的。主題測定法提供大的動態(tài)范圍(dynamic range)，使得可以測定鈉/鈣交換體的 活性。特別是本發(fā)明可提供快速有效的測定法，用于篩選與鈉/鈣交換體進行特異性相互 作用并調(diào)節(jié)其活性的藥學(xué)上有效的化合物并分析該化合物的特征。在本發(fā)明的情況中，術(shù)語“鈉/鈣交換體”或“NCX”可以是指下列Na+/Ca2+交換 蛋白中單獨或彼此組合的任一種NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6，NCX7 ；或者下列Na+/ Ca2VK+交換蛋白中單獨或彼此組合的任一種NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5。尤其優(yōu)選的是SLC8家族成員NCXl、NCX2和/或NCX3，其氨基酸序列分別對應(yīng)于 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO :3。這類鈉/鈣交換體可來源于任何脊椎動物，特別是哺乳動物物種(例如狗、馬、牛、 小鼠、大鼠、犬科動物、兔、雞、類人猿、人等)。鈉/鈣交換體可以從這類有脊椎生物的組織 探查物(probes)中分離，或者可以借助能夠表達鈉/鈣交換體的重組生物材料制備。術(shù)語“鈉/鈣交換蛋白”是指多肽、多態(tài)變體(polymorphic variant)、突變體和種 間同源物，其氨基酸序列優(yōu)選在至少約25、50、100、200個或500個以上氨基酸的區(qū)域內(nèi)與 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3中所含氨基酸序列相比有超過約80%氨基酸 序列同一性、85%、90%、優(yōu)選91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%以上氨 基酸序列同一性。術(shù)語“生物材料”是指含有遺傳信息和能夠自體復(fù)制或在生物系統(tǒng)中復(fù)制的任何 材料。重組生物材料是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組技術(shù)產(chǎn)生、改變或修飾的任何生物 材料。下列參考文獻是克隆特定NCX蛋白的實例Nicoll，D Α.等人克隆了犬Na+/Ca2+ 交換體NCXl (Science. 250(4980) :562_5，1990 ；標(biāo)題Molecular cloning and functional expression of the cardiac sarcoIemmalNa (+) -Ca2+exchanger (Na (+) -Ca2+ ^ 換體的分子克隆和功能性表達))。Komuro, I.等(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 89 (10), 4769-4773,1992 ； f 示 IS :Molecular cloning and characterization of the human cardiacNa+/Ca2+ exchanger cDNA (人心臟 Na+/Ca2+ 交換體 cDNA 的分子克隆與表征)) 和 Kofuji，P.等(Am. J. Physiol. 263 (Cell Physiol. 32) :C 1241-C 1249，1992 ；標(biāo)題 Expression of the Na-Ca exchanger in diverse tissues -.a study using the cloned human cardiac Na-Ca exchanger (不同組織中Na-Ca交換體的表達使用克隆的人心臟 Na-Ca交換體的研究))克隆了人NaVCa2+交換體NCXl。Li，Z.等人克隆了人Na+/Ca2+交換體 NCX2 (J. Biol. Chem. 269(26) 17434-9，1994 ；標(biāo)題Cloning of the NCX2 isoform of the plasma membrane Na(+)-Ca2+ exchanger (質(zhì)膜Na(+)_Ca2+交換體的NCX2 同種型的克隆))。 