專利名稱：熒光團化合物的制作方法
熒光團化合物相關在先申請本申請要求2008年4月3日提交的序列號為61/041923的美國臨時專利申請的 優(yōu)先權。就美國專利實踐而言，通過引用將該臨時申請整體并入本文。領域本文提供熒光團化合物。具體地，本文提供包括對甲氨基酚和若丹明、可用作熒光 標記(fluorescent label)和/或熒光探針(fluorogenic probe)的熒光團化合物。本文 還提供制備本文所公開的熒光團化合物的新穎而通用的方法。本文還提供示蹤、測量、檢測 或篩選生物物質(zhì)(biological species)的方法。背景在包括化學和生物學的許多領域，熒光技術受到的關注日益增多。在某些情況中， 熒光分子可用于檢測食品和環(huán)境樣品中是否存在分析物或化學品。在離體生化分析(如 DNA測序和血糖定量)中，需要一些靈敏的熒光定量檢測設備。在一些情況中，具有合適的 光化學性質(zhì)的熒光探針可用于示蹤活細胞中的分子和生理學事件，以及用于高通量篩選。 一般地，熒光技術比其他類型的光學測量更簡單，并可提供更高的靈敏度和更多的分子信 息。熒光測量一般是高度靈敏的，因為大多數(shù)化學和生物樣品中發(fā)現(xiàn)的熒光背景一般處于 低水平。隨著熒光儀器(如共焦和多光子熒光顯微鏡)領域最近取得的進展，細胞事件的 實時三維成像和生物物質(zhì)的實時動力學研究已經(jīng)變得可能。盡管有以上提及的優(yōu)點，但將熒光技術用于特定應用的可行性往往可受到適當熒 光分子的可利用性的限制。熒光分子一般包括熒光標記(或熒光示蹤劑)分子和熒光探針 (或熒光傳感器(fluorogenic sensor))分子，二者在其熒光性質(zhì)上有所不同。一般地，熒 光標記分子的熒光總是處于“開啟”狀態(tài)。熒光標記分子可用于示蹤生物物質(zhì)。相反，可通 過與某些分析物或化學品鍵合或反應來改變熒光探針分子的熒光性質(zhì)。因此，熒光探針分 子可用于示蹤、測量、檢測或篩選與熒光探針分子鍵合或反應的各種分析物或化學品。當用作熒光標記或熒光染料時，熒光標記分子需要與生物活性靶標(如蛋白質(zhì)、 DNA、酶、抗體、細胞器、細胞、組織、藥物、激素、核苷酸、核酸、多糖、脂質(zhì)或其他生物分子) 反應，得到所述靶標的熒光衍生物。可與生物活性靶標反應的可利用熒光標記分子的數(shù)目 一般是有限的。活性熒光素和若丹明衍生物是迄今為止最廣泛使用的熒光標記分子，因為 可通過常用光源(如氬激光(488nm和514nm線)和汞弧光燈(546nm線))將它們適當激 發(fā)。然而，它們具有一些可能使它們無法用于一些有用應用的不利性質(zhì)。例如，熒光素衍生 物可相對快速地被光漂白，而且可顯示依賴于PH的吸收性，這在等于或小于7的生理pH值 下導致熒光顯著減弱。另一方面，雖然相比于熒光素衍生物，若丹明衍生物對光相對穩(wěn)定， 且表現(xiàn)出發(fā)熒光對PH不敏感，但它們在水溶液中的量子產(chǎn)率低得多，而且與蛋白質(zhì)綴合時 進一步降低量子產(chǎn)率。此外，若丹明衍生物及其綴合物(conjugates)的低水溶性對包含若 丹明衍生物的熒光標記分子的制備和使用帶來困難。鑒于以上提及的熒光素和若丹明衍生物的不利性質(zhì)，對新的熒光標記分子存在需 求，所述新的熒光標記分子相對于熒光素和若丹明衍生物具有改進的性質(zhì)。一些對甲氨
9基酚或熒光素衍生物(如 Ioffe 等，J. Org. Chem. USSR 1965，1，326-336 ；Reynolds G. Α.， 美國專利第 3932415 號；Lee 等，Cytometry 1989，10，151-164 ；Haugland 等，美國專利第 5227487 號；Whitaker 等，Anal. Biochem. 1992，207，267-279 中所描述的那些)可用作另選 的(alternative)熒光標記分子，因為它們一般具有熒光素和若丹明的合意性質(zhì)。例如，它 們具有合意的吸收性質(zhì)，其熒光對生理范圍內(nèi)的PH和溶劑極性的敏感度低，具有高消光系 數(shù)、高量子產(chǎn)率、高光穩(wěn)定性，在各種溶劑中具有高溶解性。雖然對甲氨基酚熒光染料具有合意的性質(zhì)，但文獻很少報道它們作為熒光標記或 熒光探針的應用，這可能是因為對甲氨基酚化合物難以合成。一般地，制備對甲氨基酚熒光 團的關鍵合成步驟是在路易斯酸催化劑(如氯化鋅)或脫水酸的存在下，使取代或未取代 的間苯二酚與取代或未取代的6-?；?3-氨基苯酚縮合?；蛘?