專利名稱：：基于免疫的血清型a肉毒桿菌毒素活性測(cè)定的制作方法基于免疫的血清型A肉毒桿菌毒素活性測(cè)定本專利申請(qǐng)根據(jù)35U.S.C.§119(e)，要求以2008年3月14日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)No.61/036，723作為優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)，該臨時(shí)申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容均以援引的方式納入本文。梭菌毒素-例如肉毒神經(jīng)毒素(BoNT)BoNT/A、BoNT/B、BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G以及破傷風(fēng)神經(jīng)毒素(TeNT)——抑制神經(jīng)元傳遞的能力已經(jīng)被用于多種治療和美容用途，參見例如，WilliamJ.Lipham,CosmeticandClinicalApplicationsofBotulinumToxin(Slack、he.，2004)。市售的梭菌毒素藥物組合物包括BoNT/A制劑，例如，BOTOX(Allergan,Inc.，Irvine,CA),DYSPORT/RELOXIN(IpsenLtd.，Slough,England)>PURTOX(MentorCorp.，SantaBarbara,CA)>XEOMIN(MerzPharmaceuticals,GmbH.,Frankfurt,Germany)、NEURONOX(Medy-Tox,Inc.,Ochang-myeon,SouthKorea)禾口BTX-A(Biogen-techLtd.,University,Yantai,Shandong,China)；以及BoNT/B制劑，例如MYOBLOC/NEUROBLOC(SolsticeNeurosciences,Inc.,SouthSanFrancisco,CA)。例如，BOTOX目前已被美國批準(zhǔn)用于在成年人中治療頸肌張力障礙以減輕與頸肌張力障礙有關(guān)的異常頭位和頸痛的嚴(yán)重度；用于治療外用劑不恰當(dāng)處理的嚴(yán)重原發(fā)性腋部多汗癥；以及用于治療與張力障礙相關(guān)的斜視和瞼痙攣，包括年齡在12歲和以上的患者中的良性原發(fā)性瞼痙攣或VII神經(jīng)病癥。現(xiàn)在，一種致死試驗(yàn)小鼠LD5tl生物測(cè)定仍是所有藥物制造商用于表示其制劑效能的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。S.S.Arnonetal.，JAMA2851059-1070(2001)。事實(shí)上，藥物制劑標(biāo)簽上的單位是小鼠LD5tl單位，并且產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)可用的LD5tl數(shù)據(jù)需要的動(dòng)物數(shù)目是很大的。小鼠LD5tl生物測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)是，它測(cè)量對(duì)肉毒毒素?cái)z取(例如，毒素結(jié)合于細(xì)胞表面受體、毒素-受體復(fù)合體內(nèi)化、輕鏈易位至細(xì)胞質(zhì)、底物的輕鏈剪切)所必需的所有步驟，而不只是對(duì)此中毒過程的一部分測(cè)定活性，例如僅測(cè)量輕鏈酶活的體外測(cè)定。不幸的是，小鼠LD5tl生物測(cè)定有許多缺點(diǎn)，包括由于需要大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所導(dǎo)致的高操作成本，因?yàn)樗蠦oNT血清型都會(huì)引起相同的可測(cè)量終點(diǎn)而造成的無特異性，以及如果不使用大量動(dòng)物的不準(zhǔn)確的可能性。另外，動(dòng)物權(quán)利組織已經(jīng)向美國(FDA/NICEATM/ICCVAM)和歐洲(MHRA和EDQM)的監(jiān)管機(jī)構(gòu)以及制造肉毒神經(jīng)毒素制品的制藥公司施壓，以減少動(dòng)物試驗(yàn)并且——更重要地——替換用于產(chǎn)品發(fā)布的小鼠LD5tl生物測(cè)定。監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求制藥公司將三“R”原則應(yīng)用于肉毒桿菌神經(jīng)毒素的效能試驗(yàn)減少(Reduce)、精簡(jiǎn)(Refine)、替換(R印lace)。D.Straughan，ProgressinApplyingtheThreeRstothePotencyTestingofBotulinumToxinTypeA，Altern.Lab.Anim.34(3):305-313(2006)。在最近幾年中，已經(jīng)采取了數(shù)項(xiàng)措施來減少和精簡(jiǎn)小鼠LD5tl生物測(cè)定，目的是標(biāo)準(zhǔn)化方案以及在每次測(cè)定中使用更少的動(dòng)物產(chǎn)生更一致的數(shù)據(jù)。因此，可以評(píng)估肉毒桿菌毒素?cái)z取中必需的所有步驟的完整性的簡(jiǎn)單、可靠、經(jīng)驗(yàn)證且政府機(jī)構(gòu)可接受的肉毒毒素活性測(cè)定將會(huì)有重要價(jià)值，因?yàn)檫@種不基于動(dòng)物的測(cè)定將減少對(duì)動(dòng)物試驗(yàn)的需求以及與這類基于動(dòng)物的測(cè)定相關(guān)的所有缺點(diǎn)、成本和倫理問題。本說明書提供了測(cè)定可用于在多個(gè)產(chǎn)業(yè)例如制藥業(yè)和食品工業(yè)中的肉毒桿菌毒素A的活性的新型組合物、細(xì)胞和方法，并且還提供了相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。這些組合物、細(xì)胞和方法不使用活動(dòng)物或者取自活動(dòng)物的組織，但能夠評(píng)估對(duì)神經(jīng)毒素作用所必需的所有步驟。圖1為中樞和周圍神經(jīng)元中的神經(jīng)遞質(zhì)釋放和梭菌毒素中毒的現(xiàn)行范例的示意圖。圖IA為中樞和周圍神經(jīng)元中的神經(jīng)遞質(zhì)釋放機(jī)制的示意圖。所述釋放過程可被描述為包括兩個(gè)步驟1)囊泡?？?，其中含有神經(jīng)遞質(zhì)分子的囊泡上的與囊泡結(jié)合的SNARE蛋白和位于質(zhì)膜上的與膜結(jié)合的SNARE蛋白相結(jié)合；和2)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，其中囊泡與質(zhì)膜相融合并以胞吐方式釋放神經(jīng)遞質(zhì)分子。圖IB為破傷風(fēng)毒素和肉毒毒素在中樞和周圍神經(jīng)元中活動(dòng)的中毒機(jī)制的示意圖。這一中毒過程可被描述為包括四個(gè)步驟1)受體結(jié)合，其中梭菌毒素與梭菌受體復(fù)合體相結(jié)合并啟動(dòng)中毒過程；幻復(fù)合體內(nèi)化，其中在毒素結(jié)合之后，含有毒素/受體系統(tǒng)復(fù)合體的囊泡被胞吞至細(xì)胞內(nèi)；幻輕鏈易位，其中認(rèn)為發(fā)生了多個(gè)事件，包括囊泡內(nèi)部PH的改變、包含梭菌毒素重鏈的Hn結(jié)構(gòu)域的通道孔的形成、梭菌毒素輕鏈和重鏈的分離以及輕鏈的釋放；和4)酶促靶標(biāo)修飾，其中梭菌毒素的輕鏈對(duì)其靶標(biāo)SNARE底物(例如SNAP-25、VAMP或突觸融合蛋白)進(jìn)行蛋白酶解剪切，由此阻止囊泡?？亢蜕窠?jīng)遞質(zhì)釋放。圖2示出了通過蛋白質(zhì)印跡分析對(duì)4種細(xì)胞系中的BoNT/A攝取的比較。圖2A示出了基于用于處理所述細(xì)胞系的BoNT/A的量檢測(cè)到的SNAP-25剪切產(chǎn)物的曲線圖。在SigmaPlot中使用4參數(shù)邏輯模型分析了這些數(shù)據(jù)，并獲得了每種細(xì)胞系的EC5tl值。檢測(cè)到的SNAP-25剪切產(chǎn)物信號(hào)的排序是SiMa>>Neuro-2a>LAl_55n>PC12。圖2B示出了對(duì)所述測(cè)定計(jì)算的300pM對(duì)OpM以及1.2pM對(duì)OpM的原始信號(hào)的信噪比。SiMa細(xì)胞產(chǎn)生了最高信噪比和最低EC5tl值。圖3示出了對(duì)已建立細(xì)胞系的細(xì)胞分化培養(yǎng)基的優(yōu)化，所述細(xì)胞系可用于本說明書中公開的基于免疫的檢測(cè)BoNT/A活性的方法。圖4示出了對(duì)已建立細(xì)胞系包含的細(xì)胞的細(xì)胞分化時(shí)間的優(yōu)化，所述細(xì)胞系可用于本說明書中公開的基于免疫的檢測(cè)BoNT/A活性的方法。圖5示出了對(duì)已建立細(xì)胞系包含的細(xì)胞的BoNT/A處理的優(yōu)化，所述細(xì)胞系可用于本說明書中公開的基于免疫的檢測(cè)BoNT/A活性的方法。結(jié)果表明，任一試驗(yàn)的BoNT/A處理均獲得了小于2pM的EC5tl。圖6示出了本說明書中公開的基于免疫的檢測(cè)BoNT/A活性的方法的靈敏度。結(jié)果表明，細(xì)胞對(duì)BoNT/A的攝取花不到1分鐘，然后產(chǎn)生相對(duì)背景顯著量的SNAP-25剪切產(chǎn)物。圖7示出了本說明書中公開的基于免疫的檢測(cè)BoNT/A活性的方法特異性。結(jié)果表明，本說明書中公開的基于免疫的檢測(cè)BoNT/A活性的方法可以測(cè)量BoNT/A中毒中包括的所有步驟。圖8示出了使用本說明書中公開的基于免疫的檢測(cè)BoNT/A活性的方法用BoNT/A復(fù)合體處理的分化SiMa細(xì)胞的劑量反應(yīng)曲線。圖9示出了使用本說明書中公開的基于免疫的檢測(cè)BoNT/A活性的方法對(duì)制成制劑的BoNT/A藥物產(chǎn)品進(jìn)行基于免疫的BoNT/A活性測(cè)定的結(jié)果。圖10示出了使用本說明書中公開的基于免疫的檢測(cè)BoNT/A活性的方法中和人血清中的α"BoNT/A抗體的檢測(cè)。具體實(shí)施例方式本說明書提供了用于測(cè)定樣品中是否存在活性BoNT/A以及用于測(cè)定BoNT/A制劑的活性/效能的新型測(cè)定。本說明書中公開的基于細(xì)胞的新型測(cè)定倚賴能夠使所述測(cè)定檢測(cè)樣品中皮摩爾量的BoNT/A的細(xì)胞、試劑和檢測(cè)方法。本說明書中公開的基于細(xì)胞的新型測(cè)定減少了對(duì)動(dòng)物毒性研究的需求，但仍可用于分析有關(guān)BoNT/A的多種功能，即毒素的結(jié)合和細(xì)胞攝取，易位至細(xì)胞胞質(zhì)溶膠，以及蛋白酶活性。如下文進(jìn)一步討論的，所述新型方法和組合物可以用于分析粗樣品和大量樣品以及高度純化的雙鏈毒素和制成制劑的毒素產(chǎn)品，并且還可以適用于自動(dòng)高通量測(cè)定形式。因此，本說明書中公開的一個(gè)方面提供了用于產(chǎn)生a-SNAP-25抗體的組合物，所述抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。組合物可包含佐劑和這樣的組成，即所述組成包含SNAP-25抗原、連接于SNAP-25抗原的載體或者連接于與SNAP-25抗原連接的柔性間隔物的載體，其中所述柔性連接體介于所述SNAP-25抗原和所述載體之間?？上胂蟮氖牵捎|發(fā)產(chǎn)生α-SNAP-25抗體——該抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的免疫反應(yīng)的任一和所有SNAP-25抗原都可用作SNAP-25抗原，非限制地包括源自天然SNAP-25的SNAP-25抗原、源自非天然SNAP-25的SNAP-25抗原和包含天然或非天然SNAP-25的免疫反應(yīng)性片段的SNAP-25抗原?？捎糜诋a(chǎn)生α-SNAP-25抗體——該抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的SNAP-25抗原非限制地包括包含連接于載體肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25肽的SNAP-25抗原，非限制地包括SEQIDNO:38。用于制備α-SNAP-25抗體——該抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的其他組合物非限制地包含這樣的組成，即該組成包含連接于與具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原連接的柔性連接體的載體，其中所述柔性連接體介于所述SNAP-25抗原和所述載體之間。可想象的是，任一和所有佐劑都可用于這類組合物中，非限制地包括聚乙二醇(PEG)、單甲氧基聚乙二醇(mPEG)、聚乙烯醇(PVA)、完全和不完全弗氏佐劑。本說明書中公開的另一方面提供了生產(chǎn)α-SNAP-25抗體的方法，該抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。該方法的一些方面包括以下步驟(a)給予動(dòng)物本說明書中公開的組合物；(b)從所述動(dòng)物采集包含α-SNAP-25抗體或產(chǎn)生α-SNAP-25抗體的細(xì)胞的樣品；和(c)從所述樣品分離所述α-SNAP-25抗體。所公開方法可用于制備α-SNAP-25單克隆抗體或α-SNAP-25多克隆抗體，所述單克隆抗體和多克隆抗體都可以結(jié)合含有SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的表位。本說明書中公開的又一方面提供a-SNAP-25抗體——該抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。除了包括單克隆α-SNAP-25抗體或多克隆α-SNAP-25抗體之外，這類α-SNAP-25抗體還包括天然和非天然抗體?？捎米鳓?SNAP-25抗體——該抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的單克隆α-SNAP-25抗體非限制地包括雜交瘤細(xì)胞系1D!3B8、2C9B10、2E2A6、3C1A5和3C3E2產(chǎn)生的單克隆α-SNAP-25抗體。本說明書中公開的再一方面提供了檢測(cè)BoNT/A活性的方法。該方法的一些方面包括步驟(a)用包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)BoNT/A中毒是敏感的；(b)從所述處理的細(xì)胞分離包含在BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產(chǎn)物的SNAP-25組分；(c)將所述SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體相接觸，該抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；和(d)檢測(cè)包含所述α-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況；其中通過所述抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)結(jié)果指示BoNT/A活性。