Nicoll，DA.等人克隆了大鼠 Na+/Ca2+交換體 NCX3(J. Biol. Chem. 271(40) :24914_21，1996 ；標(biāo)題Cloning of a third mammalian Na+/Ca2+ exchanger, NCX3 (第三型哺乳動物 Na+/ Ca2+交換體 NCX3 的克隆))。Gabellini，N.等人克隆了人 Na+/Ca2+交換體 NCX3 (Gene. 298 1_7，2002 ；標(biāo)題The human SLC8A3gene and the tissue-specific Na+/Ca2+exchanger 3isoforms (人SLC8A3基因和組織特異性Na+/Ca2+交換體3同種型))。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合體。 該術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物的 氨基酸聚合體，并適用于天然存在的氨基酸聚合體和非天然存在的氨基酸聚合體。術(shù)語“鈉/鈣交換體的活性”是指從細胞去除胞內(nèi)Ca2+的機制。在心臟中，它排除 通過Ca2+通道進入的Ca2+引起收縮，同時Na+進入心臟細胞。其在心血管疾病中的關(guān)聯(lián)性 參見例如 Hobai，JA 禾口 0’ Rourke，B (2004) Expert Opin. Investig. Drugs，13，653—664。因 此，制藥業(yè)已開發(fā)出抑制NCX的化合物，參見例如Iwamoto，Τ.等(2004) J. Biol. Chem.，279， 7544-7553。對于以相反方向移動的每個Ca2+，Na+/Ca2+交換體以產(chǎn)生電的方式轉(zhuǎn)運3_4個 Na+，例如Hinata，M.等(2002) J. Physiol. 545，453-461中的電生理學(xué)方法所示。NCX能夠 維持低于胞外Ca2+濃度([Ca2+]出)3-4個數(shù)量級的胞質(zhì)Ca2+濃度([Ca2+]入)。然而，凈 Ca2+轉(zhuǎn)運方向取決于Na+的電化學(xué)梯度。有研究提出Na+和Ca2+轉(zhuǎn)運的同時轉(zhuǎn)運模型和相 繼轉(zhuǎn)運模型，大量證據(jù)支持后者。通過測量合適的有色物質(zhì)與鈣絡(luò)合所產(chǎn)生的增強的發(fā)光， 來測定鈉/鈣交換體的活性。術(shù)語“表達鈉/鈣交換體的細胞”是指內(nèi)源性表達目標(biāo)交換體的細胞或重組細胞。當(dāng)提及例如細胞、或核酸、蛋白質(zhì)或載體時，術(shù)語“重組”是指通過導(dǎo)入異源核酸或 蛋白質(zhì)或者改變天然核酸或蛋白質(zhì)而被修飾的細胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體，或者所述細胞來 源于經(jīng)如此修飾的細胞。因此，例如重組細胞表達天然(非重組)形式的細胞內(nèi)不存在的 基因，或者表達異常表達、表達不足或根本不表達的天然基因。在本發(fā)明中，這通常是指用 編碼鈉/鈣交換體的核酸序列轉(zhuǎn)染的細胞。僅通過使細胞生長在有合適培養(yǎng)基的適當(dāng)容器中，便可進行該測定法。細胞可以 是天然存在的細胞、天然細胞、建立的細胞系、市售細胞、遺傳修飾的細胞等，只要細胞在測 定期間能夠維持，并且適宜在培養(yǎng)基中生長即可。用于進行主題測定法的合適細胞包括原核生物、酵母或高等真核細胞，尤其是哺 乳動物細胞。原核生物包括革蘭氏陰性生物和革蘭氏陽性生物。細胞一般可為哺乳動物 細胞，例如人細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、中國倉鼠細胞等。被認(rèn)為是合適的細胞包括CH0、 C0S7、JURKAT, HeLa, HEKs, MDCK 和 HEK293 細胞。細胞可以用眾所周知的方法制備(Current protocols in cell biology, John Wiley & Sons Inc，ISBN :0471241059)，或者可以購買(Invitrogen Corp.