專利名稱：利用紫外線放射對活細胞進行3d成像的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及光學(xué)層析成像系統(tǒng)，更具體地，涉及用于3D顯微鏡法的光學(xué)投 影層析，在所述3D顯微鏡中利用紫外線放射照射諸如生物細胞的微小對象來偽投影成像 和重建到3D圖像中。
背景技術(shù)：
納爾遜(Nelson)推動了使用光學(xué)層析對生物細胞成像的發(fā)展，例如在2003 年 2 月 18 日授權(quán)的、題為"Apparatus and method for imaging small objects in a flow stream using optical tomography" W^H^^J No. 6, 522, 775 ^Pfi7AJf ^i,
部公開內(nèi)容被作為參考而被整體合并于此。在福沃爾(Fauver)等于2003年11月18 日提交的美國專利申請?zhí)枮?0/716,744、并于2004年4月22日公開的美國公開號為 No. US-2004-0076319-A1 的、題為“Method and apparatus of shadowgram formation for optical tomography”的美國專利申請(福沃爾’ 744)以及福沃爾等于2006年9月18 日提交的美國專利申請?zhí)枮?1/532,648的、題為“Focal plane tracking for optical microtomography”的美國專利申請(福沃爾’ 648)中對該領(lǐng)域的進一步發(fā)展給出了啟示， 上述專利申請的全部公開內(nèi)容作為參考而被整體合并于此。光學(xué)層析系統(tǒng)中的處理從樣本準備開始。通常，從醫(yī)院或診所接收從患者那里采 下的樣本，處理該樣本以移除非診斷性要素，固定該樣本，然后對該樣本染色。被染色的樣 本然后與光學(xué)膠體混合，并被插入毛細管中，之后通過使用光學(xué)層析系統(tǒng)來生成樣本中對 象(諸如，細胞)的圖像。產(chǎn)生的圖像包括一組來自不同透視法的延伸景深的圖像，該圖像 被稱為“偽投影圖像”。這組偽投影圖像可以通過使用反向投影和濾光技術(shù)而被重建，以產(chǎn) 生感興趣的細胞的3D重建。在全部三維上具有等大的或大致相等的分辨率的能力在3D層 析細胞成像中是有利的，尤其是量化圖像分析中是有利的。然后，3D重建對于分析依然可用，從而能夠?qū)Ω信d趣的結(jié)構(gòu)、分子或分子探針進行 量化以及位置確定。諸如生物細胞的對象可以用至少一種染料或帶標簽的分子探針來標 記，且所測量的該生物標記的數(shù)量和位置可以產(chǎn)生關(guān)于細胞的疾病狀態(tài)的重要信息，包括 但不局限于諸如肺癌、乳癌、前列腺癌、子宮頸癌、胃癌和胰腺癌等各種癌癥。本公開允許將光學(xué)投影層析擴展至活細胞成像，并期望促進細胞分析、藥物開發(fā)、 個人化療法和相關(guān)領(lǐng)域。到目前為止，活細胞顯微鏡檢查傳統(tǒng)上是由非標記2D成像技術(shù)來 完成的，所述非標記2D成像技術(shù)為諸如相位對比、DIC和偏振對比顯微鏡法。通過使用250nm到290nm波長的深紫外線(DUV)來進行天然吸光(native absorbance)和熒光成像在技術(shù)上很有挑戰(zhàn)，并且在被放射的細胞中會造成光毒性反應(yīng)。最 近以來，已使用活體染料，該活體染料通常發(fā)射用于3D活細胞成像的熒光信號，因為商業(yè) 顯微鏡(共焦的、去卷積的和多光子激勵的多種種類的顯微鏡)依賴于熒光來創(chuàng)建用于生 成3D圖像的多個平面層。然而，在這種情況下，由一堆2D圖像形成的3D圖像在每個層內(nèi) 的縱向分辨率是橫向分辨率的大約四分之一，從而使得量化分析不精確。在全部三維上具有等大的或大致相等的分辨率的能力在3D層析細胞成像中是非常有利的，尤其是量化圖 像分析中是非常有利的。使用DUV照射活細胞的一個優(yōu)點是天然DNA和蛋白質(zhì)分別吸收260nm和280nm的 光，而不用使用任何必須滲入細胞膜和有時滲入細胞核膜(在非正常狀態(tài)下)的光化標簽。 而且，標簽或染料只是要測量目標蛋白質(zhì)或核苷酸(DNA)的中間步驟，這給該測量增加了 很大程度的可變性。排除這種外源物種將會潛在地改善蛋白質(zhì)或核苷酸(DNA)的量化測量 的準確性，而且通過排除樣品準備中的步驟能減少時間、經(jīng)歷和復(fù)雜性。不幸地，由于激發(fā) 強信號需要大劑量的放射，DUV照射的使用在過去表明存在光毒性反應(yīng)。最近，然而，展示了通過使用DUV發(fā)光二極管(LED)來在260nm和280nm下對的活 的培養(yǎng)的人和老鼠細胞進行DUV成像(例如參見2^1^11(1，8等的叩.燦(316化acid and protein mass mapping by live cell deep ultraviolet microscopy, "Nature Methods 4(7) :567-569(2007))。本公開描述了一種新的、新穎的和驚人有效的3D成像系統(tǒng)，該3D成像系統(tǒng)給細胞 尤其是活細胞的DUV 3D成像領(lǐng)域中的長期需要提供了解決方案。

發(fā)明內(nèi)容
提供了一種用于在光學(xué)層析系統(tǒng)中對細胞進行3D成像的方法，該方法包括將生 物對象相對于顯微鏡物鏡移動，以顯示變化的視角。利用具有波長局限于150nm到390nm 的光譜帶寬的光學(xué)放射來照射生物對象。利用相機感測穿過生物對象發(fā)送的、由生物對象 分散的或由生物對象間接發(fā)射的、并由顯微鏡物鏡采集的放射，以記錄多個不同視角的圖 像。根據(jù)所感測的放射來形成生物對象的多個偽投影圖像，并且重建多個偽投影，以形成細 胞的3D圖像。


圖1示意性顯示了用于在光學(xué)層析系統(tǒng)中利用紫外線放射對細胞進行3D成像的 系統(tǒng)的示例；圖2示意性顯示了用于在光學(xué)層析系統(tǒng)中通過使用UV相機和可選自適應(yīng)光學(xué)器 件、利用紫外線放射對細胞進行3D成像的系統(tǒng)的可替換的示例；圖3示意性顯示了用于光學(xué)層析系統(tǒng)的溫度控制的外殼的實施方式；圖4示意性顯示了在用于對細胞進行成像的軌道配置中使用的微流體盒的示例 的側(cè)視圖；圖5示意性顯示了在用于對細胞進行成像的軌道配置中使用的微流體盒的示例 的頂視圖；圖6示意性顯示了包括沿相同路徑的分開的成像階段的光學(xué)層析過程。在附圖中，相同的附圖標記指示 相似的元件或組件。附圖中元件的大小和相對位 置不必按比例繪制。例如，不同元件的形狀和角度沒有按比例繪制，且這些元件中的一些元 件被任意擴大和設(shè)置，以改善附圖的易理解性。而且，所繪制的元件的特定形狀不意在表達 關(guān)于特定元件的實際形狀的任意信息，而僅被選擇以便于附圖中的識別。
具體實施例方式