步驟c的α-SNAP-25抗體可任選地連接于固相支持物。本說明書中公開的再一方面提供了檢測(cè)BoNT/A活性的方法。該方法的一些方面包括步驟(a)用包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞可攝取BoNT/A；(b)從所述處理的細(xì)胞分離包含在BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的SNAP-25組分；(c)將所述SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體相接觸，該抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；和(d)檢測(cè)包含所述α-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況；其中通過所述抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)結(jié)果指示BoNT/A活性。步驟c的α-SNAP-25抗體可任選地連接于固相支持物。本說明書中公開的又一方面提供了檢測(cè)哺乳動(dòng)物中的BoNT/A免疫抗性的方法。該方法的一些方面包括步驟(a)將BoNT/A添加至從被測(cè)試α-BoNT/A中和抗體是否存在的哺乳動(dòng)物獲得的試驗(yàn)樣品中；(b)用所述試驗(yàn)樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)BoNT/A中毒是敏感的；(c)從所述處理的細(xì)胞分離包含在BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產(chǎn)物的SNAP-25組分；(d)將所述SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體相接觸，該抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；(e)檢測(cè)包含所述α-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況；(f)以陰性對(duì)照樣品代替試驗(yàn)樣品重復(fù)步驟a-e；和(g)將步驟(e)中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量與步驟(f)中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量對(duì)比，其中與步驟(f)中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量相比，步驟(e)中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的較低量的檢測(cè)結(jié)果指示α-ΒοΝΤ/Α中和抗體的存在。步驟d的α-SNAP-25抗體可任選地連結(jié)于固相支持物。除了陰性對(duì)照樣品之外，步驟f中的對(duì)照樣品還可包括陽性對(duì)照樣品。由肉毒桿菌(Clostridiumbotulinum)、破傷風(fēng)桿菌(Clostridiumtetani)、巴氏梭菌(Clostridiumbaratii)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)產(chǎn)生的梭菌毒素非常廣泛地用于人和其他哺乳動(dòng)物的治療性和美容性治療中。肉毒梭菌(C.botulinum)菌株產(chǎn)生七種具有不同抗原性的肉毒毒素(BoNT)血清型，它們通過研究人中(BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E和BoNT/F)和動(dòng)物中(BoNT/Cl和BoNT/D)的肉毒菌中毒的發(fā)生而被識(shí)別；或從土壤中分離得到(BoNT/G)。雖然全部七種肉毒毒素血清型都具有相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性質(zhì)，但每一種也表現(xiàn)出不同特征，例如不同的藥理學(xué)性質(zhì)。與之相反，破傷風(fēng)毒素(TeNT)由唯一的破傷風(fēng)梭菌(C.tetani)群產(chǎn)生。其他兩種梭菌——巴氏梭菌(C.baratii)和丁酸梭7菌(C.butyricum)——還產(chǎn)生分別與BoNT/F和BoNT/E類似的毒素。每種梭菌毒素都被翻譯成大約150kDa的單鏈多肽，該單鏈多肽隨后通過以下方式被剪切由天然蛋白酶例如內(nèi)源性梭菌毒素蛋白酶或環(huán)境中產(chǎn)生的天然蛋白酶在二硫環(huán)內(nèi)進(jìn)行蛋白酶解切斷。該翻譯后加工產(chǎn)生雙鏈分子，該分子包含通過單個(gè)二硫鍵和非共價(jià)相互作用而連在一起的大約50kDa的輕鏈(LC)和大約IOOkDa的重鏈(HC)。每種成熟的雙鏈分子均包括三個(gè)功能上不同的結(jié)構(gòu)域1)酶促結(jié)構(gòu)域，位于LC上，含有具有鋅依賴性的內(nèi)肽酶活性的金屬蛋白酶區(qū)域，可特異性地靶向于神經(jīng)遞質(zhì)釋放機(jī)構(gòu)的核心組件；2)易位結(jié)構(gòu)域，位于HC的氨基端一側(cè)(),它促進(jìn)LC從細(xì)胞內(nèi)的囊泡中釋放至靶細(xì)胞的胞質(zhì)中；和3)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，位于HC的羧基端一側(cè)(Hc),它決定毒素與位于靶細(xì)胞表面的受體復(fù)合體的結(jié)合活性和結(jié)合特異性。這三個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性、易位活性和酶促活性都是對(duì)毒性所必需的。雖然尚未精確地獲知這一過程中的所有細(xì)節(jié)，但不管是何種血清型或亞型，梭菌毒素進(jìn)入神經(jīng)元并抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放的總的細(xì)胞中毒機(jī)制是類似的。雖然本申請(qǐng)并不希望被下列描述所限制，但是該中毒機(jī)制可被描述為包括至少四個(gè)步驟1)受體結(jié)合；幻復(fù)合體內(nèi)化；3)輕鏈易位；和4)酶促靶向修飾(見圖1)。這一過程開始于梭菌毒素的Hc結(jié)構(gòu)域與位于靶細(xì)胞的質(zhì)膜表面的毒素特異性受體系統(tǒng)的結(jié)合。受體復(fù)合體的結(jié)合特異性部分地來自于似乎獨(dú)特地構(gòu)成每種梭菌毒素受體復(fù)合體的蛋白受體和神經(jīng)節(jié)苷脂的特定組合。一旦結(jié)合，所述毒素/受體復(fù)合體通過胞吞作用內(nèi)化，內(nèi)化的囊泡被分派至特定胞內(nèi)途徑。易位步驟似乎是通過囊泡區(qū)室的酸化而被引發(fā)的。這一過程似乎可以啟動(dòng)重要的依賴于PH的結(jié)構(gòu)重排，所述結(jié)構(gòu)重排增加疏水性、促進(jìn)孔隙形成并有利于毒素的重鏈和輕鏈分開。一旦分開，毒素的輕鏈內(nèi)肽酶從胞內(nèi)的囊泡釋放至胞質(zhì)溶膠中，在此它似乎能特異性地靶向神經(jīng)遞質(zhì)釋放機(jī)構(gòu)的核心組件。這些核心蛋白為囊泡相關(guān)膜蛋白(VAMP)/突觸小泡蛋白、25kDa的突觸體相關(guān)蛋白(SNAP-2Q和突觸融合蛋白，它們是突觸囊泡在神經(jīng)末梢上?？亢腿诤纤匦璧牡鞍?，并且它們都屬于可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE)家族的成員。BoNT/A和BoNT/E剪切SNAP-25的羧基端區(qū)域，分別釋放九個(gè)氨基酸或二十六個(gè)氨基酸的片段，BoNT/Cl也剪切SNAP-25靠近羧基端的區(qū)域，釋放八個(gè)氨基酸的片段。肉毒毒素血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G以及破傷風(fēng)毒素作用于VAMP的保守中心部分，并使得VAMP的氨基端部分釋放至胞質(zhì)溶膠中。BoNT/Cl剪切突觸融合蛋白中接近細(xì)胞質(zhì)膜表面的單個(gè)位點(diǎn)。突觸SNARE蛋白被選擇性地蛋白酶解使得梭菌毒素可以在體內(nèi)阻斷神經(jīng)遞質(zhì)釋放。對(duì)于在多種非神經(jīng)元類型細(xì)胞中的胞吐作用，梭菌毒素的SNARE蛋白靶標(biāo)是相同的；和在神經(jīng)元中一樣，在這些細(xì)胞中，輕鏈的肽酶活性抑制胞吐作用，參見例如，YannHumeauetal.，HowBotulinumandTetanusNeurotoxinsBlockNeurotransmitterRelease,82(5)Biochimie.427-446(2000)；KathrynTurtonetal.，BotulinumandTetanusNeurotoxins:Structure，F(xiàn)unctionandTherapeuticUtility,27(11)TrendsBiochem.Sci.552-558.(2002)；GiovannaLallietal.，TheJourneyofTetanusandBotulinumNeurotoxinsinNeurons，11(9)TrendsMicrobiol.431-437，(2003)ο本公幵的一些方面部分地包括一種用于產(chǎn)生α-SNAP-25抗體的組合物，該抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。本公開的另一些方面部分地包括一種用于產(chǎn)生α-SNAP-25抗體的誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的組合物，該抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。本文中使用的“誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的組合物”是指一種包含SNAP-25抗原的組合物，當(dāng)所述組合物被給予動(dòng)物時(shí)可刺激對(duì)所述SNAP-25抗原的免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生α-SNAP-25抗體——該抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。術(shù)語“免疫反應(yīng)”是指動(dòng)物免疫系統(tǒng)對(duì)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的組合物的任何應(yīng)答。示例性免疫反應(yīng)包括但不限于局部的和全身的以及細(xì)胞的體液免疫，例如CTL應(yīng)答，包括CD8+CTL的抗原特異性誘導(dǎo)；輔助T細(xì)胞應(yīng)答，包括T細(xì)胞增殖應(yīng)答和細(xì)胞因子釋放；以及B細(xì)胞應(yīng)答，包括例如抗體產(chǎn)生應(yīng)答。術(shù)語“誘導(dǎo)免疫反應(yīng)”是指給予誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的組合物或者編碼所述誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的組合物的多核苷酸，這時(shí)免疫反應(yīng)被影響，即被刺激、被啟動(dòng)或者被誘導(dǎo)。組合物包含SNAP-25抗原。本文使用的術(shù)語“抗原”是指誘發(fā)免疫反應(yīng)的分子，非限制地包括肽、多糖和脂質(zhì)綴合物例如脂蛋白和糖脂。本文使用的術(shù)語“SNAP-25抗原”是指可誘發(fā)免疫反應(yīng)的在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的任意抗原。在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的組合物中使用的SNAP-25抗原必須大至足以在序列上基本是獨(dú)特的，從而降低產(chǎn)生與SNAP-25之外的抗原交叉反應(yīng)的抗體的可能性。另外，在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的組合物中使用的SNAP-25抗原必須小至足以基本上僅觸發(fā)對(duì)在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的免疫反應(yīng)，從而增加產(chǎn)生將在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25與在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處不含羧基端的SNAP-25區(qū)分開的α-SNAP-25抗體的可能性。再者，還非常希望以高產(chǎn)率生成單一氨基酸序列的α-SNAP-25抗體，所述抗體的選擇性是可以再現(xiàn)的，并且以滿足要求的親合力結(jié)合，以使得可設(shè)計(jì)高度靈敏的測(cè)定。存在于SNAP-25中的ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)周圍的序列表示為P5-P4-P3-P2-P1-P1’_P2’_P3'-P/-P5’，以P1-P1'代表所述易切斷鍵。在被ΒοΝΤ/Α剪切時(shí)，所形成的剪切產(chǎn)物包括包含P5-P4-P3-P2-P1序列的片段和包含P1'-P2，-P3'-P4，-P5'的片段。因此，本文使用的術(shù)語“在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25”是指將所述P1殘基作為其羧基端氨基酸的任意SNAP-25。例如，人SNAP-25(SEQIDNO5)Q197-R198代表所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)的P1-P/易切斷鍵。照此，“具有所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25”將為在其羧基端氨基酸位置上具有谷氨酰胺的任意SNAP-25剪切產(chǎn)物，這里所述谷氨酰胺代表所述易切斷鍵的0197。又例如，石紋電鰩(Torpedomarmorata)SNAP-25(SEQIDNO:16)的K2tl4-H2tl5代表所述BoNT/A剪切位點(diǎn)的P1-P1'易切斷鍵。