，Sigma-Aldrich Corp.，Stratagene)。術(shù)語“有色物質(zhì)”尤其是指鈣敏感熒光染料。染料前體的特征在于在測定條件下不發(fā)光，是一種酯，能夠進入細胞并且在胞內(nèi) 水解成發(fā)光的含氧化合物，而且與鈣絡(luò)合時發(fā)光增強。選擇易被胞內(nèi)水解酶水解的酯。術(shù)語“能夠進入細胞”是指前體能夠跨細胞膜并且在細胞中被水解，染料前體在特 定的PH、溫度等條件下進入細胞，以不同的速度進入細胞，或者在特定條件下不進入細胞。采用眾所周知的方案，將有色物質(zhì)加入細胞中(Current protocols in cellbiology, John Wiley & Sons Inc，ISBN :0471241059)。所使用的有色物質(zhì)是常用的市售試劑(Invitrogen Corp.)，并且可以使用在實驗 室合成的試劑。滿足上述要求的多種市售染料是已知的。用于監(jiān)測Ca2+的熒光染料是眾所周知 的，詳情可參見Molecular Probes目錄第20. 1-20. 4節(jié)，第9版。它們通常具有兩個與熒 光核(例如熒光素、羅丹明、香豆素、氨基苯基吲哚等)連接的雙-羧甲基氨基。該化合物 大部分是3，6_ 二氧基取代的咕噸，在前體中氧基是取代的，在發(fā)光染料中則是未取代的。 通常存在保護酚和酸的乙酰氧基甲基。參見例如Fluo3/4、Fura2/3、鈣熒光素綠(calcein green)等。乙?；乃猱a(chǎn)生發(fā)光產(chǎn)物。前體能夠跨過細胞膜并在細胞中水解。術(shù)語“發(fā)光，，是指“冷光”，光來自其它能量源，可發(fā)生在常溫和較低溫度下。在發(fā) 光時，一些能量源將原子的電子拋出其“基”(最低能量)態(tài)進入“激發(fā)”(較高能量)態(tài); 然后電子返還光形式的能量，因此可以回到其“基”態(tài)。有若干種發(fā)光類型，各自根據(jù)能量 源是什么或是什么引起發(fā)光而命名。術(shù)語“熒光”是指主要作為冷體(cold body)中的光學(xué)現(xiàn)象而存在的發(fā)光，其中分 子吸收光子引起發(fā)射出另一個具有較長波長的光子。吸收光子與發(fā)出光子之間的能量差以 分子振動或熱結(jié)束。通常吸收光子在紫外線區(qū)，發(fā)射光在可見區(qū)，但是這取決于具體熒光團 的吸光度曲線和斯托克司頻移。熒光以礦物熒石的名字命名，礦物熒石由通常具有這種現(xiàn) 象的氟化鈣組成?？捎冒l(fā)光計或熒光成像儀測量來自指示劑染料的熒光。一種優(yōu)選的檢測儀是 焚光成像讀板儀(Fluorometric Imaging Plate Reader, FLI PR) (Molecular Devices, Sunnyvale,Calif.)0 FLII3R非常適于應(yīng)用本發(fā)明方法的高通量篩選，因為它將能夠?qū)⑼瑫r 移液至微量滴定板的96孔或384孔的集成液體處理與采用與電荷耦合器件攝影機連接的 氬激光器進行快速動力學(xué)檢測結(jié)合在一起。使用鈣指示劑染料的一種備選方法是使用水母發(fā)光蛋白系統(tǒng)。水母發(fā)光蛋 白系統(tǒng)利用蛋白質(zhì)脫輔基水母發(fā)光蛋白(apoaequorin)，它與親脂性發(fā)色團腔腸素 (coelenterazine)結(jié)合，形成脫輔基水母發(fā)光蛋白與腔腸素的組合(稱為水母發(fā)光蛋白)。 脫輔基水母發(fā)光蛋白具有3個鈣結(jié)合部位，在鈣結(jié)合時，水母發(fā)光蛋白的脫輔基水母發(fā)光 蛋白部分的構(gòu)象發(fā)生改變。構(gòu)象的這種改變使腔腸素被氧化成coelenteramide、CO2和藍 光(466nm)的光子。可以使用合適的儀器檢測這種光子。有關(guān)使用水母發(fā)光蛋白的綜述可參見Cr6ton等，1999，Microscopy Research and Technique 46 :390_397 ；Brini 等，1995，J. Biol. Chem. 270 9896-9903 ；Knight 和 Knight, 1995，Meth. Cell. Biol. 49 :201_216。