下面的公開描述了用于對感興趣對象進行成像的一些實施方式和系統(tǒng)。附圖中列 舉并描述了根據(jù)本發(fā)明的示例性實施方式的方法和系統(tǒng)的一些特征?？梢岳斫猓鶕?jù)本發(fā) 明的其他示例性實施方式的方法和系統(tǒng)可包括與圖中所示的程序和特征不同的另外的程 序和特征。示例性的實施方式在此針對生物細胞而被描述。然而，可以理解，這些示例性實 施方式是用于示出本發(fā)明的原理的目的，而不是限制本發(fā)明。另外，根據(jù)本發(fā)明的一些示例性實施方式的方法和系統(tǒng)可以不包括圖中所示的所 有特征。貫穿所有附圖，相似的附圖標記指示相似的或相同的組件或程序。除非上下文需要，否則貫穿下面的說明書和權(quán)利要求書，詞語“包括(comprise) ” 和其變換形式，諸如“包括(comprises) ”和“包括(comprising) ”是開放式包含的意思，和 “包含，但不局限于” 一樣。貫穿該說明書，所參考的“一個示例”或“示例性實施方式”、“一個實施方式”、“實 施方式”或這些術(shù)語的各種組合表示與實施方式結(jié)合起來描述的特定特征、結(jié)構(gòu)和特性包 括在本公開的至少一個實施方式中。從而，在本說明書的各處出現(xiàn)的短語“在一個實施方式 中”或“在實施方式中”不必都指相同的實施方式。而且，特定的特征、結(jié)構(gòu)或特性可以在一 個或多個實施方式中以合適的方式相結(jié)合。如在這里通常使用的，當在光學(xué)顯微鏡法過程的背景中使用時，下面的術(shù)語具有 下述意思“毛細管”具有其通常被接受的意思，并且意在包括透明微毛細管和具有通常500 微米或更小的內(nèi)徑的同等項。“景深”是沿光軸的長度，在所述光軸中，在產(chǎn)生特定特征的不可接受的圖像模糊 之前可以移動焦平面?！皩ο蟆敝竼蝹€細胞、項、物體或其他實體。“偽投影”包括表示大于光學(xué)器件的固有景深的范圍的采樣體積的單個圖像。在福 沃爾’ 744中講授了偽投影的概念?！皹颖尽北硎就ㄟ^單個測試或程序所獲得的來自單個患者的完整產(chǎn)物(例如，為分 析提交的痰、活組織檢查或鼻拭子)。樣本可以包括一個或多個對象。樣本診斷的結(jié)果成為 病例診斷的一部分?！皹悠贰敝笢蕚溆糜诜治龅囊淹瓿傻募毎苽淦罚ㄈ炕虿糠值确植糠只驑?本。關(guān)于活細胞的成像，該本公開中做出一些假設(shè)(1)細胞核中的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)要求 具有亞微米等大分辨率，這將光學(xué)放射的波長限制到高于紅外線的頻率(小于或等于近紅 外波長，< IOOOnm)，(2)單個細胞被成像或可能被分析，這可以允許以多個角度進行衍射 測量，以及(3)需要在最小細胞損害的情況下獲得成像后的細胞。現(xiàn)在參考圖1，示意性顯示了用于在光學(xué)層析系統(tǒng)11中對細胞進行3D成像的系 統(tǒng)，所述光學(xué)層析系統(tǒng)11采用紫外線放射。諸如毛細管、微毛細管或等同物的管22被設(shè)置 為由顯微鏡16觀察，所述顯微鏡16包括顯微鏡物鏡18和鏡筒透鏡元件52。旋轉(zhuǎn)機構(gòu)，例 如旋轉(zhuǎn)電機20被連接到管22上。軸向平移機構(gòu)，例如電機34，耦合到顯微鏡物鏡。放射源29被設(shè)置成照射包括保持于其內(nèi)的生物對象1的管22的部分。放射源29產(chǎn)生具有局限于150nm和390nm之間的波長的光譜帶寬的放射。在一個有用的示例中，放射源29包括 發(fā)射至少兩個選擇波長的多個源30、31，所述至少兩個選擇波長由第一光檢測器10和第二 光檢測器14同時檢測。可選濾光器12A、12B被選擇以阻止具有比UV限制的光譜帶寬長的 波長的熒光，例如天然色氨酸熒光，和/或增加不同的紫外線放射信號的分離。放射源可以 有利地被合并到計算機控制的光源及聚焦透鏡組件56中，該計算機控制的光源及聚焦透 鏡組件56還可以包括聚焦透鏡光學(xué)器件24、26、光擴散器28和放射源29。在一個示例性實施方式中，管22置于兩個光學(xué)平坦表面之間的可視區(qū)域中，所述 光學(xué)平坦表面諸如為標準顯微鏡載片23A和標準顯微鏡蓋玻片23B。在管22與顯微鏡載 片23A和蓋玻片23B之間的間隙由光學(xué)膠體32或諸如無機或有機油的等同材料填充，所述 光學(xué)膠體或等同材料具有還基本與管22、顯微鏡載片和蓋玻片匹配的折射率。管22本身 可以有利地由具有類似光學(xué)特性的油涂覆。管22的外徑可以例如是大約250微米。雖然 為了清楚而簡化附圖沒有示出，但是應(yīng)該理解，可使用折射率匹配的材料來匹配這里所述 的不同的實施方式中的光學(xué)器件。與在光學(xué)層析系統(tǒng)中使用的毛細管匹配的折射率η在例 如590nm時大約為1. 48，但色散曲線在UV中急劇上升。石英玻璃毛細管的估計折射率在 250nm時為1. 51，UV級石英玻璃的DUV透射比為大約90%。生物對象1有利地可以從包括細胞、活細胞、固定細胞、非固定細胞、冷凍細胞、解 凍細胞、干的細胞、克隆細胞、流式細胞、固定化細胞、包被細胞、細胞核、細胞部分、細胞器、 亞細胞成分、染色體和同等材料的組中選擇。光學(xué)層析成像系統(tǒng)11可以有利地利用具有從 生物對象激發(fā)天然熒光的頻率的照射放射，其中光檢測器和圖像處理器還包括用于測量所 激發(fā)的熒光的模塊。生物對象被包含于水相環(huán)境2中。水相環(huán)境2包括生理緩沖鹽水或下 面所述的其他溶液。分光器15被設(shè)置成將穿過生物對象發(fā)送的放射分離成至少兩種所選波長。分光 器可以有利地從由偏振光束分光器、沃拉斯頓棱鏡、雙折射元件、半鍍銀鏡、50/50強度分光 器、光學(xué)渡介質(zhì)鏡(dielectric optically coated mirror)、薄膜(pellicle film)、二向 色分光器、鏡子、棱鏡、衍射光學(xué)元件、光柵和同等物組成的組中選擇。第一光檢測器10被 設(shè)置成感測穿過生物對象1、顯微鏡物鏡18、分光器15和第一組可選濾光器12A發(fā)送的放 射。類似地，第二光檢測器14被設(shè)置成感測穿過生物對象1、顯微鏡物鏡18、分光器15和 第二組可選濾光器12B發(fā)送的放射。在一個示例中，第一和第二光檢測器10、14每個可以 特別包括對紫外光敏感的像素陣列檢測器，其中每個像素陣列檢測器被選擇以檢測兩個所 選波長中的不同的一個。計算機41包括圖像處理器40，該圖像處理器40被耦合以從第一和第二光檢測器 10、14接收數(shù)據(jù)。重建模塊42被耦合到圖像處理器40，其中重建模塊使用諸如在例如福沃 爾’ 744中教導(dǎo)的重建算法技術(shù)來處理數(shù)據(jù)以形成細胞的3D圖像。圖像處理器40將處理 后的圖像數(shù)據(jù)發(fā)送到3D圖像重建模塊42，該3D圖像重建模塊42可以有利地耦合到用于 操作者觀察的光學(xué)顯示器44。用戶界面46可以被提供以用于操作者控制和信息顯示的目 的。用戶界面46可以是耦合到計算機41的GUI界面等等。在一個示例中，軸向平移機構(gòu)34包括壓電式換能器或等同裝置。被連接以控制壓 電式換能器的控制器35可以有利地為計算機、計算機模塊等等，其中壓電式換能器被控制以在軸向移動物鏡透鏡18。在一個示例系統(tǒng)中，光學(xué)層析成像系統(tǒng)11被配置為通過使用濾光器和放射源并 通過使用限制在240nm和300nm之間的波長來對細胞成像。由第一檢測器10檢測的放射 可以具有主要在260nm和265nm之間的第一范圍內(nèi)的波長。由第二檢測器14檢測的放射 可以具有主要在280nm和285nm之間的第二范圍內(nèi)的波長。第一范圍用來提高DNA和RNA 的自然放射吸光率。第二范圍用來提高蛋白質(zhì)的自然放射吸光率。第一和第二波長范圍可 以使用一對放射源來提供，每個源發(fā)送兩個所選波長范圍中的一個波長范圍。檢測器中的 一個檢測器可以被調(diào)成檢測諸如DNA和蛋白質(zhì)的親水表面附近的大約270nm的吸光率。在一個實施方式中，放射可以通過使用時間按時間序列被測量以分離信號。放射 源可以按時間序列被脈沖激發(fā)，從而促使細胞脈沖激勵(以增加信噪比)以及信號分離。例 如，260nm的放射源可以在Ttl時刻被施加脈沖，隨后在T1時刻是280nm的脈沖，隨后在η個 隨后的時間增量Tn依次是一個或多個激光脈沖，其中η是指示隨后的時間點的任意數(shù)字?？商鎿Q地，天然色氨酸熒光可以被測量以獲得對蛋白質(zhì)的補充測量和其確認和成 分，諸如氨基酸。第三分光器可能是必需的，除非使用時間序列照射。在該可替換的設(shè)計 中，分光器15可以將所有的DUV光(240nm到300nm)分到DUV光檢測器14中，同時低頻熒 光信號可以被熒光檢測器10(> 300nm)檢測。DUV光源30、31的操作可以按時間序列，所 以主要由核苷酸進行的放射吸光(260-265nm)可以在Ttl時刻被采集，而主要由氨基酸進行 的放射吸光(280-285nm)可以在T1時刻使用相同的檢測器14被采集。在該示例中對濾光 器12A、12B的討論確保為在熒光檢測器前的設(shè)置是標準長通熒光發(fā)射濾光器，而在DUV檢 測器前的設(shè)置是DUV帶通濾光器或短通熒光阻擋濾光器。