照此，“具有所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的羧基端賴氨酸的SNAP-25”將為在其羧基端氨基酸位置上具有賴氨酸的任意SNAP-25剪切產(chǎn)物，這里所述賴氨酸代表所述易切斷鍵的K2(14?？梢詫⒃谒靓ⅵ夕?Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25抗原進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)如下物質(zhì)的免疫原性SNAP-25抗原、半抗原或者當(dāng)未修飾時(shí)有免疫原性、無免疫原性或有弱免疫原性的任何其他抗原性化合物。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，SNAP-25抗原的易切斷鍵的羧基端P1殘基可以被羧化。羧化可以在兩方面增加需要的SNAP-25抗原的免疫原性質(zhì)。第一，因?yàn)閹щ姾傻陌被峥稍鰪?qiáng)免疫原性，所以將COO—基團(tuán)添加至所述羧基端殘基將會(huì)增加SNAP-25抗原的總體免疫原性。第二，因?yàn)樗靓ⅵ夕?Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基在剪切時(shí)處于帶電荷狀態(tài)，所以將COO—基團(tuán)添加至所述羧基端殘基將會(huì)更好地模擬這樣的實(shí)際抗原，即該抗原是本說明書中公開的α"SNAP-25抗體被設(shè)計(jì)以結(jié)合的。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，SNAP-25抗原的氨基端殘基可通過添加適于將所述SNAP-25抗原連接于載體蛋白的氨基酸進(jìn)行修飾，所述載體蛋白例如鑰孔慽血藍(lán)蛋白(KLH)、卵白蛋白(OVA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多附著肽(multipleattachmentpeptide,MAP)0例如，可以將半胱氨酸殘基放置在氨基端，以綴合所述載體蛋白KLH。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1S基處含有羧基端的SNAP-25抗原的長(zhǎng)度可以為例如至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25或至少30個(gè)氨基酸。在另一實(shí)施方案中，在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25抗原的長(zhǎng)度可以為例如至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多25或至多30個(gè)氨基酸。在又一實(shí)施方案中，在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25抗原可以為例如7-12個(gè)氨基酸、10-15個(gè)氨基酸或13-18個(gè)氨基酸。在另一實(shí)施方案中，在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:32。在該實(shí)施方案的一些方面中，在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的所述SNAP-25抗原包括SEQIDNO33、SEQIDNO:34、SEQIDNO35,SEQIDNO36、SEQIDNO37、SEQIDNO:147或SEQIDN0:148。在又一實(shí)施方案中，在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:38ο仍在另一實(shí)施方案中，在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:39。在該實(shí)施方案的一些方面中，在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO42,SEQIDNO43或SEQIDNO:44。在又一實(shí)施方案中，在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:45。可想象的是，觸發(fā)產(chǎn)生α-SNAP-25抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的免疫反應(yīng)的任一和所有SNAP-25抗原都可以用作SNAP-25抗原。因此，包括SEQIDNO32、SEQIDNO33、SEQIDNO34,SEQIDNO35、SEQIDNO36、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO40、SEQIDNO41,SEQIDNO42,SEQIDNO43,SEQIDN0:44、SEQIDNO:147或SEQIDNO:148的氨基酸序列變體可用作觸發(fā)產(chǎn)生α-SNAP-25抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的免疫反應(yīng)的SNAP-25抗原。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，SNAP-25抗原可相對(duì)包括SEQIDNO32、SEQIDNO33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO42,SEQIDNO43,SEQIDNO:44、SEQIDNO:147或SEQIDNO148的SNAP-25抗原具有至少1個(gè)、至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)或至少5個(gè)氨基酸的置換、缺失或添加。在又一實(shí)施方案中，SNAP-25抗原與包括SEQIDNO32、SEQIDNO:33、SEQIDNO34,SEQIDNO35、SEQIDNO36、SEQIDNO37、SEQIDNO39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:147或SEQIDNO148的SNAP-25抗原可以有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性?？上胂蟮氖?，一種或多種載體可連接于SNAP-25抗原，目的是增強(qiáng)當(dāng)未與所述載體締合時(shí)有免疫原性、無免疫原性或有弱免疫原性的SNAP-25抗原的免疫原性。非限制性實(shí)例包括，例如鑰孔慽血藍(lán)蛋白(KLH)、卵白蛋白(OVA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多附著肽(MAP)。如本領(lǐng)域中公知的，可以通過將無抗原性或弱抗原性的抗原偶聯(lián)于載體而使所述抗原有抗原性。用于將抗原偶聯(lián)于載體的多種其他載體和方法是本領(lǐng)域中公知的。參見，例如Harlow和Lane，見上文，1998a；Harlow禾口Lane，見上文，1998b；以及DavidW.Waggoner,Jr.等人，Immunogenicity-enhancingcarriersandcompositionsthereofandmethodsofusingthesame，美國專禾公開文本No.20040057958Q004年3月25日)。表位還可以通過將所述表位作為融合蛋白表達(dá)而生成。用于表達(dá)多肽融合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如記載于Ausubeletal·,CurrentProtocolsinMolecularBiology(Supplement47),JohnWiley&Sons,NewYork(1999)中。由于所述SNAP-25抗原的羧基末端必須是所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基，因此載體必須連接于所述SNAP-25抗原的氨基端?？上胂蟮氖?，一個(gè)或多個(gè)柔性間隔物可連接于SNAP-25抗原，目的是增強(qiáng)當(dāng)未與所述柔性連接體締合時(shí)有免疫原性、無免疫原性或有弱免疫原性的SNAP-25抗原的免疫原性。柔性間隔物可增加所述SNAP-25抗原的總肽長(zhǎng)度并提供柔性，從而有利于所述SNAP-25抗原正確地呈遞于所述免疫細(xì)胞。一個(gè)非限制性實(shí)例是，組合物可包含這樣的SNAP-25抗原，即該抗原連接于串聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)柔性間隔物以將SNAP-25抗原更好地呈遞于免疫細(xì)胞，從而有利于所述免疫反應(yīng)。由肽構(gòu)成的柔性間隔物的長(zhǎng)度為至少1個(gè)氨基酸，并且包含具有小側(cè)鏈R基團(tuán)的不帶電荷氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或絲氨酸。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，柔性間隔物的長(zhǎng)度可以為例如至少1個(gè)、至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)或至少10個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，柔性間隔物的長(zhǎng)度可以為例如至少1個(gè)、至多2個(gè)、至多3個(gè)、至多4個(gè)、至多5個(gè)、至多6個(gè)、至多7個(gè)、至多8個(gè)、至多9個(gè)或至多10個(gè)氨基酸。在又一個(gè)實(shí)施方案中，柔性間隔物的長(zhǎng)度可以為例如1-3個(gè)氨基酸、2-4個(gè)氨基酸、3-5個(gè)氨基酸、4-6個(gè)氨基酸或5_7個(gè)氨基酸。柔性間隔物的非限制性實(shí)例包括例如G間隔物如GGG、GGGG(SEQIDNO55)和GGGGS(SEQIDNO56)或者A間隔物如AAA、AAAA(SEQIDNO:57)和AAAAV(SEQIDNO:58)。柔性間隔物在閱讀框內(nèi)連接于所述SNAP-25抗原成為融合蛋白。如上文詳述的，柔性間隔物部分地用于增加所述SNAP-25抗原的總體肽長(zhǎng)度。例如，5-10個(gè)氨基酸的SNAP-25抗原可以通過在其氨基端連接3_5個(gè)氨基酸的柔性間隔物而增加其總長(zhǎng)度。再例如，5-10個(gè)氨基酸的SNAP-25抗原可以通過在其氨基端連接4_6個(gè)氨基酸的柔性間隔物而增加其總長(zhǎng)度。再例如，5-10個(gè)氨基酸的SNAP-25抗原可以通過在其氨基端連接7-10個(gè)氨基酸的柔性間隔物而增加其總長(zhǎng)度。再例如，7-12個(gè)氨基酸的SNAP-25抗原可以通過在其氨基端連接1-3個(gè)氨基酸的柔性間隔物而增加其總長(zhǎng)度。再例如，7-12個(gè)氨基酸的SNAP-25抗原可以通過在其氨基端連接4-個(gè)6氨基酸的柔性間隔物而增加其總長(zhǎng)度。由所述柔性間隔物提供的長(zhǎng)度增加使得可選擇較小大小的SNAP-25抗原，從而增加所述SNAP-25抗原基本上僅觸發(fā)對(duì)在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的免疫反應(yīng)的可能性，因此增加產(chǎn)生將在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25與在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處不含羧基端的SNAP-25區(qū)分開的α-SNAP-25抗體的可能性?？上胂蟮氖?，本說明書中公開的組合物可任選地包含本說明書中公開的SNAP-25抗原和一種或多種佐劑。本文使用的術(shù)語“佐劑”在述及SNAP-25組合物時(shí)是指可增加或改變對(duì)SNAP-25抗原的免疫反應(yīng)的任何物質(zhì)或物質(zhì)混合物。佐劑可以例如用于減少免疫次數(shù)或者保護(hù)性免疫需要的抗原量。佐劑在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的組合物中的用途是公知的。使用這些佐劑的主要目的是使得所述免疫反應(yīng)增加。非限制性佐劑包括例如脂質(zhì)體、油相，非限制性地包括弗氏類型的佐劑，例如弗氏完全佐劑(FCA)；弗氏不完全佐劑(FIA)；皂苷元糖苷如皂苷；聚羧乙烯；N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(通常稱為胞壁酰二肽或“MDP”)；以及脂多糖(LPQ。這類佐劑通常以與水相形成的乳劑的形式使用，或者更通常地可由不溶于水的無機(jī)鹽組成。這些無機(jī)鹽可包括例如氫氧化鋁、硫酸鋅、氫氧化鐵膠體、磷酸鈣或氯化鈣。氫氧化鋁(Al(OH)3)是一種常用的佐劑。當(dāng)前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)在人中使用的佐劑只有鋁鹽(Alum)，所述鋁鹽用于通過沉淀所述抗原而“貯藏”抗原。上面提供的佐劑僅僅是示例性的。事實(shí)上，任何佐劑都可以用于本說明書中公開的SNAP-25組合物中，條件是所述佐劑滿足誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的必要特征。本說明書中公開的載體也可以作為佐劑。具體的佐劑以及制備和使用方法公布于例如Guptaetal.Vaccine,11:993-306,1993；Arnon,R.(Ed.)SyntheticVaccines1:83-92,CRCPress,Inc.,BocaRaton,Fla.,1987；禾口DavidW.Waggoner,Jr.etal.,Immunogenicity-EnhancingCarriersandcompositionsThereofandMethodsofUsingtheSame，美國專利公開文本No.20040057958(Mar.25，2004)中。另外的佐劑包括"VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach"(eds.Powell,M.F.andNewman,M.J.)PharmaceuticalBiotechnology,Volume6,PlenumPress(NewYork)第7章(第141-227頁)中描述的任意化合物。來自該概論的實(shí)例包括胞壁酰二肽(MDP)和Montanide720。分子例如聚肌苷胞嘧啶(PolyI:C)或包含CpG基序的質(zhì)粒DNA也可作為佐劑與封裝在微粒中的抗原組合給藥。再例如，所述佐劑是一種有利于所述抗原性化合物進(jìn)入細(xì)胞胞質(zhì)中的試劑，例如李斯特菌素、鏈球菌溶血素或它們的混合物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，SNAP-25組合物包含連接于載體肽的具有羧化羧基端谷氨酰胺的SNAP-25抗原。