，可通過以下方式制備對甲 氨基酚熒光團在路易斯酸催化劑的存在下，使取代或未取代的氨基苯酚與取代或未取代 的4-?；?間苯二酚縮合。以上提及的一般合成方法一般具有產(chǎn)率低、純化工作繁瑣的缺 點。因此，需要開發(fā)更有效的合成方法，用于制備熒光團化合物，如對甲氨基酚熒光團。最近，用于不同靶標的熒光探針的開發(fā)遭遇瓶頸。這可能是因為大多數(shù)目前可利 用的熒光探針是根據(jù)經(jīng)驗而不是理性地開發(fā)，這可妨礙新的熒光探針的設計。盡管已經(jīng)報 道了 一些將理論方法應用于熒光探針設計的方法，但這些還遠遠不夠。另一種有效的方法 涉及熒光探針分子庫的組合合成。對甲氨基酚熒光團適合用作熒光探針庫，因為它們具有 以上所述的有利的光物理性質(zhì)。因此，還需要包括對甲氨基酚熒光團在內(nèi)的熒光團化合物 庫，它可通過新的有效合成方法容易地開發(fā)出來，用于制備本文所公開的熒光團化合物。概述本文提供熒光團化合物(如對甲氨基酚和若丹明熒光團)及其制備方法，所述熒 光團化合物可用作熒光標記和/或熒光探針，用于示蹤、測量、檢測或篩選生物物質(zhì)。一方面，本文提供制備式(III)或(VI)的熒光團化合物或其鹽的方法
(ΠΙ)或所述方法包含以下步驟(a)使式(I)或(IV)的化合物 分別與式B-X
的羥基活化劑反應，分別得到中間體(II)或(V)
權利要求
制備式(III)或(VI)的熒光團化合物或其鹽的方法所述方法包含以下步驟(a)使式(I)或(IV)的化合物分別與式B X’的羥基活化劑反應，分別得到中間體(II)或(V)以及(b)在鈀催化劑的存在下，使中間體(II)或(V)與式HXR1的親核試劑偶聯(lián)，分別形成式(III)或(VI)的熒光團化合物，其中OB是羥基活化基團；W1是O或S；W2是O A、S A或NR3R4；X是NR2、O或S；Y是O、S、Se、NR5或CR6R7；Z1是CR8或N；Z2是CR9R10或NR11；A是H、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、雜環(huán)基、氨基烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、羧基烷基、烷氧基羰基、?；?、氨基羰基、羥基保護基或反應性官能團；R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R9、R10和R11各自獨立地為H、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、雜環(huán)基、氨基烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、烷氧基、羧基烷基、烷基酰氨基、烷氧基酰氨基、磺酰基芳基、?；蚍磻怨倌軋F；或者CR9R10是式(VII)或(VUIa)的取代2 羧基苯基 C基團R8是H、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、雜環(huán)基、氨基烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、烷氧基、羧基烷基、烷基酰氨基、烷氧基酰氨基、磺酰基芳基、?；蚍磻怨倌軋F，或者具有式(VIIb)或(VIIc)K1、K2、K3、K4、K5、K6、K7、K8、K9和K10各自獨立地為H、鹵素、烷基、鹵代烷基、雜烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、烷芳基、雜環(huán)基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、羥基烷基、氨基烷基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、酰基氨基、羥基、硫代、硫代烷基、烷氧基、烷硫基、烷氧基烷基、芳氧基、芳基烷氧基、酰氧基、氰基、硝基、巰基、氨基甲?；?、三氟甲基、苯氧基、芐氧基、磺酰基、膦?；?、磺酸酯、磷酸酯、 C(＝O) P1或 C(＝O) Q P2；P1和P2各自獨立地為氫、鹵素、烷氧基、羥基、硫代、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、烷芳基、芳烷基、氨基甲酰氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、烷基芳基氨基、二芳基氨基、烷硫基、雜烷基或具有3 7個環(huán)原子的雜環(huán)基；以及Q是亞烷基、亞烯基、亞炔基、亞芳基、亞芳烷基或亞烷芳基。FPA00001234536400011.tif,FPA00001234536400012.tif,FPA00001234536400013.tif,FPA00001234536400021.tif,FPA00001234536400022.tif