在又另一個示例中，激光以相對于物鏡透鏡光軸的斜角入射，阻擋非散射光并允 許對較高散射角的散射輪廓進行暗區(qū)域測量。使用可見波長的激光散射的一個示例可以從 T 2004^5 ^ 25 HgtX^B Rahn ^>H^j"Method and Apparatus for Three Dimensional Imaging in the Fourier Domain”的美國專利No. 6，741，730中找到，該專利作為參考而被 合并于此。在又另一個實施方式中，使用平行于光軸的激光照射。吸收材料盤位于物鏡的后 焦平面上。吸收器的直徑為只夠阻擋非散射和非常低角度的散射光那么大。最終的環(huán)孔徑 允許對較高散射角的散射輪廓進行暗區(qū)域測量。在又另一個實施方式中，對于對活細胞中的蛋白質(zhì)和/或DNA進行分子特定標記 而言，在標準亮區(qū)域發(fā)送模式(移除衍射分析)中使用活染料(吸光或熒光)或抗體/探 針，且在暗區(qū)域照射模式中使用納米粒子。在操作中，圖像重建模塊42確定重建的3D圖像中三維像素的大小。重建模塊42 還包括根據(jù)已知的軟件工程技術(shù)構(gòu)建的模塊，用于通過測量每個三維像素的吸光率來測量 吸收所述放射的分子的濃度。在一個有用的實施方式中，光學(xué)層析成像系統(tǒng)11使其本身很好地用于DUV吸光 成像。使用在260nm和280nm的具有20nm帶寬的LED允許簡單且高效的儀器而不需要感 光濾光器。聚焦光學(xué)器件56可以包括例如DUV聚焦透鏡(例如，來自德國的蔡司(Zeiss) 的UV-Kond型號)，且物鏡透鏡18可以包括諸如來自蔡司的100X、1. 25NA、超級熒光 (Ultrafluar)的透鏡、或諸如來自紐約羅徹斯特的光學(xué)技術(shù)公司(Optics Technologies,Inc.)的定制的265nm物鏡。為了在光到達UV靈敏C⑶相機之前阻擋周圍的光和熒光，濾光器12A、12B可以包括具有從250nm到290nm的帶通的帶通濾光器，諸如來自佛蒙特州布拉 特爾伯勒的可羅馬技術(shù)公司(Chroma Technology Corp.)或歐米茄光學(xué)(Omega Optical) 的帶通濾光器。有用的C⑶相機包括來自日本的索尼公司(Sony Corporation)的C⑶相 機、來自新澤西州特倫頓的普林斯頓儀器(Princeton Instruments)的PhotonMax型號相 機、或來自新澤西州普林斯頓的沙諾夫成像公司(Sarnoff Imaging)的設(shè)備?；罴毎上裢ǔＰ枰獦颖剧R臺和甘油、油或水浸物鏡透鏡可被溫控。為了從2D DUV成像轉(zhuǎn)換成3D細胞CT DUV成像，材料對于對直徑為50微米的微毛細管中的隔離細胞 進行成像所需要的短發(fā)送距離(光程長)而言必須是UV透明的。例如，細胞介質(zhì)應(yīng)該是 生理緩沖溶液，該生理緩沖溶液可以具有較高的折射率以幫助匹配細胞質(zhì)膜。對水溶液的 添加劑可以包括但不局限于聚乙二醇(PEG)、甘油、改良的或衍生的PEG和瓊脂糖凝膠。當 細胞基質(zhì)不能很好地與用于微毛細管的玻璃匹配時，則增加內(nèi)徑會減少在內(nèi)管壁的折射程 度。折射率應(yīng)該能夠與外管壁很好地匹配，因為不需要滿足(address)生物適應(yīng)性。然而， 當選擇轉(zhuǎn)動接點時，不發(fā)射信號波長范圍是250nm-290nm內(nèi)的熒光的材料應(yīng)該被考慮?，F(xiàn)在參考圖2，示意性示出了用于在光學(xué)層析系統(tǒng)中通過使用UV相機和可選自適 應(yīng)光學(xué)器件、利用紫外線放射來對細胞進行3D成像的系統(tǒng)的可替換示例。活細胞成像的需 要對水溶液和生理緩沖溶液進行了限制，從而對可以在細胞周圍使用的折射率的范圍進行 了限制。該圍繞細胞的和管內(nèi)的嵌入式介質(zhì)被認為具有與標準干浸或油浸顯微鏡物鏡的足 夠的折射率失配，從而在生成的圖像中引起像差?？梢葬槍μ囟ǖ某上裆疃然驈陌ㄉ?緩沖劑的細胞到物鏡透鏡的距離來設(shè)計對該折射率失配的補償。然而，即使低階球面像差 也隨著軸向深度上的變化而變化，所以光學(xué)波前畸變的動態(tài)補償對于穿過軸向深度進行成 像的顯微鏡而言有利的。動態(tài)畸變控制或補償技術(shù)涉及自適應(yīng)光學(xué)器件。用于這種動態(tài)像 差補償?shù)墓鈱W(xué)器件通常是空間光調(diào)制器或可變形薄膜鏡。由于穿過精密光學(xué)組件的DUV光 的非最佳發(fā)送特性，自適應(yīng)反射鏡是DUV顯微鏡中的優(yōu)選組件。用于對細胞進行3D成像的系統(tǒng)200包括多個組件，所述多個組件與根據(jù)圖1所述 的那些組件相同或相似。如上所述，管22被相對于顯微鏡物鏡18設(shè)置，以用于觀察感興趣 的對象1。如上所述，顯微鏡16包括物鏡透鏡18和鏡筒透鏡元件52。顯微鏡物鏡18沿著 光軸202對齊。與圖1中的系統(tǒng)對比，只有單個紫外線(UV)相機48被用于獲取感興趣的 對象的圖像。UV相機48也沿著光軸202對齊。介于UV相機48和鏡筒透鏡元件52之間的 是熒光阻擋濾光器50。如上所述，選擇熒光阻擋濾光器50以阻擋較長波長的熒光和/或增 加不同的紫外線放射信號的分離。水相環(huán)境2和感興趣的對象1可以造成在顯微鏡物鏡18與管22和光學(xué)膠體32或 等價物之間的足夠大的折射率失配，從而必須使用自適應(yīng)鏡54和相關(guān)的自適應(yīng)光學(xué)(AO) 控制器201，以減少與深度相關(guān)的圖像像差。該自適應(yīng)光學(xué)組件可以是位于放射源29、光 學(xué)元件27和聚焦透鏡24之間的光學(xué)元件。無論是未上電還是以恒定波前補償(2D)曲線 (profile)被供電，自適應(yīng)鏡54在光學(xué)系統(tǒng)中均變成靜態(tài)90度旋轉(zhuǎn)，這可以補償單個深度 水平。如上所述，來自UV相機48的圖像被發(fā)送到圖像處理器40。圖像處理器將處理后 的圖像數(shù)據(jù)發(fā)送到3D圖像重建模塊42，該3D圖像重建模塊42可以有利地被耦合到光學(xué)顯示器44以在需要時用于操作者觀察。用戶界面46被提供以用于操作者控制和顯示信息的 目的。用戶界面46可以是GUI界面等等。 現(xiàn)在參考圖3，示意性示出了用于光學(xué)層析系統(tǒng)的溫控外殼的實施方式。溫控外 殼300包含感興趣的對象，諸如生物細胞1，或其他生物材料被包含于管、毛細管或微毛細 管22中，所述管、毛細管或微毛細管22被相對于顯微鏡物鏡18設(shè)置。微毛細管22可被旋 轉(zhuǎn)電機20旋轉(zhuǎn)以允許微毛細管22內(nèi)的細胞1的被控旋轉(zhuǎn)運動21。細胞1和膠體32可以 在毛細管22內(nèi)被例如由注射器80施加的正壓力沿著水平軸推進。另一個電機34控制顯 微鏡物鏡18和鏡筒透鏡52的垂直軸向運動。微毛細管22被包住在光學(xué)膠體或折射率匹 配介質(zhì)32內(nèi)，并且微毛細管22是樣品-聚焦光組件56的一部分或在樣品_聚焦光組件56 的頂上。功率放大器60提供用于溫度控制器64的能量，所述溫度控制器64響應(yīng)于至少一 個傳感器74，并還可以用計算機和電子輸入端78管理，以將所需溫度維持在特定范圍內(nèi)， 諸如5到39攝氏度。然而，為了使功能維持到接近生理水平，諸如人的恒溫動物細胞需要嚴 格的溫度控制，即36攝氏度上/下0. 5攝氏度。對微流體條件以及溫度的管理便于保持細 胞活性(即，特別不穩(wěn)定的正?；虍惓５募毎┌Y前的細胞群體、癌癥的細胞群體、病毒 感染的細胞群體或其他病原細胞群體)。在一個示例中，三個傳感器74被設(shè)置在顯微鏡頭 16附近，和在微毛細管22上面和下面。用于空氣環(huán)流的可選內(nèi)部風(fēng)扇68存在于一些實施 方式中，以幫助溫度控制。帕爾帖(Peltier)熱電加熱器/冷卻器70可以遍及在系統(tǒng)中， 并且可以位于微毛細管22上面和下面，以提供用于細微的溫度控制的熱能。