同樣有價值的可為美國專利第5，714，666號，它描述 了通過將腔腸素輔因子加入表達脫輔基水母發(fā)光蛋白的哺乳動物細胞中來測量哺乳動物 細胞的胞內(nèi)鈣的方法?！耙种苿笔抢缃Y(jié)合鈉/鈣交換蛋白、部分或完全阻斷其活性、降低、阻止鈉/鈣 交換蛋白的活性或表達、延遲鈉/鈣交換蛋白活化、使鈉/鈣交換蛋白失活、脫敏或者下調(diào) 鈉/鈣交換蛋白的活性或表達的化合物，例如拮抗劑。“激活劑”是增加、開啟、激活、促進鈉/鈣交換體活性、促進其活化、敏化、刺激或上 調(diào)鈉/鈣交換體活性的化合物。一種優(yōu)選的鈉/鈣交換體激活劑是洛諾霉素，一種源自密團鏈霉菌(Streptomyces conglobatus)的離子載體。抑制劑、激活劑或調(diào)節(jié)劑還包括鈉/鈣交換蛋白的遺傳修飾形式，例如活性發(fā)生 改變的形式，以及天然存在和合成的配體、拮抗劑、激動劑、肽、環(huán)肽、核酸、抗體、反義分子、 核酶、有機小分子等。術(shù)語“化合物”或“試驗化合物”或“試驗候選物(test candidate)”或其語法等 同術(shù)語是指將要被測定調(diào)節(jié)鈉/鈣交換體活性的能力的任何天然存在或合成的分子，例如 蛋白質(zhì)、寡肽、有機小分子、多糖、脂質(zhì)、脂肪酸、多核苷酸、寡核苷酸等(Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Inc, ISBN :0471250961)。試驗化合物可 以是試驗化合物文庫的形式，例如提供足夠多樣性范圍的組合文庫或隨機文庫(Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Inc，ISBN :0471250937)。試驗化合 物任選與融合配偶體連接，融合配偶體例如靶向化合物、拯救化合物(rescue compound)、 二聚化合物、穩(wěn)定化合物、可尋址化合物(addressable compound)和其它功能性部分。按 慣例，通過鑒定具有某些所需性質(zhì)或活性(例如活性升高)的試驗化合物(稱為“先導(dǎo)化合 物”)、產(chǎn)生先導(dǎo)化合物的變體以及評價這些變體化合物的性質(zhì)和活性，來產(chǎn)生具有有益性 質(zhì)的新的化學(xué)實體。優(yōu)選將高通量篩選(HTS)方法應(yīng)用于這類分析。在細胞生長后，所述抑制劑、激活劑和試驗化合物可通過注入培養(yǎng)基中而加入細 胞內(nèi)，或者它們可在細胞生長前就存在于培養(yǎng)基中(Current protocols in cell biology, John Wiley & Sons Inc, ISBN :0471241059)。細胞可以在抑制劑、激活劑和/或試驗化合物中生長到適當(dāng)數(shù)目，或者將抑制劑、 激活劑和/或試驗化合物加入其中使用而細胞沒有進一步生長。細胞可與抑制劑、激活劑 和/或試驗化合物結(jié)合，或者在將細胞置于孔中或使其在孔中生長的實施方案中，細胞可 以是懸浮在孔內(nèi)液體中的懸液細胞。術(shù)語“對照實驗”是指可以同時進行的不同類型的實驗。技術(shù)人員應(yīng)了解的是，與 本文所述方法一起進行對照實驗一般是有益的。例如，對于測定鈉/鈣交換體活性的測定法，具有對照通常是有益的，其中細胞優(yōu) 選與用于該測定法的細胞基本相同，不同之處在于這些細胞不會表達目標(biāo)鈉/鈣交換體。此外，對于測定在響應(yīng)化合物的加入中鈉/鈣交換體的活性的測定法，具有對照 通常是有益的，其中在本發(fā)明的測定法中檢驗化合物，所述化合物針對的是優(yōu)選與該測定 法中所用的細胞基本相同的細胞，不同之處在于這些細胞不表達目標(biāo)鈉/鈣交換體。這樣 可以確定通過所述測定法鑒定的化合物確實是通過目標(biāo)鈉/鈣交換體而不是通過某些意 料之外的非特異性機制起作用。這類對照細胞的一種可能性可以是非重組親本細胞，其中 實際實驗中的該細胞表達目標(biāo)鈉/鈣交換體。對于測定在響應(yīng)化合物的加入中鈉/鈣交換體的活性，用于該測定法的其它對照 可以是在不加入試驗化合物(低水平對照(low control))時進行所述測定法以及用高濃 度的試驗化合物(高水平對照(high control))進行所述測定法。