2.權利要求1所述方法，其中所述熒光團化合物具有式(VIII)
3.權利要求1所述方法，其中所述熒光團化合物具有式(IX)
4.權利要求1所述方法，其中所述熒光團化合物具有式(XIII)
5.權利要求1所述方法，其中R1與R3相同，且R2與R4相同。
6.權利要求1-5中任一項所述方法，其中K1、K2、K3、K4、K5、K6、K7、K8、K9和K10各自獨立 地為H。
7.權利要求1-5中任一項所述方法，其中KH4HH和K10各自獨立地為H； 且K2和K5各自獨立地為氯或氟。
8.權利要求1-7中任一項所述方法，其中R1和R2是烷基。
9.權利要求1-7中任一項所述方法，其中R1和R2各自獨立地為甲基、乙基、丙基或丁基。
10.權利要求1-7中任一項所述方法，其中R1是氫，R2是烷基。
11.權利要求1-10中任一項所述方法，其中所述羥基活化基團是甲磺酰氧基、對甲苯 磺酰氧基、三氟甲磺酰氧基、九氟丁磺酰氧基、對硝基苯甲酰氧基或膦酰氧基。
12.權利要求1-10中任一項所述方法，其中所述羥基活化劑是甲磺酰鹵、三氟甲磺酰 鹵、甲苯磺酰鹵、九氟丁磺酰鹵、甲磺酸酐、三氟甲磺酸酐、甲苯磺酸酐、九氟丁磺酸酐或其 組合。
13.權利要求1-10中任一項所述方法，其中B是磺?；?、羧基或膦?；?br> 14.權利要求13所述方法，其中B是磺?；溥x自甲磺?；⑷谆酋；?、甲苯磺酰 基或九氟丁磺?；?。
15.權利要求1-14中任一項所述方法，其中所述親核試劑中的X是NR2，其中R1和R2各 自獨立地是H、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、雜烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、雜環(huán)基、氨基 烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、烷氧基、羧基烷基、烷基酰氨基、烷氧基酰氨基、磺?；蓟Ⅴ?基或反應性官能團。
16.權利要求1-15中任一項所述方法，其中所述鈀催化劑包含至少一種鈀源。
17.權利要求16所述方法，其中所述鈀源是乙酸鈀、三(二亞芐基丙酮)二鈀或其組口 O
18.權利要求1-16中任一項所述方法，其中所述鈀催化劑包含至少一種膦配體或卡賓 配體。
19.權利要求18所述方法，其中所述膦配體是外消旋_2，2’-雙(二苯基膦基)-1， 1，-聯(lián)二萘(BINAP)、1，1，_雙(二苯基膦基)二茂鐵((1 0、2-(二環(huán)己基膦基)聯(lián)苯、三 環(huán)己基膦、三苯基膦、三-叔丁基膦、9，9-二甲基-4，5-雙(二苯基膦基)咕噸(Xantphos)、 2- ( 二-叔丁基膦基)聯(lián)苯或外消旋-2- ( 二叔丁基膦基)-1，1’ _聯(lián)萘。
20.權利要求1-19中任一項所述方法，其中所述羥基保護基是芐氧基羰基、4-硝基芐氧基羰基、4-溴芐氧基羰基、4-甲氧基芐氧基羰基、甲氧基羰基、叔丁氧基羰基、異丙氧 基羰基、二苯基甲氧基羰基、2，2，2_三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基、 2-糠基氧基羰基、烯丙氧基羰基、乙?；?、甲酰基、氯乙?；?、三氟乙酰基、甲氧基乙酰基、芐 氧基乙?；⒈郊柞；⒓谆?、叔丁基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1，1-二甲 基-2-丙烯基、3-甲基-3- 丁烯基、烯丙基、芐基、對甲氧基芐基二苯基甲基、三苯基甲基 (三苯甲基)、四氫呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、芐氧基甲基、2，2，2_三氯乙氧基甲 基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺?；妆交酋；⑷谆坠柰榛?、三乙基 甲硅烷基或三異丙基甲硅烷基。
21.權利要求1-20中任一項所述方法，其中所述反應性官能團衍生自丙烯酰胺、酰疊 氮、酰鹵、腈、醛、酮、烷基鹵、烷基磺酸酯、酸酐、芳基鹵、炔、醇、胺、羧酸、碳二亞胺、重氮烷、 環(huán)氧化物、鹵代乙酰胺、羥胺、胼、亞氨酸酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺、磺酸酯或磺酰鹵。