在特定的實施 方式中，帕爾帖(Peltier)加熱器/冷卻器70的其他位置也可能是有利的。位于圍繞顯微 鏡的腔室周圍的溫控水循環(huán)器或等價物附件可以作為熱電加熱器/冷卻器和風(fēng)扇的替換。 在一些實施方式中，大約35攝氏度到大約36攝氏度的溫度被使用，在其他實施方式中，更 高或更低的溫度可以便于研究特定的生化過程或用于在活著的細胞中使用特定試劑。上面詳細描述了光學(xué)層析系統(tǒng)，為了幫助理解本公開，現(xiàn)在將描述系統(tǒng)的操作。諸 如活著的細胞的生物對象1經(jīng)由注射器設(shè)備80而被注入微毛細管22中，在注射器設(shè)備80 中受壓的毛細流84將生物對象1移動到顯微鏡16的物鏡透鏡18下面的觀察窗口。至少 一個放射源29(例如，DUV和可見光)被設(shè)置以照射微毛細管22的一部分，所述微毛細管 22包括生物對象1。在一些實施方式中，大約260nm到280nm的放射波長被使用。放射穿 過光擴散器28和作為樣品-聚焦光組件56的一部分的聚焦透鏡組件24、26。集成的傳感 器74、溫度控制器64和風(fēng)扇68維持溫度，以維持和增加細胞存活度。系統(tǒng)允許多種變化來 研究限定的和被控的條件下的活著的細胞。上述的和別處的光學(xué)層析系統(tǒng)使用溫度控制和微流體以維持合適的條件，從而任 意活著的生物材料可以被檢查，所述生物材料包括但不局限于來自人體的細胞以及來自任 意其他物種的細胞。細胞或其他生物材料流過一個或多個管(例如，微毛細管)以便于成 像。在一些實施方式中，微毛細管22包括多個通道的直管?？梢岳斫?，在某些實施方式中， 光學(xué)層析系統(tǒng)可以被用于獲得細胞或亞細胞材料。在一些實施方式中，系統(tǒng)感測放射，該放射包括從包括在活著的細胞或在一些情 況中包括在非活著的細胞或其片段中的大分子復(fù)合物、核蛋白質(zhì)、DNA、RNA或蛋白質(zhì)傳出的 成像信號。包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)復(fù)合物成分的細胞可以用化學(xué)物質(zhì)、生物藥劑(該化學(xué)物質(zhì)或生物藥劑包括但不局限于生物上的活性分子、納米粒子、改良的納米粒子、微球體、 蛋白質(zhì)原始細胞、抗體、生物標記、細胞因子、其他核苷酸、其他蛋白質(zhì))處理，或者可替換 地，該細胞可以由顯微操作或其他處理(例如，轉(zhuǎn)染試劑、病毒、脂質(zhì)體等藥劑)在機械上操 作以在成像過程期間改變或便于分子攝入或影響其他細胞處理。生物或化學(xué)藥劑可以利用 發(fā)色團和熒光團而被標記或修改。實施方式還可以使用通過利用金、膠態(tài)金、鐵和氧化鐵來 進行標記而被修改的納米粒子、以及具有吸收(absorption)、熒光(fluorescence)和散射 (scattering)性質(zhì)的用作3D圖像或衍射圖案中的光學(xué)對比度機制的類似分子。除了發(fā)色 團和熒光團之外，納米粒子和微球體的使用可允許增強的3D對比度。例如，可以利用影響 細胞周期、細胞分化、傳染性、減少或增加病原性的藥劑來對細胞進行處理，或者還可以對 細胞進行進一步操作以改變亞細胞劃分。細胞表面生物標記、染色質(zhì)、其他細胞核蛋白質(zhì)或 大分子復(fù)合物的表示和顯示可以在這些處理中的所有或一些處理期間被檢查。在某些實施方式中，活著的細胞或其他生物材料可以用多個波長的放射來照射。 在這些情況下，細胞的多個偽投影圖像或?qū)斎雸D像進行計算機處理所形成的其他生物材 料可以通過使用比率成像技術(shù)來被處理。在一些實施方式中，比率成像包括根據(jù)大約260nm 到大約280nm的放射波長形成的圖像?？商鎿Q地，在一些情況下，包括但不局限于熒光和激光衍射的活細胞染色技術(shù)可 以被用于有助于獲得圖像?，F(xiàn)在參考圖4，示意性顯示了微流體盒400。旋轉(zhuǎn)電機20包括被耦合以旋轉(zhuǎn)皮帶 188的軸121，其中皮帶188的另一端被耦合以旋轉(zhuǎn)微毛細管22。微流體盒400利用正壓力 和負壓力120操作，以在滾道(raceway)中移動細胞，且利用第二通道504提供營養(yǎng)物和氧 氣、移除代謝廢料和允許藥物與生理緩沖劑中的細胞相互作用(這在圖5中進行了最好地 顯示)。軸承或摩擦器具92允許微毛細管22在諸如細胞的對象穿過管時旋轉(zhuǎn)。包括聚焦 照射組件56的顯微鏡位于盒附近，以沿著顯微鏡16的光軸查看對象?，F(xiàn)在參考圖5，示意性示出了用于對細胞成像的軌道(racetrack)配置中的微流 體盒的一個示例的頂視圖。微流體盒400耦合在流體軌道配置500中。該軌道配置包括沿 著包括光學(xué)窗口的物鏡透鏡的光軸的成像區(qū)116。還包括入口閥96、出口閥124和第一通 道502。第一通道502與第二通道504液體連通。通道可以例如用半滲透薄膜104而被接 合。通過使用帕爾帖加熱器/冷卻器元件或等價物，整個軌道被維持在關(guān)于圖3在此所述 的溫控環(huán)境中。在一些實施方式中，軌道和通道包括管道。需要用來維持細胞存活度的新鮮的營養(yǎng)物、氧氣、緩沖劑(pH、同滲容摩等)、可選 藥物等等可以通過被流向箭頭108指示的第二通道504來引入。然而，如果微流體條件是 對的，則細胞不會從旁邊移動，只會從軸向通過第一通道502，而滲濾允許諸如O2的新鮮營 養(yǎng)物、緩沖劑材料和代謝廢料移動，并之后沿著濃度梯度混合。在一個示例中，半滲透薄膜 104可以被接合的具有非急速平行流的通道代替，所述接合的通道允許小分子和溶液的滲 濾而將細胞維持在其微流體流的初始層流內(nèi)。生理范圍內(nèi)的切應(yīng)力在慢的流動速率下是可 能的，且通道幾何形態(tài)、液體黏性、溫度和細胞類型也起著作用。在操作中，細胞通過入口閥96被 注入到微流體盒400。槽(trough) 100用作旋轉(zhuǎn) 電機和用于當細胞通過管時旋轉(zhuǎn)微毛細管22的皮帶的外殼。正壓力和負壓力120被施加 以控制貫穿軌道的受壓流84。在成像后，出口閥124可以被用于通過流動的液體將選擇的細胞1引導(dǎo)到廢棄通道或用于獲得活細胞。 正被檢查的樣本可以是來自細針穿刺抽吸(FNA)的活體組織檢查。產(chǎn)生的活細胞 樣品可以被分入多個具有單獨的入口閥(未示出)的不同的軌道。每個子正被檢查的子樣 品可以接觸不同的藥物(諸如藥物A、藥物B、藥物組合A+B、和控制——非藥物)，且反應(yīng)可 以作為實時反饋來被監(jiān)控以用于患者的個人化藥物反應(yīng)。在一個示例中，軌道配置作為研究/藥物藥物研發(fā)儀器是有用的。在操作中，當以 3D成像時，活細胞可以在軌道中循環(huán)。樣品中的每個活細胞可以遭受化學(xué)和環(huán)境協(xié)定，且細 胞反應(yīng)中的小的改變可以指示所需細胞類型。變化是細胞凋亡、有絲分裂、壞死、分泌和其 他所規(guī)劃的細胞對刺激的反應(yīng)，其可以實時以高靈敏性被測量。當活細胞顯出所需的特性 時，該細胞可以被獲得。在2007年9月20日公開的、公開號為US 2007-0215528 Al、題為 "Cantilevered coaxial flow injector apparatus and method for sorting particles" 的哈延加(Hayenga)的共同待決美國專利申請中公開了一種這樣的獲得方法，該專利申請 的全部公開內(nèi)容被作為參考而被合并于此。在一些可替換的實施方式中，被標記的納米粒子(類似于標記有金或納米球體的 抗體/DNA)可以用于活細胞，以標記特定蛋白質(zhì)、染色質(zhì)和DNA。例如，金納米粒子或膠體金 均具有吸收和散射差異，并且能夠與活細胞不排斥。經(jīng)熒光標記的納米球體和微球體可以 具有作為3D圖像或衍射圖案中的光學(xué)對比度機制的吸收、熒光和散射。通過使用除了發(fā)色 團和熒光團之外的納米粒子，將允許第三對比度增強，所述第三對比度是散射。