在該實(shí)施方案的一些方面中，具有羧化羧基端谷氨酰胺的SNAP-25抗原包括SEQIDNO32,SEQIDNO33,SEQIDNO34,SEQIDNO35,SEQIDNO36,SEQIDNO37,SEQIDNO:147或SEQIDNO:148。在該實(shí)施方案的另一方面中，SNAP-25抗原包括SEQIDNO:38。在該實(shí)施方案的一些方面中，所述載體肽為鑰孔慽血藍(lán)蛋白(KLH)JP白蛋白(0VA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多附著肽(MAP)。在另一實(shí)施方案中，SNAP-25組合物包含連接于載體肽的具有羧化羧基端賴氨酸的SNAP-25抗原。在該實(shí)施方案的一些方面中，具有羧化羧基端賴氨酸的SNAP-25抗原包括SEQIDNO39,SEQIDNO40,SEQIDN0:41、SEQIDNO42,SEQIDNO43或SEQIDN0:44。在該實(shí)施方案的另一方面中，SNAP-25抗原包括SEQIDNO:45。在該實(shí)施方案的一些方面中，所述載體肽為鑰孔慽血藍(lán)蛋白(KLH)、卵白蛋白(OVA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多附著肽(MAP)。仍在另一實(shí)施方案中，SNAP-25組合物包含連接于一個(gè)或多個(gè)柔性連接體和載體肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原，其中所述柔性連接體介于所述SNAP-25抗原和所述載體肽之間。在該實(shí)施方案的一些方面中，具有羧化羧基端谷氨酰胺的SNAP-25抗原包括SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO37,SEQIDNO:147或SEQIDN0:148。在另一實(shí)施方案中，SNAP-25抗原包括SEQIDN0:46。在該實(shí)施方案的一些方面中，所述載體肽為鑰孔慽血藍(lán)蛋白(KLH)、卵白蛋白(OVA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多附著肽(MAP)。在該實(shí)施方案的一些方面中，所述柔性連接體為G間隔物或A間隔物。在又一實(shí)施方案中，SNAP-25組合物包含連接于柔性連接體和載體肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原，其中所述柔性連接體介于所述SNAP-25抗原和所述載體肽之間。在該實(shí)施方案的一些方面中，具有羧化羧基端賴氨酸的SNAP-25抗原包括SEQIDNO39、SEQIDNO:40,SEQIDN0:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43或SEQIDNO:44。在該實(shí)施方案的另一方面中，SNAP-25抗原包括SEQIDNO:47。在該實(shí)施方案的一些方面中，所述載體肽為鑰孔慽血藍(lán)蛋白(KLH)、卵白蛋白(0VA)、甲狀腺球蛋白(THY)、牛血清白蛋白(BSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)或多附著肽(MAP)。在該實(shí)施方案的一些方面中，所述柔性連接體為G間隔物或A間隔物。本公開的一些方面部分地包括用于生產(chǎn)α-SNAP-25抗體的方法，所述抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。α-SNAP-25抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——可通過本領(lǐng)域中熟知的多種方法制備。檢測(cè)和測(cè)量抗體結(jié)合特異性、結(jié)合親和性及結(jié)合親合力，以及制備和使用抗體的具體方案是本領(lǐng)域中已知的。參見，例如Antibodies:ALaboeatoeyManual(EdwardHarlow&DavidLane,eds.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1998a)；禾口UsingAntibodies:ALaboeatoeyManual:PottablePkotocolNo.I(EdwardHarlow&DavidLane,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1998b)；MolecularCloning,ALaboratoryManual,2001Lii1^CurrentProtocolsinMolecularBiology,2004；DavidAndersonetal.,TherapeuticPolypeptides,NucleicAcidsEncodingSame,andMethodsofUse，美國專利7，034，132(2005年4月25日)；以及BeatrizM.Carrenoetal.,AntibodiesAgainstCTLA4，美國專利7，034，121(2006年4月25日)。作為非限制性實(shí)例，α-SNAP-25多克隆抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——可通過用本說明書中公開組合物的一種或多種注射劑注射動(dòng)物如兔、山羊、小鼠或另一種哺乳動(dòng)物而制備。作為另一非限制性實(shí)例，α-SNAP-25多克隆抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——可通過用本說明書中公開組合物的一種或多種注射劑注射卵如雞的卵而制備。免疫動(dòng)物中的抗體效價(jià)可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)隨時(shí)間監(jiān)測(cè)，例如通過使用固定抗原的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或基于細(xì)胞的活性測(cè)定。根據(jù)需要，可以將α-SNAP-25抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的多克隆抗體從所述哺乳動(dòng)物中(例如從血液中)分離并通過公知的技術(shù)例如為獲得IgG部分的蛋白A親和色譜法，或者通過對(duì)用于產(chǎn)生所述抗體的肽的親和純化進(jìn)行進(jìn)一步純化。作為另一個(gè)非限制性實(shí)例，a-SNAP-25單克隆抗體——該抗體可結(jié)合在來自SNAP-25剪切產(chǎn)物的ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——可使用雜交瘤方法產(chǎn)生。參見，例如MonoclonalAntibodies，pp.196-244,Harlow&Lane，見上文，1998a的第6章；和GrowingHybridomas,pp.245-282，Harlow&Lane，見上文，1998a的第7章；以及Goding,pp.59-103,MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice,AcademicPress,(1986)。在該方法中，一般將宿主動(dòng)物如小鼠、倉鼠或其他合適宿主動(dòng)物暴露于本說明書中公開SNAP-25抗原的一種或多種注射劑，以誘發(fā)產(chǎn)生或者能夠產(chǎn)生α-SNAP-25抗體——該抗體會(huì)特異性地結(jié)合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25——的淋巴細(xì)胞。免疫動(dòng)物中的抗體效價(jià)可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)隨時(shí)間監(jiān)測(cè)，例如通過使用固定抗原的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或基于細(xì)胞的活性測(cè)定?；蛘?，可以使用合適的培養(yǎng)細(xì)胞系在體外免疫所述淋巴細(xì)胞。在免疫后合適的時(shí)間，例如當(dāng)抗體效價(jià)最高時(shí)，從所述動(dòng)物分離產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。一般而言，如果需要人源的細(xì)胞則可使用外周血淋巴細(xì)胞，如果需要非人哺乳動(dòng)物來源則可使用脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞。使用合適的融合試劑如聚乙二醇將所分離的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與一種永生化細(xì)胞系融合，以形成雜交瘤細(xì)胞。永生化細(xì)胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是嚙齒類動(dòng)物、牛和人源的骨髓瘤細(xì)胞。一般將鼠科動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞系與從恰當(dāng)免疫的小鼠中采集的脾細(xì)胞融合，以產(chǎn)生所述雜交瘤。優(yōu)選的永生化細(xì)胞系是對(duì)含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT)的培養(yǎng)基敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。多種骨髓瘤細(xì)胞系的每一種均可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用作融合伴侶，例如P3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63-Ag8.653或Sp2/0_Agl4骨髓瘤細(xì)胞系。然后使用HAT培養(yǎng)基——其殺死未融合的和非增殖性融合的骨髓瘤細(xì)胞(未融合的脾細(xì)胞在培養(yǎng)數(shù)日后死亡，因?yàn)樗鼈兪俏崔D(zhuǎn)化的)——來選擇融合形成的雜交瘤細(xì)胞。然后，可以對(duì)培養(yǎng)所述雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基檢測(cè)α-SNAP-25單克隆抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的存在情況。例如，可以在免疫沉淀測(cè)定、體外結(jié)合測(cè)定例如放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)中，或者在基于細(xì)胞的活性測(cè)定中，使用α-SNAP-25陽性培養(yǎng)基篩查雜交瘤上清液。這類技術(shù)和測(cè)定是本領(lǐng)域中已知的。參見，例如Harlow&Lane，見上文，1998a的第11章Immunoprecipitation，第421-470頁；Harlow&Lane，見上文，1998a的第12章Immunoblotting，第471-510頁；Harlow&Lane，見上文，1998a的第14章Immunoassays，第553-612頁。然后可進(jìn)行另外的研究，以確定所述抗體是否還對(duì)在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處不含羧基端的SNAP-25無反應(yīng)性。還可例如通過katchard分析確定α-SNAP-25單克隆抗體的結(jié)合親和性。參見，例如PeterJ.MunsonandDavidRodbard,Ligand:AVersatileComputerizedApproachForCharacterizationofLigand-BindingSystems,107(1)Anal.Biochem.220-239(1980)。在鑒定出需要的雜交瘤細(xì)胞后，使用有限稀釋步驟來分離源自單個(gè)細(xì)胞的克隆，直至獲得表達(dá)需要的單克隆抗體的克隆細(xì)胞系。選擇那些對(duì)在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25有足夠的選擇性并以足夠高的親合力結(jié)合的抗體，用于進(jìn)一步表征和研究。用于制備α-SNAP-25單克隆抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的另一可選方法是通過用SNAP-25肽和分離的免疫球蛋白文庫成員——該成員可結(jié)合在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25——篩查重組組合免疫球蛋白文庫如抗體噬菌體展示文庫。用于生成和篩查噬菌體展示文庫的試劑盒可市購，例如RecombinantPhageAntibodySystem(AmershamGEHealthcare,Piscataway,NJ)；禾口SurfZAPPhageDisplayKit(Stratagene,LaJolla,CA)。另外，用于生成和篩查抗體展示文庫的方法和試劑的實(shí)例可以見于例如Ladner等人，美國專利5，223，409；Borrebaeck等人，美國專利5，712,089；Griffiths等人，美國專利5，885，793；Griffiths等人，美國專利5，962，255；McCafferty等人，美國專利5，969，108；Griffiths等人，美國專利6，010，884Jespers等人，美國專利6，017，732；Borrebaeck等人，美國專利6，027，930Johnson等人，美國專利6，140，471；McCafferty等人，美國專利6，172，197，上述每一篇均通過援引的方式全文納入本文。本公開的一些方面部分地包括，采集包含α-SNAP-25抗體或產(chǎn)生α-SNAP-25抗體的細(xì)胞的樣品。本文使用的術(shù)語“包含α-SNAP-25抗體或產(chǎn)生α-SNAP-25抗體的細(xì)胞的樣品”是指包含或者可能包含至少一種α-SNAP-25抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的任何生物物質(zhì)?？上胂蟮氖牵砂?SNAP-25抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的任一和所有樣品都可用于該方法中，非限制地包括血液、血漿、血清和淋巴液。還可想象的是，能夠產(chǎn)生α-SNAP-25抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的任何細(xì)胞都可用于該方法中，所述細(xì)胞非限制地包括CD8細(xì)胞、CTL細(xì)胞、輔助T細(xì)胞和B細(xì)胞。多種公知的方法可用于從個(gè)體中采集包含所述α-SNAP-25抗體或產(chǎn)生α-SNAP-25抗體的細(xì)胞的樣品，參見，例如Harlow&Lane，見上文，1998a；和Harlow&Lane，見上文，199汕。