其它類型的對照可包括將通過本發(fā)明的測定法鑒定的化合物作為目標(biāo)鈉/鈣交 換體的激動劑或拮抗劑，和用現(xiàn)有技術(shù)的方法測試這些化合物以證實這些化合物在所述現(xiàn) 有技術(shù)方法測試中同樣也是激動劑或拮抗劑。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解的是，還需要通過比較測定值與標(biāo)準(zhǔn)值來進行統(tǒng)計學(xué)分析。術(shù)語“激動劑”和“拮抗劑”是指通過受體調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體效應(yīng)分子。受體效 應(yīng)分子能夠與受體結(jié)合，但不一定在天然配體的結(jié)合部位。受體效應(yīng)子當(dāng)單獨使用時可調(diào) 節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，即可以替代配體，或者可以在天然配體存在下，通過天然配體提高或抑制信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)來改變信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如“拮抗劑”是阻斷或降低受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的分子，例如，它們 可以競爭性、非競爭性和/或變構(gòu)性地抑制來自受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而“激動劑”則增強、誘導(dǎo) 或提高受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。術(shù)語“與鈉/鈣交換體表達發(fā)生改變有關(guān)的疾病”是指擴張型心肌病、冠心病、心
律失常、心力衰竭等。為方便起見，有色物質(zhì)和測定法的其它組分可以試劑盒提供，其中有色物質(zhì)可作 為可復(fù)溶粉末存在，或者可作為冰浴中緩沖溶液的冷卻溶液存在。試劑盒還可包括緩沖液、 激活劑、抑制劑、試驗化合物、表達(expriming)鈉/鈣交換體的細胞等。細胞可作為凍干 細胞存在。所述組件試劑盒可以用作診斷試劑盒，用于診斷擴張型心肌病、冠心病、心律失
常、心力衰竭等。下列附圖
和實施例將更詳細地說明本發(fā)明，并披露了基于熒光的細胞鈉/鈣交換 體測定法的典型結(jié)果，但不限制保護的范圍。
實施例1.測定步驟試驗試劑下列化學(xué)試劑組成用作測定法的試劑
權(quán)利要求
一種用于測定鈉/鈣交換體活性的測定法，所述測定法包括e)提供表達鈉/鈣交換體的細胞；f)提供用于測定胞內(nèi)鈣的有色物質(zhì)；g)使細胞與鈉/鈣交換體激活劑接觸；和h)將鈣介導(dǎo)的來自所述有色物質(zhì)發(fā)光信號的變化與對照實驗中產(chǎn)生的發(fā)光信號進行比較。
2.權(quán)利要求1的測定法，其中所述鈉/鈣交換體是下列NCX蛋白NCX1、NCX2、NCX3；或 下列 NCKX 蛋白NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5。
3.權(quán)利要求1的測定法，其中所述鈉/鈣交換體是下列NCX蛋白NCX1、NCX2、NCX3。
4.權(quán)利要求1-3的測定法，其中所述鈉/鈣交換體來源于哺乳動物，優(yōu)選來源于大鼠、 小鼠、狗、牛、豬、猿或人。
5.權(quán)利要求1-4的測定法，其中所述細胞選自CH0、HEK、C0S7和JURKAT細胞。
6.權(quán)利要求1-5的測定法，其中將作為能夠進入細胞并能夠水解成染料的染料前體的 所述有色物質(zhì)加入細胞中，藉此所述染料與鈣在所述細胞中絡(luò)合并且發(fā)出發(fā)光信號。
7.權(quán)利要求1-6的測定法，其中所述發(fā)光信號是熒光，所述監(jiān)測步驟c)采用FLira裝置。
8.權(quán)利要求6的測定法，其中所述染料前體是乙酰氧基甲基酯衍生物。
9.權(quán)利要求6的測定法，其中所述染料是鈣敏感熒光染料fluo-4。