用于將散射 信號成像作為“黑色”背景或區(qū)域上的高對比度的方法為用光進行照射，該光以超過成像物 鏡的入射角的入射角來入射，從而只有信號散射被收集。該圖像與熒光成像的圖像類似，在 所述熒光成像的圖像中，照射光子從最終圖像中被剔除。在杜克大學(xué)進行過通過使用暗區(qū) 域顯微鏡方法進行活細胞2D成像，例如參見A ·柯里、W · L ·黃以及A ·韋克斯(2006)的 “Epiillumination through the microscope objective applied to dark-field imaging and microspectroscopy of nanoparticle interaction with cells in culture，，,Optics Express 14(14) :6535_65420衍射圖案測量是非成像技術(shù)，該非成像技術(shù)是對上面測量DNA、染色質(zhì)、蛋白質(zhì)和 其特定的標記增強的3D空間圖案的成像技術(shù)的補充。衍射的疾病特定識別標志可以在特 定的空間頻率處被找到，所述特定的空間頻率以從細胞的特定散射角被測量。由于來自激 光束的零階光的數(shù)量級大于來自活細胞的弱散射光，因此提出了細胞斜射照射技術(shù)，以大 大地減少零階光達到光學(xué)檢測器或相機。該技術(shù)與使用上面所述的使用納米粒子的暗區(qū)域 顯微鏡法類似。上述每個技術(shù)的示例也可以通過使用一些下面所述的一般概念而作為組合被實 施。然而，由于簡化和缺少在活細胞3D成像的發(fā)展階段期間的混淆變量，實驗室實施將會 最可能作為用于單獨的技術(shù)的示例而被完成。在下面會介紹組合多個成像和測量技術(shù)的一 些示例?，F(xiàn)在參考圖6，示出了包括沿相同路徑的分開的成像階段的光學(xué)層析過程。分開的 成像階段可以沿著相同路徑被處理，所述路徑諸如單個微毛細管。例如，可見光衍射分析和 細胞計數(shù)(coimting)602可以在第一階段611被完成，接下來是第二階段612的可見光成 像604。在使用活染料(live stain)進行成像的情況下，280nm吸收成像606可以在第三階段613進行，接下來是第四階段614的260nm吸收成像608。對于該示例性實施方式，在每個階段隨著細胞持續(xù)沿著單個旋轉(zhuǎn)毛細管向下移動，細胞應(yīng)該在有限的視野內(nèi)對齊。280nm 吸收成像包括用在大約275nm到285nm范圍內(nèi)的第一波長的DUV光照射對象1。260nm吸 收成像包括用在大約255nm到265nm范圍內(nèi)的第二波長的DUV光照射對象1。在另一個實施方式中，組合了一個或多個成像對比度機制(諸如，260nm和280nm 波長的吸收)的單個成像階段測量DUV吸收和天然熒光，或測量對于一個或多個活染料的 多于兩個可見波長的吸收。用于組合光學(xué)成像技術(shù)的組件能夠使用用于光束分離和組合的 多個光學(xué)組件(二向色或偏振分光器)，并可能使用多個相機?？商鎿Q地，如果多個激勵光 源按時間序列被脈沖激發(fā)，或濾光輪或?qū)嶋H源被物理移動、或按時間序列被關(guān)快門，則單個 相機和檢測路徑可以被使用。用于成像和測量的單個階段允許停止的細胞流動軸向傳送， 以用于精確地與視野對齊。在又另一個實施方式中，利用納米粒子散射體進行活細胞染料暗區(qū)域成像可以有 利地與利用激光進行細胞斜射照射相結(jié)合，以用于衍射圖案分析。該技術(shù)可以高速進行，并 且如果初始結(jié)果保證特定細胞的詳細3D圖像，則可以是較慢的和隨后的3D成像之前的初 始階段。在操作中，系統(tǒng)提供包括沿相同路徑的分開的成像階段的光學(xué)層析過程。多個生 物對象沿路徑25被傳送到第一階段611。多個對象中的至少一個對象在第一階段被可見光 照射以產(chǎn)生衍射圖案，并且該衍射圖案被光傳感器感測。通過使用計算機程序或等價物，衍 射圖案被分析以產(chǎn)生衍射分析。在第二階段612，至少一個對象1被可見光照射，且從該至 少一個對象傳出的可見光被感測以產(chǎn)生第一多個偽投影圖像。在第三階段613，至少一個 對象1被第一波長的DUV光照射，且從該至少一個對象傳出的第一波長的DUV光被感測以 產(chǎn)生第二多個偽投影圖像。在第四階段，至少一個對象被第二波長的DUV光照射，所述第二 波長的DUV光被感測以產(chǎn)生第三多個偽投影圖像?；趶牡谝?、第二和第三多個偽投影圖 像獲得的特征和衍射分析，多個對象可以被分選，或通過使用分選器610而被分類。該分選 器610可以是許多類型的傳統(tǒng)分類器中的任意類型的分類器，該分選器610通常嵌入裝載 于計算機中的軟件中，諸如統(tǒng)計分選器、自適應(yīng)分類器、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或等價物。在此相當詳細地描述了本發(fā)明，以符合專利法規(guī)，并給本領(lǐng)域的技術(shù)人員提供應(yīng) 用本發(fā)明的新穎概念以及組成和使用所需的那些示例性專用組件所需要的信息。然而，應(yīng) 該理解，本發(fā)明可以由特別不同的裝備和設(shè)備實施，并且在不脫離本發(fā)明的真正實質(zhì)和范 圍的前提下，可以完成對裝備細節(jié)和操作程序的各種修改。
權(quán)利要求
1.一種用于在光學(xué)層析系統(tǒng)(11)中對生物對象(1)進行3D成像的方法，所述方法包括相對于顯微鏡物鏡(18)移動生物對象(1)，以呈現(xiàn)變化的視角；利用具有波長局限于150nm與390nm之間的光譜帶寬的放射來照射生物對象(1)；利用紫外線相機(48)感測穿過所述生物對象(1)和所述顯微鏡物鏡(18)發(fā)送的放射；根據(jù)所感測的放射來形成所述生物對象(1)的多個偽投影圖像；以及 重建所述多個偽投影圖像，以形成3D圖像。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述光譜帶寬具有進一步局限于240nm與300nm 之間的波長。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述光譜帶寬具有進一步局限于260nm與265nm 之間的波長。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述光譜帶寬具有進一步局限于280nm與285nm 之間的波長。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物對象(1)選自由細胞、細胞部分、染色體、 活細胞、固定細胞、非固定細胞、冷凍細胞、解凍細胞、干的細胞、克隆細胞、細胞核、細胞器、 流式細胞、固定化細胞、脫氧核糖核酸(DNA)和蛋白質(zhì)組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述放射從所述生物對象(1)激發(fā)天然熒光，所述 方法進一步包括測量所激發(fā)的熒光。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所重建的3D圖像中的三維像素的大小是已知的， 所述方法進一步包括通過測量每個三維像素的吸光率來測量吸收所述放射的分子的濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物對象(1)被包含在水相環(huán)境(2)中。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述水相環(huán)境(2)包括生理緩沖鹽水。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物對象(1)包括活細胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所感測的放射包括從DNA傳出的成像信號。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所感測的放射包括從蛋白質(zhì)傳出的成像信號。