22.式(VIII)的熒光團化合物或其鹽
23.式(XIII)的熒光團化合物或其鹽
24.權利要求23所述熒光團化合物，其中R1與R3相同，且R2與R4相同。
25.權利要求22-24中任一項所述熒光團化合物，其中K1、K2、K3、K4、K5、K6、K7、K8、K9和 Kltl各自獨立地為H。
26.權利要求22-25中任一項所述熒光團化合物，其中K1、K3、K4、K6、K7、K8、K9和Kltl各 自獨立地為H ；K2和K5各自獨立地為氯或氟。
27.權利要求22-26中任一項所述熒光團化合物，其中R1和R2各自為烷基。
28.權利要求22-27中任一項所述熒光團化合物，其中R1和R2各自獨立地為甲基、乙基、丙基或丁基。
29.權利要求22-28中任一項所述熒光團化合物，其中R1是氫，R2是烷基。
30.權利要求22-29中任一項所述熒光團化合物，其中所述反應性官能團衍生自丙烯 酰胺、酰疊氮、酰鹵、腈、醛、酮、烷基鹵、烷基磺酸酯、酸酐、芳基鹵、炔、醇、胺、羧酸、碳二亞 胺、重氮烷、環(huán)氧化物、商代乙酰胺、羥胺、胼、亞氨酸酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺、磺酸酯或 磺酰鹵。
31.權利要求22-30中任一項所述熒光團化合物，其中所述羥基保護基是芐氧基羰基、 4-硝基芐氧基羰基、4-溴芐氧基羰基、4-甲氧基芐氧基羰基、甲氧基羰基、叔丁氧基羰基、 異丙氧基羰基、二苯基甲氧基羰基、2，2，2_三氯乙氧基羰基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基 羰基、2-糠基氧基羰基、烯丙氧基羰基、乙?；⒓柞；⒙纫阴；?、三氟乙?；?、甲氧基乙酰 基、芐氧基乙?；?、苯甲?；⒓谆?、叔丁基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、1， 1- 二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3- 丁烯基、烯丙基、芐基、對甲氧基芐基二苯基甲基、三苯基甲基(三苯甲基)、四氫呋喃基、甲氧基甲基、甲基硫代甲基、芐氧基甲基、2，2，2-三氯乙氧 基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、甲磺?；?、對甲苯磺?；⑷谆坠柰榛?、三 乙基甲硅烷基或三異丙基甲硅烷基。
32.示蹤、檢測、測量或篩選生物物質(zhì)的方法，其中所述方法包含以下步驟a)使權利要求22-31中任一項所述熒光團化合物與所述生物物質(zhì)接觸，以形成熒光化 合物；以及b)測量所述熒光化合物的熒光性質(zhì)。
33.如權利要求32所述方法，其中所述生物物質(zhì)包括來自動物的蛋白質(zhì)、DNA、酶、抗 體、細胞器、細胞、組織、藥物、激素、核苷酸、核酸、多糖或脂質(zhì)。
34.權利要求32所述方法，其中所述動物是人。
35.示蹤或檢測樣品中的生物物質(zhì)的高通量熒光篩選方法，其中所述高通量方法包含 以下步驟a)使權利要求22-31中任一項所述熒光團化合物與所述樣品接觸，以形成一種或多種 熒光化合物；以及b)測量所述熒光化合物的熒光性質(zhì)，以確定所述樣品中生物物質(zhì)的量。
36.權利要求35所述方法，其中所述生物物質(zhì)包括來自動物的蛋白質(zhì)、DNA、酶、抗體、 細胞器、細胞、組織、藥物、激素、核苷酸、核酸、多糖或脂質(zhì)。
37.權利要求36所述方法，其中所述動物是人。
全文摘要
本文提供包括對甲氨基酚和若丹明化合物的可用作熒光標記和/或熒光探針的熒光團化合物及其制備方法。本文還提供可用來示蹤、測量、檢測或篩選生物物質(zhì)的方法，所述生物物質(zhì)如或有機體中的蛋白質(zhì)、DNA、酶、抗體、細胞器、細胞、組織、藥物、激素、核苷酸、核酸、多糖或脂質(zhì)。具體而言，所述方法包括以下步驟使本文所公開的熒光團化合物、對甲氨基酚化合物和若丹明化合物中的任何種與生物物質(zhì)接觸，以形成一種或多種熒光化合物，以及測量熒光化合物的熒光性質(zhì)。本文還提供用于檢測或篩選生物物質(zhì)的高通量熒光篩選方法。
文檔編號G01N21/77GK101983194SQ200980112496
公開日2011年3月2日 申請日期2009年4月3日 優(yōu)先權日2008年4月3日
發(fā)明者彭濤, 楊丹 申請人:港大科橋有限公司;晨興創(chuàng)投有限公司