類似地，多種公知的方法可用于加工樣品，以分離α-SNAP-25抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位?？苫诖蛛x的抗體的類型選擇用于采集樣品的方法。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，當(dāng)分離α-SNAP-25多克隆抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——時(shí)，合適的樣品可以是包含這類α"SNAP-25抗體的血液樣品，而當(dāng)分離α-SNAP-25單克隆抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——時(shí)，合適的樣品可以是產(chǎn)生α-SNAP-25抗體的細(xì)胞，例如脾細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞。本公開的一些方面部分地包括從所述樣品中分離α-SNAP-25抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。分離這類α-SNAP-25抗體例如α-SNAP-25多克隆抗體或α-SNAP-25單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，所述α-SNAP-25多克隆抗體和α-SNAP-25單克隆抗體均可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。參見，例如HarlowandLane，見上文，1998a；和HarlowandLane，見上文，1998b。例如，可通過公知的技術(shù)從所述樣品中分離這類α"SNAP-25多克隆抗體，所述技術(shù)例如使用蛋白A或蛋白G的親和色譜法，該方法主要提供免疫血清的IgG部分。隨后或者另外，可以將特異性SNAP-25抗原固定于柱上或磁珠上，以通過免疫親和色譜法來純化α-SNAP-25多克隆抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位?？赏ㄟ^常規(guī)的免疫球蛋白純化方法從培養(yǎng)基或腹水液中分離α-SNAP-25單克隆抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位，所述常規(guī)免疫球蛋白純化方法例如蛋白A-瓊脂糖凝膠、羥磷灰石色譜法、凝膠電泳、透析或親和色譜法。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，一種生產(chǎn)α-SNAP-25抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的方法包括步驟(a)給予動(dòng)物包含連接于載體肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原的組合物；(b)從所述動(dòng)物中采集包含α-SNAP-25抗體或產(chǎn)生α-SNAP-25抗體的細(xì)胞的樣品；和(c)從所述樣品分離所述α-SNAP-25抗體組分。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述α-SNAP-25抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——是多克隆抗體。在該實(shí)施方案的另一方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可結(jié)會(huì)在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——是單克隆抗體。在該實(shí)施方案的又一方面中，產(chǎn)生的α-SNAP-25單克隆抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——是IgG亞型。在該實(shí)施方案的其他方面中，SNAP-25組合物還包含佐劑，例如聚乙二醇(PEG)、單甲氧基聚乙二醇(mPEG)或聚乙烯醇(PVA)。在另一實(shí)施方案中，一種生產(chǎn)α-SNAP-25抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——的方法包括步驟(a)給予動(dòng)物包含連接于柔性連接體和載體肽的具有羧化C端谷氨酰胺的SNAP-25抗原的組合物，其中所述柔性連接體介于所述SNAP-25肽和所述載體肽之間；(b)從所述動(dòng)物采集包含α-SNAP-25抗體或產(chǎn)α-SNAP-25抗體的細(xì)胞的樣品；和(c)從所述樣品分離所述α-SNAP-25抗體。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述α-SNAP-25抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——是多克隆抗體。在該實(shí)施方案的另一方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——是單克隆抗體。在該實(shí)施方案的又一方面中，產(chǎn)生的α-SNAP-25單克隆抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位——是IgG亞型。在該實(shí)施方案的其他方面中，SNAP-25組合物還包含佐劑，例如聚乙二醇(PEG)、單甲氧基聚乙二醇(mPEG)或聚乙烯醇(PVA)。本公開的一些方面部分地包括一種分離的α-SNAP-25抗體，該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位。本文中使用的術(shù)語“分離的”是指通過人的介入從分子的天然環(huán)境中分離分子。本文使用的“抗體”是指由免疫系統(tǒng)生成的分子，該分子通過應(yīng)答特定抗原而產(chǎn)生并可特異性地結(jié)合于該抗原，抗體包括天然抗體和非天然抗體。本文使用的術(shù)語“α-SNAP-25”與“SNAP-25抗體”同義，是指可結(jié)合于SNAP-25抗原的抗體。例如，抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、二聚體、多聚體、多特異性抗體、人源化抗體、嵌合抗體、雙功能抗體、細(xì)胞相關(guān)抗體如Ig受體、線式抗體、雙鏈抗體或微抗體——只要所述片段表現(xiàn)出需要的生物活性——以及它們的單鏈衍生物?？贵w可以是包含Vh和\區(qū)以及輕鏈恒定區(qū)(Q)和重鏈恒定區(qū)CH1、Ch2和Ch3的全長(zhǎng)免疫球蛋白分子，或者全長(zhǎng)免疫球蛋白分子的免疫活性片段，例如Fab片段、F(ab')2片段、Fc片段、Fd片段或Fv片段?？贵w可源自于任何脊椎動(dòng)物物種(例如人、山羊、馬、驢、鼠科動(dòng)物、大鼠、兔或雞)，并且可以是任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、類別(例如IgA,IgD,IgE,IgG和IgM)或亞類(IgGUIgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)。對(duì)天然抗體、非天然抗體和它們的抗原性化合物結(jié)合片段的結(jié)構(gòu)的一般性公開，參見例如PluckthiminThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenburgandMooreeds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994);Borrabeck,AntibodyEnRineerinR,Wi2版(OxfordUniversityPress1995)，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。天然抗體通常是約150，000道爾頓的異四體糖蛋白，由兩條相同輕(L)鏈和兩條相同重(H)鏈組成。每條輕鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵連接于重鏈，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈中的二硫鍵的數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈還具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端具有一個(gè)可變區(qū)(Vh)，隨后是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈在一端具有一個(gè)可變區(qū)(\)，在其另一端具有一個(gè)恒定區(qū)。所述輕鏈的恒定區(qū)與所述重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)對(duì)齊，所述輕鏈的可變區(qū)與所述重鏈的可變區(qū)對(duì)齊。特定的氨基酸殘基被認(rèn)為形成了所述輕鏈和重鏈可變區(qū)之間的界面。完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)位于抗體可變區(qū)內(nèi)，即Fv片段。該片段包括緊密非共價(jià)締合的一個(gè)重鏈可變區(qū)(Vh)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)的二聚體。每個(gè)區(qū)包含4個(gè)主要采取β片層構(gòu)型的骨架區(qū)(FR)，這些框架區(qū)由3個(gè)超變區(qū)連接，所述超變區(qū)形成連接所述β片層結(jié)構(gòu)的環(huán)，并且在一些情形下形成所述β片層結(jié)構(gòu)的一部分。每個(gè)超變區(qū)包含對(duì)應(yīng)于互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的氨基酸序列?？傊撬?個(gè)CDR區(qū)的三維構(gòu)型界定了所述Vh-Vl二聚體表面上的賦予抗原結(jié)合特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)。參見，例如CyrusChothia,etal.,ConformationsofImmunoglobulinHypervariableRegions,Nature342(6252)877-883(1989)；ElvinA.Kabat,etalSequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991)，以上每一篇通過援引的方式全文納入本文?？贵w恒定區(qū)并不直接參與抗體抗原結(jié)合，但呈現(xiàn)多種效應(yīng)物功能，例如使抗體參與抗體依賴的細(xì)胞毒性。靶抗原通常具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，也稱為表位，它們可被CDR形成的抗原結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別。本文中使用的“表位”與“抗原決定簇”同義，是指能夠特異性地結(jié)合于免疫球蛋白或T細(xì)胞受體或者以另外的方式與一個(gè)分子相互作用的靶抗原上的位點(diǎn)，所述靶抗原例如肽、多糖或包含脂質(zhì)的分子。特異性地結(jié)合于不同表位的每種抗體均具有不同結(jié)構(gòu)。因此，一種抗原可以具有多于一種對(duì)應(yīng)的抗體。多克隆抗體是指異質(zhì)的抗體分子群，包含至少2種能夠結(jié)合于特定抗原的抗體。根據(jù)定義，多克隆抗體包括結(jié)合至少兩種不同表位的兩種不同抗體。本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”或“多個(gè)單克隆抗體”是指基本同質(zhì)的抗體分子群，僅包含一種能夠結(jié)合特定抗原的抗體，即除了可能微量存在的可能的天然突變之外，該群包含的各個(gè)抗體是相同的。根據(jù)定義，單克隆抗體結(jié)合于單一表位。單克隆抗體是高度特異的，針對(duì)單一抗原性位點(diǎn)。再者，與多克隆抗體不同，每種單克隆抗體均針對(duì)抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)還在于，它們可不被其他抗體污染地合成。修飾語“單克隆的”是指從基本同質(zhì)的抗體群獲得的抗體特征，而不可解釋為需要以任何具體方法生產(chǎn)所述抗體。例如，可根據(jù)本公開使用的單克隆抗體可通過雜交瘤方法制備，該方法首先被Kohleretal(1975)Nature256:495記載，或者可通過重組DNA方法制備(參見，例如美國專利No.4，816，567；美國專利No.5，807，715)。還可使用例如Clacksonetal(1991)Nature,352:624-628；Marksetal(1991)J.Mol.Biol.，222:581-597中記載的技術(shù)從噬菌體抗體文庫分離所述單克隆抗體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，α-SNAP-25抗體包含重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(Vl)，該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述重鏈可變區(qū)(Vh)為SEQIDNO72、SEQIDNO74,SEQIDNO76,SEQIDNO80或SEQIDNO:82。在該實(shí)施方案的另一方面中，所述輕鏈可變區(qū)(Vl)為SEQIDNO84,SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90或SEQIDNO92。在另一實(shí)施方案中，α-SNAP-25抗體包含重鏈可變區(qū)(Vh)⑶Rl區(qū)、⑶R2區(qū)、⑶R3區(qū)或它們的任意組合，該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述重鏈可變區(qū)(Vh)CDRI為SEQIDNO93,SEQIDNO94、SEQIDNO95、SEQIDN0:118、SEQIDNO:119或SEQIDNO:120。在該實(shí)施方案的另一方面中，所述重鏈可變區(qū)(Vh)⑶R2區(qū)是SEQIDNO96、SEQIDNO97,SEQIDNO98,SEQIDNO99,SEQIDNO121,SEQIDNO:122或SEQIDNO:123。仍在該實(shí)施方案的另一方面中，所述重鏈可變區(qū)(VHKDR3區(qū)是SEQIDNO100,SEQIDNO:101、SEQIDNO:102或SEQIDNO124。