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所感測的放射包括從親水表面?zhèn)鞒龅某上裥盘枴?br> 14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中照射所述生物對象(1)包括利用多個波長進行照射。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中形成細胞(1)的多個偽投影圖像包括通過使用比 率成像來處理圖像。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述比率成像包括根據(jù)范圍為從260nm到 285nm的波長而形成的圖像。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法進一步包括獲得細胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物對象(1)被保持在微毛細管(22)中。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物對象(1)位于管(22)內(nèi)，該管(22)被 配置為回收利用通過成像區(qū)域(116)的細胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述放射包括至少第一波長和第二波長，所述第 一波長和第二波長被選擇以增強DNA和蛋白質(zhì)中至少一者的天然放射吸光率。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述放射包括至少兩個選擇波長，所述至少兩個 選擇波長按時間序列被脈沖激發(fā)。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述放射包括至少兩個選擇波長。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括將穿過所述生物對象(1)發(fā)送的所述放 射分離成至少兩個選擇波長。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，所述方法進一步包括通過使用第一光檢測器(10)和 第二光檢測器(14)來感測所述至少兩個選擇波長，所述第一光檢測器(10)對第一波長敏 感，所述第二光檢測器(14)對第二波長敏感。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中分離放射包括通過分光器(15)來引導(dǎo)所述放射。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述分光器(15)選自由偏振光束分光器、沃拉 斯頓棱鏡、雙折射元件、半鍍銀鏡、50/50強度分光器、光學(xué)鍍介質(zhì)鏡、薄膜和二向色鏡像棱 鏡組成的組。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法進一步包括設(shè)置自適應(yīng)鏡(54)，以將所述放 射引導(dǎo)到所述顯微鏡物鏡(18)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，所述方法進一步包括通過利用自適應(yīng)光學(xué)控制器 (201)控制所述自適應(yīng)鏡(54)來減低與深度相關(guān)的圖像像差。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述自適應(yīng)鏡(54)選自由未上電自適應(yīng)鏡和以 恒定波前補償曲線被供電的自適應(yīng)鏡組成的組。
30.一種用于獲得3D圖像的光學(xué)層析系統(tǒng)(11)，該系統(tǒng)包括至少一個光學(xué)照射源(29)，該光學(xué)照射源(29)用于產(chǎn)生具有波長局限于150nm與 390nm之間的光譜帶寬的光；物鏡透鏡(18)，該物鏡透鏡(18)具有景深，且被定位以接收所述光；軸向平移機構(gòu)(34)，該軸向平移機構(gòu)(34)被耦合以使所述物鏡透鏡(18)在掃描范圍 之中平移，從而延長所述景深；傳送裝置，該傳送裝置適于當樣本呈現(xiàn)于所述掃描范圍內(nèi)時，呈現(xiàn)樣本的多個不同的 視圖；紫外線傳感器，該紫外線傳感器用于感測穿過所述物鏡透鏡(18)發(fā)送的光；圖像處理器(40)，該圖像處理器(40)被耦合以從所述傳感器接收數(shù)據(jù)；以及重建模塊(42)，該重建模塊(42)耦合到所述圖像處理器(40)，其中該重建模塊(42) 處理所述數(shù)據(jù)，以形成細胞的3D圖像。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述軸向平移機構(gòu)(34)包括壓電式換能
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述至少一個放射源(29)包括計算機控 制的光源及聚焦透鏡組件(56)。
33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述傳送裝置包括微毛細管(22)。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的系統(tǒng)(11)，其中計算機(41)被連接以控制所述壓電式換 能器，其中所述壓電式換能器沿軸向移動所述物鏡透鏡(18)，從而延長所述物鏡透鏡(18) 的景深。
35.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述光譜帶寬具有進一步局限于240nm與 300nm之間的波長。
36.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述光譜帶寬具有進一步局限于260nm與 265nm之間的波長。
37.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述光譜帶寬具有進一步局限于280nm與 285nm之間的波長。
38.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述生物對象(1)選自由細胞、細胞部分、 染色體、活細胞、固定細胞、非固定細胞、冷凍細胞、解凍細胞、干的細胞、克隆細胞、細胞核、 細胞器、流式細胞、固定化細胞、DNA和蛋白質(zhì)組成的組。
39.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述光從所述生物對象(1)激發(fā)天然熒光。
40.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所重建的3D圖像中的三維像素的大小是 已知的，所述系統(tǒng)進一步包括用于通過測量每個三維像素的吸光率來測量吸收所述放射的 分子的濃度的裝置。
41.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述傳送裝置將具有生物對象(1)的樣本 包含于水相環(huán)境(2)中。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的系統(tǒng)(11)，其中所述水相環(huán)境(2)包括生理緩沖鹽水。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的系統(tǒng)(11)，其中所述生物對象(1)包括活細胞。
44.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所感測的放射包括從DNA傳出的成像信號。
45.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所感測的光包括從蛋白質(zhì)傳出的成像信號。