10.權(quán)利要求1-9的測定法，其中所述鈉/鈣交換體激活劑是洛諾霉素。
11.權(quán)利要求1-10的測定法在檢驗化合物作為鈉/鈣交換體的激動劑或拮抗劑的活性 中的用途。
12.權(quán)利要求1-10的測定法在診斷與鈉/鈣交換體表達發(fā)生改變有關(guān)的疾病中的用途。
13.一種用于測定在響應(yīng)化合物的加入中鈉/鈣交換體的活性的測定法，所述測定法 包括a)提供表達鈉/鈣交換體的細胞；b)提供用于測定胞內(nèi)鈣的有色物質(zhì)；c)使細胞與化合物接觸，其中所述細胞在用所述化合物處理前已經(jīng)過鈉/鈣交換體激 活劑處理；和d)將鈣介導(dǎo)的來自所述有色物質(zhì)發(fā)光信號的變化與對照實驗中產(chǎn)生的發(fā)光信號進行 比較。
14.權(quán)利要求13的測定法，其中所述鈉/鈣交換體是下列NCX蛋白NCX1、NCX2、NCX3； 或下列 NCKX 蛋白NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5。
15.權(quán)利要求13的測定法，其中所述鈉/鈣交換體是下列NCX蛋白NCX1、NCX2、NCX3。
16.權(quán)利要求13和15的測定法，其中所述鈉/鈣交換體來源于哺乳動物，優(yōu)選來源于 大鼠、小鼠、狗、牛、豬、猿或人。
17.權(quán)利要求13-16的測定法，其中所述細胞選自CH0、HEK、C0S7和JURKAT細胞。
18.權(quán)利要求13-17的測定法，其中將作為能夠進入細胞并能夠水解成染料的染料前 體的所述有色物質(zhì)加入細胞中，藉此染料與鈣在所述細胞中絡(luò)合并且發(fā)出發(fā)光信號。
19.權(quán)利要求13-18的測定法，其中所述發(fā)光信號是熒光，所述監(jiān)測步驟c)采用FLira裝置。
20.權(quán)利要求18的測定法，其中所述染料前體是乙酰氧基甲基酯衍生物。
21.權(quán)利要求18的測定法，其中所述染料是鈣敏感熒光染料fluo-4。
22.權(quán)利要求13-21的測定法，其中所述化合物是鈉/鈣交換體拮抗劑。
23.權(quán)利要求13-22的測定法，其中所述鈉/鈣交換體激活劑是洛諾霉素。
24.一種組件試劑盒，所述組件試劑盒包括a)表達(expriming)鈉/鈣交換體的凍干細胞；b)有色物質(zhì)；c)化合物緩沖液；和d)有色物質(zhì)緩沖液。
25.權(quán)利要求24的組件試劑盒，其中所述有色物質(zhì)是鈣敏感熒光染料fluo-4。
26.權(quán)利要求24和25的組件試劑盒，其中所述鈉/鈣交換體是下列NCX蛋白NCX1、 NCX2、NCX3 ；或下列 NCKX 蛋白NCKX1、NCKX2、NCKX3、NCKX4、NCKX5。
27.權(quán)利要求24-26的組件試劑盒，其中所述鈉/鈣交換體來源于哺乳動物，優(yōu)選來源 于大鼠、小鼠、狗、牛、豬、猿或人。
28.權(quán)利要求24-27的組件試劑盒在檢驗化合物作為鈉/鈣交換體的激動劑或拮抗劑 的活性中的用途。
29.權(quán)利要求24-27的組件試劑盒在診斷與鈉/鈣交換體表達發(fā)生改變有關(guān)的疾病中 的用途。
全文摘要
轉(zhuǎn)運蛋白是一個新興的靶標(biāo)家族，具有巨大的潛力，可提供科學(xué)和經(jīng)濟機會。鈉/鈣交換體是從不同細胞中去除Ca2+的重要機制。在心臟中，它排除通過Ca2+通道進入的Ca2+引起收縮，同時Na+進入心臟細胞。鑒定出調(diào)節(jié)鈉/鈣交換體活性的化合物是相當(dāng)有價值的。本發(fā)明涉及用于檢測NCX和NCKX“正向模式”調(diào)節(jié)化合物的基于熒光的測定法。本發(fā)明還涉及包含表達(expriming)鈉/鈣交換體的細胞的組件試劑盒，以及組件試劑盒在檢驗化合物作為鈉/鈣交換體的激動劑或拮抗劑的活性中的用途。
文檔編號G01N33/68GK101978271SQ200980110622
公開日2011年2月16日 申請日期2009年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月20日
發(fā)明者H·福勒特, M·胡格, S·蓋貝爾, T·利歇爾 申請人:賽諾菲-安萬特