在另一實(shí)施方案中，α-SNAP-25抗體包含輕鏈可變區(qū)(Vl)⑶Rl區(qū)、⑶R2區(qū)、⑶R3區(qū)或它們的任意組合，該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述輕鏈可變區(qū)(VJCDR1區(qū)是SEQIDNO:103,SEQIDNO:104、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:125,SEQIDNO126、SEQIDN0:127、SEQIDNO:128或SEQIDN0:129。在該實(shí)施方案的另一方面中，所述輕鏈可變區(qū)(VJCDR2區(qū)是SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110,SEQIDNO:111或SEQIDNO:112。仍在該實(shí)施方案的另一方面中，所述輕鏈可變區(qū)(VJCDR3區(qū)是SEQIDN0:113、SEQIDNO:114、SEQIDNO:115、SEQIDNO:116或SEQIDNO:117。仍在另一實(shí)施方案中，α-SNAP-25抗體特異性地結(jié)合在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的表位。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述表位包括SEQIDNO32,SEQIDNO33,SEQIDNO34,SEQIDNO35,SEQIDNO36,SEQIDNO37,SEQIDNO:147或SEQIDNO:148。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述表位包括SEQIDNO39,SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO42,SEQIDNO:43或SEQIDNO:44。如上文詳述的，存在于SNAP-25中的ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)周圍的序列表示為P5-P4-PS-P2-P1-P/-P2'-P/-P4'-P5'，以P1-P/代表所述易切斷鍵。在被ΒοΝΤ/Α剪切時(shí)，所形成的剪切產(chǎn)物包括包含P5-P4-P3-P2-P1序列的片段和包含P1'-P2'-P3'-P/-P5'的片段。本文使用的術(shù)語“α-SNAP-25抗體——該抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端”是指這樣的α-SNAP-25抗體，即該抗體可選擇性地結(jié)合于包含所述P5-P4-P3-P2-P1序列的任何SNAP-25剪切產(chǎn)物片段，但不結(jié)合于包含所述P1'-P2'-P3'-P/-P5'序列的任何SNAP-25剪切產(chǎn)物片段或者具有ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)的完整P1-P1'易切斷鍵的任何SNAP-25。本文使用的術(shù)語“a-SNAP-25197抗體”是指這樣的抗體，即該抗體可選擇性地結(jié)合于具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:5的谷氨酰胺197的羧基端P1殘基的SNAP-25。本文使用的術(shù)語“a-SNAP-252(I4抗體”是指這樣的抗體，即該抗體可選擇性地結(jié)合于具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO16的賴氨酸204的羧基端P1殘基的SNAP-25。本文使用的術(shù)語“選擇性地”是指具有獨(dú)特的效應(yīng)或影響，或者僅以一種方式或者僅與一種物質(zhì)反應(yīng)。本文使用的術(shù)語“選擇性地結(jié)合”在述及抗體時(shí)是指所述抗體與指定靶表位的區(qū)分性結(jié)合，結(jié)果是所述抗體基本不與非靶表位交叉反應(yīng)。本文定義的肽表位的最小大小是約5個(gè)氨基酸，肽表位一般包含至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15或至少20個(gè)氨基酸。肽表位可以是不連續(xù)的，即它包含在肽一級(jí)結(jié)構(gòu)上不相鄰、但通過所述肽的二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)集合成表位的氨基酸殘基。再者，還應(yīng)指出，表位可能包含氨基酸序列之外的分子部分，例如碳水化合物部分、脂質(zhì)部分如脂蛋白或糖脂，或者化學(xué)修飾的氨基酸部分如磷酸化的氨基酸。在該實(shí)施方案的一些方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——可選擇性地結(jié)合包含至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15或至少20個(gè)氨基酸的在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位。在該實(shí)施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——可選擇性地結(jié)合包含至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多15或至多20個(gè)氨基酸的在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位。選擇性結(jié)合包括諸如結(jié)合親和性、結(jié)合特異性和結(jié)合親合力的結(jié)合性質(zhì)。參見DavidJ.King,ApplicationsandEngineeringofMonoclonalAntibodies,PP.240(1998)。結(jié)合親和性是指抗體停留在其表位結(jié)合位點(diǎn)的時(shí)長(zhǎng)，可以看作是抗體結(jié)合其表位的強(qiáng)度。結(jié)合親和性可以描述為抗體的平衡解離常數(shù)(KD)，該常數(shù)定義為平衡時(shí)的Kd/Ka比。其中Ka是抗體的締合速率常數(shù)，kd是抗體的解離速率常數(shù)。結(jié)合親和性由締合和解離共同決定，僅高締合或低解離都不能確保高親和性。所述締合速率常數(shù)(Ka)或結(jié)合速率常數(shù)(Kon)測(cè)量每單位時(shí)間結(jié)合事件的數(shù)目，或者抗體和抗原可逆地締合成其抗體-抗原復(fù)合體的傾向性。締合速率常數(shù)以Μ"、—1表示，用符號(hào)表示如下[Ab]X[Ag]XKon。締合速率常數(shù)越大，抗體結(jié)合于其抗體越快，或者抗體和抗原之間的結(jié)合親和性越大。解離速率常數(shù)(Kd)或分離速率常數(shù)(Koff)測(cè)量每單位時(shí)間解離事件的數(shù)目，或者抗體-抗原復(fù)合體可逆地分離(解離)成其組分分子(即抗體和抗原)的傾向性。解離速率常數(shù)以s—1表示，用符號(hào)表示如下[Ab+Ag]XKofT。解離速率常數(shù)越小，抗體越牢固地結(jié)合于其抗原，或者抗體和抗原之間的結(jié)合親和性越大。平衡解離常數(shù)(KD)測(cè)量平衡時(shí)形成的新抗體-抗原復(fù)合體的與抗體-抗原復(fù)合體解離速率相等的速率。平衡解離常數(shù)以M表示，定義為Koff/Kon=[Ab]X[Ag]/[Ab+Ag]，其中[Ab]是抗體的摩爾濃度，[Ag]是抗原的摩爾濃度，[Ab+Ag]是抗體-抗原復(fù)合體的摩爾濃度，其中所有濃度都是這些組分在體系平衡時(shí)的濃度。平衡解離常數(shù)越小，抗體越牢固地結(jié)合于其抗原，或者抗體和抗原之間的結(jié)合親和性越大。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結(jié)合親和性可以具有例如小于IXIO5IT1s人小于IXIO6IT1s入小于IXio7Ir1S-1或者小于IXIO8JrY1的締合速率常數(shù)。在另一實(shí)施方案中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結(jié)合親和性可以具有例如大于IXIO5M-1S—1、大于IXlO6M-1S-1,大于IXIO7M"1s"1或者大于1XIO8M^1s"1的締合速率常數(shù)。在另一些方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結(jié)合親和性可以具有1XIO5M-1S^1-IXIO8IT1S人1XIO6M-1S^1-IXIO8IT1S人1XIO5M-1S^1-IXIO7MY1或1XIO6M"1S^1-IXΙΟΙ、—1的締合速率常數(shù)。在另一實(shí)施方案中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結(jié)合親和性可以具有小于1XΙΟ、—1、小于1XIO-4S-1或小于1XIO-5S-1的解離速率常數(shù)。在該實(shí)施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結(jié)合親和性可以具有例如小于1.OX10_48人小于2.OXKT4S入小于3.OXKT4S入小于4.ΟΧΙΟΛΓ1、小于5.ΟΧΙΟΛΓ1、小于6.OXlO-V1,小于7.OXΙΟΛΓ1、小于8.OXΙΟΛΓ1或小于9.OXKT4s-1的解離速率常數(shù)。在另一實(shí)施方案中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結(jié)合親和性可以具有例如大于1XΙΟ、—1、大于IXKT4iT1或大于IXKT5iT1的解離速率常數(shù)。在該實(shí)施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結(jié)合親和性可以具有例如大于1.OXΙΟΛΓ1、大于2.0XΙΟΛΓ1、大于3.OXl(T4s入大于4.OXl(T4s入大于5.OXΙΟΛΓ1、大于6.OXΙΟΛΓ1、大于7.OXlO-V1,大于8.OXKT4iT1或大于9.OXKT4iT1的解離速率常數(shù)。在另一實(shí)施方案中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結(jié)合親和性可以具有小于0.500nM的平衡解離常數(shù)。在該實(shí)施方案的一些方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結(jié)合親和性可以具有例如小于0.500nM、小于0.450nM、小于0.400nM、小于0.350nM、小于0.300nM、小于0.250nM、小于0.200nM、小于0.150nM、小于0.IOOnM或小于0.050nM的平衡解離常數(shù)。在另一實(shí)施方案中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結(jié)合親和性可以具有大于0.500nM的平衡解離常數(shù)。在該實(shí)施方案的一些方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結(jié)合親和性可以具有例如大于0.500nM、大于0.450nM、大于0.400nM、大于0.350nM,大于0.300nM、大于0.250nM、大于0.200nM、大于0.150nM、大于0.IOOnM或大于0.050nM的平衡解離常數(shù)。仍在另一實(shí)施方案中，a-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對(duì)完整SNAP-25的結(jié)合親和性可以具有例如小于IXIOtlMW小于IXIO1M-1S-1A小于IXIO2M.1s—1、小于IXlO3M-1S-1或小于IXlO4M-1S-1的締合速率常數(shù)。在另一實(shí)施方案中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對(duì)完整SNAP-25的結(jié)合親和性可以具有例如至多1XΚΛ^Γ1、至多IXIO1M-1S—1、至多IXIO2IT1s人至多1XIO3M-1S-1或至多1XIO4M-1S-1的締合速率常數(shù)。結(jié)合特異性是抗體區(qū)分包含其表位的分子和不包含該表位的分子的能力。一種測(cè)量結(jié)合特異性的方式是比較抗體對(duì)于包含其表位的分子的Kon締合速率與抗體對(duì)于不包含該表位的分子的Kon締合速率。例如，比較α-SNAP-25抗體對(duì)在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位與對(duì)不含該表位的SNAP-25的締合速率常數(shù)(Ka)，所述不含該表位的SNAP-25例如在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處不含羧基端的SNAP-25表位，或者具有BoNT/A剪切位點(diǎn)的完整P1-P1'易切斷鍵的SNAP-25表位。在該實(shí)施方案的一些方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對(duì)不包含其表位的SNAP-25具有例如小于1XIO0M1S<、小于IXIO1IT1S人小于IXio2Ir1s\小于IXIO3M1S1或小于IXIO4M-1S-1的締合速率常數(shù)(Ka)。在該實(shí)施方案的其他方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對(duì)不包含其表位的SNAP-25具有例如至多IXKAf1s—1、至多1XIO1MW至多1XΙΟΙ、—1、至多1XΙΟΙ、—1或至多1XlOVs"1的締合速率常數(shù)(Ka)。在該實(shí)施方案的再一些方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對(duì)其表位具有相對(duì)于對(duì)不包含該表位的SNAP-25例如至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍或至少9倍的締合速率常數(shù)(Ka)。在該實(shí)施方案的又一些方面中，α-SNAP-25抗體一一該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對(duì)其表位具有相對(duì)于對(duì)不包含該表位的SNAP-25例如至少10倍、至少100倍、至少1，000倍或至少10，000倍的締合速率常數(shù)(Ka)。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對(duì)其表位具有相對(duì)于對(duì)不包含該表位的SNAP-25例如至多1倍、至多2倍、至多3倍、至多4倍、至多5倍、至多6倍、至多7倍、至多8倍或至多9倍的締合速率常數(shù)(Ka)。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對(duì)其表位具有相對(duì)于對(duì)不包含該表位的SNAP-25例如至多10倍、至多100倍、至多1，000倍或至多10，000倍的締合速率常數(shù)(Ka)。