46.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所感測的光包括從親水表面?zhèn)鞒龅某上裥盘枴?br> 47.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述至少一個光學(xué)照射源(29)生成具有 多個波長的光。
48.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述重建模塊(42)包括比率成像過程。
49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的系統(tǒng)(11)，其中所述比率成像過程包括根據(jù)范圍為從 260nm到280nm的波長而形成的圖像。
50.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述傳送裝置包括具有多個通道的直管 (22)。
51.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述紫外線傳感器(10)是紫外線像素陣 列檢測器。
52.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述光譜帶寬局限于被選擇以增強蛋白質(zhì) 的自然放射吸光率的波長。
53.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述至少一個光學(xué)照射源(29)包括以至 少兩個選擇波長發(fā)送的多個源(30)。
54.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述傳送裝置適于保持樣本，該樣本包括 選自由細胞、細胞部分、染色體、活細胞、固定細胞、非固定細胞、冷凍細胞、解凍細胞、干的細胞、克隆細胞、細胞核、細胞器、DNA和蛋白質(zhì)組成的組的生物對象(1)。
55.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述紫外線傳感器包括第一光檢測器(10)，該第一光檢測器(10)對具有第一波長的光敏感，且被設(shè)置成感測 穿過所述顯微鏡物鏡(18)的光；以及第二光檢測器(14)，該第二光檢測器(14)對具有第二波長的光敏感，且被設(shè)置成感測 穿過所述顯微鏡物鏡(18)的光，其中所述第一光檢測器(10)和所述第二光檢測器(14)沿 著交叉的光路徑被設(shè)置。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的系統(tǒng)(11)，其中所述第一波長和第二波長中的至少一者被 選擇以增強DNA的自然放射吸光率。
57.根據(jù)權(quán)利要求55所述的系統(tǒng)(11)，該系統(tǒng)進一步包括被設(shè)置成將穿過所述生物對 象(1)發(fā)送的放射分離成至少兩個選擇波長的分光器(15)，所述至少兩個選擇波長被分開 地發(fā)送到所述第一光檢測器(10)和所述第二光檢測器(14)。
58.根據(jù)權(quán)利要求55所述的系統(tǒng)(11)，其中所述第一光檢測器(10)包括CCD傳感器。
59.根據(jù)權(quán)利要求55所述的系統(tǒng)(11)，其中所述第一光檢測器(10)對具有與人體DNA 的自然吸光率匹配的波長的放射敏感。
60.根據(jù)權(quán)利要求55所述的系統(tǒng)，其中所述第二光檢測器對具有與蛋白質(zhì)的自然吸光 率匹配的波長的放射敏感。
61.根據(jù)權(quán)利要求55所述的系統(tǒng)(11)，其中所述第一光檢測器(10)對具有包括從親 水表面?zhèn)鞒龅某上裥盘柕牟ㄩL的放射敏感。
62.根據(jù)權(quán)利要求57所述的系統(tǒng)(11)，其中所述分光器(15)選自由偏振光束分光器、 沃拉斯頓棱鏡、雙折射元件、半鍍銀鏡、50/50強度分光器、光學(xué)鍍介質(zhì)鏡、薄膜和二向色鏡 像棱鏡組成的組。
63.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，該系統(tǒng)進一步包括介于所述紫外線傳感器和所 發(fā)送的放射之間的至少一個濾光器(12A)。
64.根據(jù)權(quán)利要求30所述的系統(tǒng)(11)，其中所述至少一個放射源(29)包括一組產(chǎn)生 不同波長的UV光源(30)。
65.一種用于在光學(xué)層析系統(tǒng)(11)中對活細胞進行3D成像的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括微流體盒(400)，該微流體盒(400)包括相對于顯微鏡物鏡(18)設(shè)置的管(22)和管 道回路(502)，該管道回路(502)具有耦合到入口閥(96)的第一端口、耦合到出口閥(124) 的第二端口、半滲透薄膜部分(104)、旋轉(zhuǎn)部分(22)和成像窗口(116)；其中所述旋轉(zhuǎn)部分(22)安裝在第一配件(92)和第二配件(92)之間，其中所述第一配 件(92)將所述旋轉(zhuǎn)部分(22)耦合到所述入口閥(96)，且所述第二配件(92)將所述旋轉(zhuǎn)部 分(22)耦合到所述出口閥(124)；旋轉(zhuǎn)機構(gòu)(20)，該旋轉(zhuǎn)機構(gòu)(20)連接到所述旋轉(zhuǎn)部分(22)；顯微鏡物鏡(18)，該顯微鏡物鏡(18)被定位以通過所述成像窗口(116)查看對象⑴；軸向平移機構(gòu)(34)，該軸向平移機構(gòu)(34)耦合到所述顯微鏡物鏡(18)；第二管道(504)，該第二管道(504)與半滲透薄膜(104)相接，其中該第二管道(504) 將營養(yǎng)物帶到所述管道回路(502)中，并將廢料產(chǎn)品帶出所述管道回路(502)；至少一個放射源(29)，該至少一個放射源(29)被設(shè)置成照射所述成像窗(116)，該成 像窗口(116)包括保持于該成像窗口內(nèi)的生物對象(1)，其中所述至少一個放射源(29)產(chǎn) 生具有波長局限于150nm與390nm之間的光譜帶寬的放射；至少一個傳感器，該至少一個傳感器被設(shè)置成感測穿過所述生物對象(1)和所述顯微 鏡物鏡(18)發(fā)送的放射；圖像處理器(40)，該圖像處理器(40)被耦合以從所述傳感器接收數(shù)據(jù)；以及重建模塊(42)，該重建模塊(42)耦合到所述圖像處理器(40)，其中該重建模塊(42) 處理所述數(shù)據(jù)，以形成所述生物對象(1)的3D圖像。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述營養(yǎng)物包括氧氣和緩沖劑。
67.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述軸向平移機構(gòu)(34)包括壓電式換能器。
68.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述至少一個放射源(29)包括計算機控制的光 源及聚焦透鏡組件(56)。
69.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中計算機(41)被連接以控制壓電式換能器，其中 該壓電式換能器沿軸向移動物鏡透鏡(18)，從而延長所述物鏡透鏡(18)的景深。
70.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述光譜帶寬具有進一步局限于240nm與 300nm之間的波長。
71.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述光譜帶寬具有進一步局限于260nm與 265nm之間的波長。
72.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述光譜帶寬具有進一步局限于280nm與 285nm之間的波長。