α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——的結(jié)合特異性還可表征為α-SNAP-25抗體可以區(qū)分其SNAP-25表位與不包含該表位的SNAP-25的這樣一個(gè)比值，所述不含該表位的SNAP-25例如在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處不含羧基端的SNAP-25表位或者具有BoNT/A剪切位點(diǎn)的完整P1-P/易切斷鍵的SNAP-25表位。在該實(shí)施方案的一些方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對(duì)其SNAP-25表位與對(duì)不包含該表位的SNAP-25具有例如至少21、至少31、至少41、至少51、至少641、至少71、至少81、至少91、至少101、至少151、至少201、至少251、至少301、至少351或至少401的結(jié)合特異性比。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對(duì)其SNAP-25表位與對(duì)在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處不含羧基端的SNAP-25具有例如至少21、至少31、至少41、至少51、至少61、至少71、至少81、至少91、至少101、至少151、至少201、至少251、至少301、至少351或至少401的結(jié)合特異性比。又在該實(shí)施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗體——該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——對(duì)其SNAP-25表位與對(duì)具有BoNT/A剪切位點(diǎn)的完整？工寸/易切斷鍵的SNAP-25具有例如至少21、至少31、至少41、至少51、至少641、至少71、至少81、至少91、至少101、至少151、至少201、至少251、至少301、至少351或至少401的結(jié)合特異性比。結(jié)合親合力(也稱為功能性親和性)是指多價(jià)抗體和其抗原之間的功能性結(jié)合強(qiáng)度的總和?？贵w分子可以具有不止一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(例如IgG有2個(gè)，IgM有10個(gè))，并且許多抗原包含不止一個(gè)抗原性位點(diǎn)。雖然抗體的結(jié)合親合力取決于各個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合親和性，但結(jié)合親合力大于結(jié)合親和性，因?yàn)橐耆怆x抗體必須使所有抗體-抗原相互作用同時(shí)斷裂。可想象的是，α-SNAP-25抗體一一該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位——可選擇性地結(jié)合于該抗體相應(yīng)的任一和所有表位。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，α-SNAP-25抗體是這樣的α-SNAP-25抗體，即該抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位。在該實(shí)施方案的一些方面中，α-SNAP-25抗體是這樣的α-SNAP-25抗體，即該抗體可選擇性地結(jié)合于具有羧基端谷氨酰胺的SNAP-25表位，或者可選擇性地結(jié)合于具有羧基端賴氨酸的SNAP-25表位。在該實(shí)施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗體是這樣的α-SNAP-25抗體，即該抗體可選擇性地結(jié)合于具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO5的谷氨酰胺197的羧基端P1殘基的SNAP-25表位，或者可選擇性地結(jié)合于具有對(duì)應(yīng)于SEQIDN0:16的賴氨酸204的羧基端P1殘基的SNAP-25表位。又在該實(shí)施方案的另一些方面中，α-SNAP-25抗體是這樣的α-SNAP-25抗體，即該抗體可選擇性地結(jié)合于具有SEQIDNO32、SEQIDNO:33、SEQIDNO34,SEQIDN0:35、SEQIDNO36,SEQIDNO37、SEQIDNO39,SEQIDN0:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:147或SEQIDNO148的羧基端氨基酸序列的SNAP-25表位。本公開的一些方面部分地包括一種基于免疫的檢測(cè)BoNT/A活性的方法。本說明書中公開的基于免疫的方法可通過數(shù)個(gè)參數(shù)進(jìn)行評(píng)估，所述參數(shù)包括例如準(zhǔn)確度、精度、檢出限(LOD)、定量限(LOQ)、范圍、特異性、選擇性、線性、耐用性和系統(tǒng)適用性。方法的準(zhǔn)確度是分析方法的正確性的度量，或者測(cè)量值與通常公認(rèn)的真實(shí)值或公認(rèn)參考值之間相符的22接近度。方法的精度是當(dāng)將方法重復(fù)地應(yīng)用于同質(zhì)樣品的多次采樣時(shí)，各個(gè)試驗(yàn)結(jié)果之間相符的程度。照此，精度可評(píng)估1)測(cè)定內(nèi)變異性；2)日內(nèi)變異性(重復(fù)性)；和幻日間變異性(中間精度)；以及4)實(shí)驗(yàn)室間精度(再現(xiàn)性)。變異系數(shù)(CV%)是相對(duì)于觀測(cè)或理論平均值表達(dá)的精度的定量量度。本說明書中公開的一種基于免疫的方法必須能夠檢測(cè)包含具有在BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的α-SNAP-25抗體-抗原復(fù)合體相對(duì)于背景的存在情況。方法的檢出限(LOD)是指開始給出明顯不同于陰性對(duì)照或空白對(duì)照的信號(hào)的分析物的濃度，代表可以與背景區(qū)分開的分析物的最低濃度。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本說明書中公開的基于免疫的方法可以檢測(cè)其量明顯不同于陰性對(duì)照或空白對(duì)照的BoNT/A的L0D。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOng或更少、9ng或更少、8ng或更少、7ng或更少、6ng或更少、5ng或更少、4ng或更少、3ng或更少、2ng或更少、Ing或更少的BoNT/A的LOD。又在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如900pg或更少、SOOpg或更少、700pg或更少、600pg或更少、500pg或更少、400pg或更少、300pg或更少、200pg或更少、IOOpg或更少的BoNT/A的LOD。在該實(shí)施方案的又一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如90pg或更少、80pg或更少、70pg或更少、60pg或更少、50pg或更少、40pg或更少、30pg或更少、20pg或更少、IOpg或更少的BoNT/A的L0D。在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、Ipg或更少的BoNT/A的L0D。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如0.9pg或更少、0.8pg或更少、0.7pg或更少、0.6pg或更少、0.5pg或更少、0.4pg或更少、0.3pg或更少、0.2pg或更少、0.Ipg或更少的BoNT/A的LOD。在該實(shí)施方案的另一方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOnM或更少、9nM或更少、8nM或更少、7nM或更少、6nM或更少、5nM或更少、4nM或更少、3nM或更少、2nM或更少或者InM或更少的BoNT/A的L0D。在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如900pM或更少、800pM或更少、700pM或更少、600pM或更少、500pM或更少、400pM或更少、300pM或更少、200pM或更少或者IOOpM或更少的BoNT/A的L0D。在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOOpM或更少、90pM或更少、80pM或更少、70pM或更少、60pM或更少、50pM或更少、40pM或更少、30pM或更少、20pM或更少或者IOpM或更少的BoNT/A的LOD。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOpM或更少的BoNT/A，9pM或更少、8pM或更少、7pM或更少、6pM或更少、5pM或更少、4pM或更少、3pM或更少、2pM或更少或者IpM或更少的BoNT/A的L0D。又在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOOOfM或更少、900fM或更少、800fM或更少、700fM或更少、600fM或更少、500fM或更少、400fM或更少、300fM或更少、200fM或更少或者IOOfM或更少的BoNT/A的LOD。又在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOOfM或更少、90fM或更少、80fM或更少、70fM或更少、60fM或更少、50fM或更少、40fM或更少、30fM或更少、20fM或更少或者IOfM或更少的BoNT/A的L0D。又在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOfM或更少、9fM或更少、8fM或更少、7fM或更少、6fM或更少、5fM或更少、4fM或更少、3fM或更少、2fM或更少或者IfM或更少的肉毒神經(jīng)毒素A的L0D。定量限(LOQ)是可以以可接受的準(zhǔn)確度和精度水平測(cè)量的樣品或樣本中的分析物的最低和最高濃度。定量下限是指檢測(cè)方法始終可以從背景中測(cè)量出的最低劑量。定量上限是指檢測(cè)方法在信號(hào)飽和之前始終可以測(cè)量出的最高劑量。所述方法的線性范圍是定量上限和下限之間的區(qū)域。線性范圍通過定量上限減去定量下限計(jì)算。本文使用的術(shù)語“下限的信噪比”是指所述方法在檢測(cè)下限檢出的信號(hào)除以背景信號(hào)。本文使用的術(shù)語“上限的信噪比”是指所述方法在檢測(cè)上限檢出的信號(hào)除以背景信號(hào)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本說明書中公開的基于免疫的方法可以檢測(cè)其量明顯不同于陰性對(duì)照或空白對(duì)照的BoNT/A的L0Q。在該實(shí)施方案的方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOng或更少、9ng或更少、8ng或更少、7ng或更少、6ng或更少、5ng或更少、4ng或更少、3ng或更少、2ng或更少、Ing或更少的BoNT/A的L0Q。又在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如900pg或更少、SOOpg或更少、700pg或更少、600pg或更少、500pg或更少、400pg或更少、300pg或更少、200pg或更少、IOOpg或更少的BoNT/A的L0Q。在該實(shí)施方案的又一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如90pg或更少、80pg或更少、70pg或更少、60pg或更少、50pg或更少、40pg或更少、30pg或更少、20pg或更少、IOpg或更少的BoNT/A的L0Q。在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如9pg或更少、Spg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、Ipg或更少的BoNT/A的LOQ0仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如0.9pg或更少、0.8pg或更少、0.7pg或更少、0.6pg或更少、0.5pg或更少、0.4pg或更少、0.3pg或更少、0.2pg或更少、0.Ipg或更少的BoNT/A的LOQ。在該實(shí)施方案的另一方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOnM或更少、9nM或更少、8nM或更少、7nM或更少、6nM或更少、5nM或更少、4nM或更少、3nM或更少、2nM或更少或者InM或更少的BoNT/A的L0Q。在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如900pM或更少、800pM或更少、700pM或更少、600pM或更少、500pM或更少、400pM或更少、300pM或更少、200pM或更少或者IOOpM或更少的BoNT/A的LOQ0在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOOpM或更少、90pM或更少、80pM或更少、70pM或更少、60pM或更少、50pM或更少、40pM或更少、30pM或更少、20pM或更少或者IOpM或更少的BoNT/A的L0Q。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOpM或更少的BoNT/A，9pM或更少、8pM或更少、7pM或更少、6pM或更少、5pM或更少、4pM或更少、3pM或更少、2pM或更少或者IpM或更少的BoNT/A的L0Q。又在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOOOfM或更少、900fM或更少、800fM或更少、700fM或更少、600fM或更少、500fM或更少、400fM或更少、300fM或更少、200fM或更少或者IOOfM或更少的BoNT/A的L0Q。又在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOOfM或更少、90fM或更少、80fM或更少、70fM或更少、60fM或更少、50fM或更少、40fM或更少、30fM或更少、20fM或更少或者IOfM或更少的BoNT/A的L0Q。又在該實(shí)施方案的另一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如IOfM或更少、9fM或更少、8fM或更少、7fM或更少、6fM或更少、5fM或更少、4fM或更少、3fM或更少、2fM或更少或者IfM或更少的BoNT/A的LOQ。可用于實(shí)施本公開的方法的一個(gè)方面的基于免疫的測(cè)定必須具有不超過50%的精度。