73.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述放射從所述活細胞激發(fā)天然熒光，所述系 統(tǒng)進一步包括測量所激發(fā)的熒光。
74.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所重建的3D圖像中的三維像素的大小是已知 的，重建裝置(42)進一步包括用于通過測量每個三維像素的吸光率來測量吸收所述放射 的分子的濃度的裝置。
75.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述生物對象(1)包括活細胞。
76.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述微流體盒(400)被包含于溫控水相環(huán)境 (2)中。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的系統(tǒng)，其中所述水相環(huán)境(2)包括生理緩沖鹽水。
78.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所感測的放射包括從DNA傳出的成像信號。
79.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所感測的放射包括從蛋白質(zhì)傳出的成像信號。
80.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所感測的放射包括從親水表面?zhèn)鞒龅某上裥盘枴?br> 81.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所產(chǎn)生的放射包括多個波長。
82.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述重建模塊(42)通過使用比率成像來處理所 述數(shù)據(jù)。
83.根據(jù)權(quán)利要求82所述的系統(tǒng)，其中所述比率成像包括根據(jù)范圍為從260nm到 280nm的波長而形成的圖像。
84.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述至少一個放射源(29)包括多個源(30)，該多個源(30)用于產(chǎn)生至少第一選擇波長和第二選擇波長，該第一選擇波長和第二選擇波 長被選擇以增強DNA的自然放射吸光率。
85.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述光譜帶寬局限于被選擇以增強蛋白質(zhì)的自 然放射吸光率的波長。
86.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述至少一個放射源(29)包括多個源(30)，該 多個源(30)發(fā)送至少兩個選擇波長，該至少兩個選擇波長按時間序列被脈沖激發(fā)。
87.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述至少一個放射源(29)包括多個源(30)，該 多個源(30)發(fā)送至少兩個選擇波長。
88.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述傳感器是紫外線像素陣列檢測器。
89.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括分光器(15)，該分光器(15)被設(shè)置成將 放射分離成至少兩個選擇波長。
90.根據(jù)權(quán)利要求89所述的系統(tǒng)，其中所述分光器(15)選自由偏振光束分光器、沃拉 斯頓棱鏡、雙折射元件、半鍍銀鏡、50/50強度分光器、光學(xué)鍍介質(zhì)鏡、薄膜和二向色鏡像棱 鏡組成的組。
91.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述至少一個傳感器包括第一光檢測器(10)，該第一光檢測器(10)被設(shè)置成接收具有第一波長的光；以及 第二光檢測器(14)，該第二光檢測器(14)對第二波長敏感，且被設(shè)置成接收具有所述 第二波長的光。
92.根據(jù)權(quán)利要求91所述的系統(tǒng)，其中所述第一光檢測器(10)對具有與人體DNA的自 然吸光率匹配的波長的放射敏感。
93.根據(jù)權(quán)利要求91所述的系統(tǒng)，其中所述第二光檢測器(14)對具有與蛋白質(zhì)的自然 吸光率匹配的波長的放射敏感。
94.根據(jù)權(quán)利要求91所述的系統(tǒng)，其中所述第一光檢測器(10)對具有包括從親水表面 傳出的成像信號的波長的放射敏感。
95.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，該系統(tǒng)進一步包括介于所述至少一個傳感器和所發(fā) 送的放射之間的至少一個濾光器(12A)。
96.根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng)，其中所述微流體盒(400)和第二管道封閉在溫控環(huán) 境(300)中。
97.一種包括沿相同路徑(25)的分開的成像階段的光學(xué)層析方法，該方法包括 沿路徑(25)將多個生物對象(1)傳送到第一階段(611)；在第一階段(611)，利用可見光照射所述多個對象(1)中的至少一個對象(1)，以產(chǎn)生 衍射圖案；感測所述衍射圖案；分析所述衍射圖案，以產(chǎn)生衍射分析(602)；在第二階段(612)，利用可見光照射(604)所述至少一個對象(1)；感測從所述至少一個對象(1)傳出的可見光，以產(chǎn)生第一多個偽投影圖像；在第三階段(613)，利用第一波長的DUV光照射所述至少一個對象；感測從所述至少一個對象(1)傳出的第一波長的DUV光，以產(chǎn)生第二多個偽投影圖像；在第四階段(614)，利用第二波長的DUV光照射所述至少一個對象；感測從所述至少一個對象(1)傳出的第二波長的DUV光，以產(chǎn)生第三多個偽投影圖像；響應(yīng)于所述第一多個偽投影圖像、第二多個偽投影圖像和第三多個偽投影圖像和所述 衍射分析(602)，分選所述至少一個對象(1)。
98.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，該方法進一步包括對所述生物對象(1)進行計數(shù)。
99.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中所述多個生物對象(1)包括活細胞。
100.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中第一波長的所述DUV光在255nm-265nm的范圍內(nèi)。
101.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中第二波長的所述DUV光在275nm-285nm的范圍內(nèi)。
102.根據(jù)權(quán)利要求97所述的方法，其中所述衍射圖案進一步包括暗區(qū)域成像圖案。
全文摘要
一種用于在光學(xué)層析系統(tǒng)(11)中對生物對象(1)進行3D成像的方法，該方法包括相對于顯微鏡物鏡(18)移動生物對象(1)，以呈現(xiàn)變化的視角。利用具有波長局限于150nm與390nm之間的光譜帶寬的放射來照射所述生物對象(1)。利用相機(48)從多個不同的視角感測穿過所述生物對象(1)和所述顯微鏡物鏡(18)發(fā)送的放射。根據(jù)所感測的放射來形成所述生物對象(1)的多個偽投影圖像，并重建該多個偽投影圖像，以形成細胞的3D圖像。
文檔編號G01B15/04GK102007369SQ200980113019
公開日2011年4月6日 申請日期2009年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月18日
發(fā)明者A·C·尼爾森, E·J·賽貝爾, J·R·拉恩, M·E·福韋 申請人:維森蓋特有限公司