在該實(shí)施方案的一些方面中，基于免疫的測(cè)定有不超過50%、不超過40%、不超過30%或者不超過20%的精度。在該實(shí)施方案的另一些方面中，基于免疫的測(cè)定有不超過15%、不超過10%或者不超過5%的精度。在該實(shí)施方案的另一些方面中，基于免疫的測(cè)定有不超過4%、不超過3%、不超過2%或者不超過的精度?？捎糜趯?shí)施本公開的方法的一個(gè)方面的基于免疫的測(cè)定必須具有至少50%的準(zhǔn)確度。在該實(shí)施方案的一些方面中，基于免疫的測(cè)定有至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的準(zhǔn)確度。在該實(shí)施方案的另一些方面中，基于免疫的測(cè)定有至少85%、至少90%或至少95%的準(zhǔn)確度。在該實(shí)施方案的另一些方面中，基于免疫的測(cè)定有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的準(zhǔn)確度。本說明書中公開的基于免疫的方法必須具有統(tǒng)計(jì)上顯著的下限信噪比，和具有統(tǒng)計(jì)上顯著的上限信噪比。在該實(shí)施方案的一些方面中，本說明書中公開的基于免疫的方法具有例如至少31、至少41、至少51、至少61、至少71、至少81、至少91、至少101、至少151或至少201的下限信噪比。在該實(shí)施方案的另一些方面中，基于免疫的方法具有例如至少101、至少151、至少201、至少251、至少301、至少351、至少401、至少451、至少501、至少601、至少701、至少801、至少901、至少1001、至少1501、至少2001、至少2501、至少3001、至少；3501、至少4001、至少4501、至少5001、至少5501或至少6001的上限信噪比。方法的特異性定義了所述方法為排除其他相關(guān)組分例如部分活性的分析物或無活性的分析物而測(cè)量目的分析物的能力。方法的選擇性描述了分析方法區(qū)分樣品中不同物質(zhì)的能力。方法的線性是所述方法得出與所述樣品中分析物濃度成正比或者通過定義明確的數(shù)學(xué)變換而成比例的結(jié)果的能力。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本說明書中公開的基于免疫的方法可以區(qū)分部分活化的BoNT/A與完全活化的BoNT/A，所述部分活化的BoNT/A具有例如70%或更少、60%或更少、50%或更少、40%或更少、30%或更少、20%或更少或者10%或更少的完全活化BoNT/A的活性。所述方法的耐用性是在正常(但可變的)試驗(yàn)條件下對(duì)相同樣品獲得的測(cè)試結(jié)果的再現(xiàn)性。方法的魯棒性是對(duì)所述方法不受方法參數(shù)的小而有意的改變影響的能力的量度，并提供了所述方法在正常使用中的可靠性的指示。因此，耐用性可評(píng)估不可避免的變化，而魯棒性可評(píng)估有意的改變。用耐用性和魯棒性評(píng)價(jià)的一般參數(shù)包括凍/融的影響、孵育時(shí)間、孵育溫度、試劑壽命、樣品制備、樣品保存、細(xì)胞傳代數(shù)、毒素批次、純化間變異和切刻(nicking)反應(yīng)間變異。基于細(xì)胞的測(cè)定的魯棒性參數(shù)包括細(xì)胞庫(冷凍的開始、中期和終末)、細(xì)胞傳代水平、細(xì)胞接種密度、細(xì)胞原種密度(培養(yǎng)天數(shù))、燒瓶中的細(xì)胞年齡(接種的等待時(shí)間)、孵育時(shí)間、不同的板、過量的血清和試劑來源。方法的系統(tǒng)適用性是通過分析參比標(biāo)準(zhǔn)確定隨時(shí)間的測(cè)定性能(包括試劑性能和儀器性能)。系統(tǒng)適用性在FDA指導(dǎo)中就以下事實(shí)進(jìn)行了強(qiáng)調(diào)設(shè)備、電子器件、測(cè)定性能和待分析的樣品組成一個(gè)整合的系統(tǒng)。系統(tǒng)適用性可以通過平行性測(cè)試進(jìn)行評(píng)估，也就是在將對(duì)數(shù)劑量相對(duì)于反應(yīng)作圖時(shí)，參照的連續(xù)稀釋和樣品的連續(xù)稀釋應(yīng)給出平行的曲線。本公開的一些方面部分地包括來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“細(xì)胞”是指對(duì)由BoNT/A引起的BoNT/A中毒敏感的任何真核生物細(xì)胞，或者可以攝取BoNT/A的任何真核生物細(xì)胞。術(shù)語細(xì)胞涵蓋來自多種生物的細(xì)胞，例如鼠科動(dòng)物細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、豬細(xì)胞、牛細(xì)胞、馬細(xì)胞、靈長(zhǎng)類細(xì)胞和人細(xì)胞；來自多種細(xì)胞類型的細(xì)胞，例如神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞；并且可從異質(zhì)細(xì)胞群、組織或生物體分離或者為它們的一部分。本文使用的術(shù)語“已建立細(xì)胞系”與“永生化細(xì)胞系”或“轉(zhuǎn)化細(xì)胞系”同義，是指從源自生物體、組織或器官來源的細(xì)胞群中選擇用于無限增殖的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。根據(jù)定義，已建立細(xì)胞系排除了原代細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。本文使用的術(shù)語“原代細(xì)胞”是直接從新鮮組織或器官采集的細(xì)胞，不具備無限增殖的能力。已建立細(xì)胞系可以包括異質(zhì)細(xì)胞群或均質(zhì)細(xì)胞群。源自單細(xì)胞的已建立細(xì)胞系被稱為克隆細(xì)胞系。已建立細(xì)胞系可以是這樣的細(xì)胞系，即其細(xì)胞內(nèi)源性地表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行全部細(xì)胞機(jī)制——藉此機(jī)制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且該機(jī)制涵蓋BoNT/A與BoNT/A受體的結(jié)合、神經(jīng)毒素/受體復(fù)合體的內(nèi)化、BoNT/A輕鏈從細(xì)胞內(nèi)囊泡至細(xì)胞質(zhì)的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切——必需的所有組分?；蛘?，已建立細(xì)胞系可以是這樣的細(xì)胞系，即其細(xì)胞已從外源導(dǎo)入至少一種對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行全部細(xì)胞機(jī)制——藉此機(jī)制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且該機(jī)制涵蓋BoNT/A與BoNT/A受體的結(jié)合、神經(jīng)毒素/受體復(fù)合體的內(nèi)化、BoNT/A輕鏈從細(xì)胞內(nèi)囊泡至細(xì)胞質(zhì)的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切一一必需的組分。還要提及的是通過遺傳工程建立的細(xì)胞系，來自這種已建立細(xì)胞系的細(xì)胞可以表達(dá)例如外源性FGFR2、外源性FGFR3、外源性SV2、外源性SNAP-25或者它們的任意組合。本公開的一些方面部分地包括一種來自對(duì)BoNT/A中毒敏感的已建立細(xì)胞系的細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“對(duì)BoNT/A中毒敏感的細(xì)胞”、“對(duì)由BoNT/A引起的BoNT/A中毒敏感的細(xì)胞”或“來自對(duì)由BoNT/A引起的BoNT/A中毒敏感的已建立細(xì)胞系的細(xì)胞”是指可以進(jìn)行全部細(xì)胞機(jī)制一一藉此機(jī)制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且該機(jī)制涵蓋BoNT/A與BoNT/A受體的結(jié)合、神經(jīng)毒素/受體復(fù)合體的內(nèi)化、BoNT/A輕鏈從細(xì)胞內(nèi)囊泡至細(xì)胞質(zhì)的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切——的細(xì)胞。根據(jù)定義，對(duì)BoNT/A中毒敏感的細(xì)胞必須表達(dá)或者被工程化以表達(dá)至少一種BoNT/A受體和至少一種SNAP-25底物。本文使用的術(shù)語“可以攝取BoNT/A的細(xì)胞”或“可以攝取BoNT/A的已建立細(xì)胞系包含的細(xì)胞”是指可以進(jìn)行全部細(xì)胞機(jī)制——藉此機(jī)制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，并且該機(jī)制涵蓋BoNT/A與BoNT/A受體的結(jié)合、神經(jīng)毒素/受體復(fù)合體的內(nèi)化、BoNT/A輕鏈從細(xì)胞內(nèi)囊泡至細(xì)胞質(zhì)的易位以及SNAP-25的蛋白酶解剪切——的細(xì)胞。根據(jù)定義，可以攝取BoNT/A的細(xì)胞必須表達(dá)或者被工程化以表達(dá)至少一種BoNT/A受體和至少一種SNAP-25底物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)BoNT/A中毒是敏感的。在該實(shí)施方案的一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)由例如約500pM或更少、約400pM或更少、約300pM或更少、約200pM或更少或者約IOOpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)由例如約90pM或更少、約80pM或更少、約70pM或更少、約60pM或更少、約50pM或更少、約40pM或更少、約30pM或更少、約20pM或更少或者約IOpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。26又在另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)由例如約9pM或更少、約8pM或更少、約7pM或更少、約6pM或更少、約5pM或更少、約4pM或更少、約3pM或更少、約2pM或更少或者約IpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。仍在另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)由例如約0.9pM或更少、約0.8pM或更少、約0.7pM或更少、約0.6pM或更少、約0.5pM或更少、約0.4pM或更少、約0.3pM或更少、約0.2pM或者約0.IpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。本文使用的術(shù)語“約”在修飾陳述項(xiàng)目、數(shù)目、百分?jǐn)?shù)或條件的值時(shí)，是指所陳述項(xiàng)目、數(shù)目、百分?jǐn)?shù)或條件的值加減百分之十的范圍。在另一實(shí)施方案中，已建立細(xì)胞系包含的細(xì)胞可以攝取BoNT/A。在該實(shí)施方案的一些方面中，已建立細(xì)胞系包含的細(xì)胞可以攝取例如約500pM或更少、約400pM或更少、約300pM或更少、約200pM或更少或者約IOOpM或更少的BoNT/A。在該實(shí)施方案的另一些方面中，已建立細(xì)胞系包含的細(xì)胞具有攝取約90pM或更少、約80pM或更少、約70pM或更少、約60pM或更少、約50pM或更少、約40pM或更少、約30pM或更少、約20pM或更少或者約IOpM或更少的BoNT/A的能力。還在另一些方面中，已建立細(xì)胞系包含的細(xì)胞具有攝取約9pM或更少、約8pM或更少、約7pM或更少、約6pM或更少、約5pM或更少、約4pM或更少、約3pM或更少、約2pM或更少或者約IpM或更少的BoNT/A的能力。仍在另一些方面中，已建立細(xì)胞系包含的細(xì)胞具有攝取約0.9pM或更少、約0.8pM或更少、約0.7pM或更少、約0.6pM或更少、約0.5pM或更少、約0.4pM或更少、約0.3pM或更少、約0.2pM或更少或者約0.IpM或更少的BoNT/A的能力。本公開的一些方面部分地包括BoNT/A。本文使用的術(shù)語“BoNT/A”與“血清型A肉毒神經(jīng)毒素”或“A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素”同義，是指天然BoNT/A和非天然BoNT/A，除了包括約150kDa的BoNT/A神經(jīng)毒素自身之外，還包括包含約150kDa的BoNT/A神經(jīng)毒素和關(guān)聯(lián)的非毒素相關(guān)蛋白(NAP)的BoNT/A復(fù)合體。BoNT/A復(fù)合體的非限制性實(shí)例包括例如900-kDa的BoNT/A復(fù)合體、500_kDa的BoNT/A復(fù)合體、300_kDa的BoNT/A復(fù)合體。約150kDa的BoNT/A神經(jīng)毒素的非限制性實(shí)例包括例如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4。本文使用的術(shù)語“天然BoNT/A”是指通過天然過程產(chǎn)生的任何BoNT/A，非限制地包括從翻譯后修飾、可變剪接轉(zhuǎn)錄或自發(fā)突變產(chǎn)生的BoNT/A異型體(isoform)；以及BoNT/A亞型，例如BoNT/A1亞型、BoNT/A2亞型、BoNT/A3亞型、BoNT/A4亞型和BoNT/A5亞型。天然BoNT/A非限制地包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO4，或者從SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO4置換、缺失或添加例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)氨基酸而得到的序列?？墒匈彽奶烊籅oNT/A的藥物組合物非限制地包括BOTOX(Allergan,Inc.，Irvine,CA),DYSPORT/RELOXIN(IpsenLtd.，Slough,England)、PURTOX(MentorCorp.，SantaBarbara,CA)、XEOMIN(MerzPharmaceuticals,GmbH.,Frankfurt,Germany)、NEURONOX(Medy-Tox,Inc.,Ochang-myeon,SouthKorea)或BTX-A。本文使用的術(shù)語“非天然BoNT/A”是指其結(jié)構(gòu)借助人的操作被修飾的任何BoNT/A，非限制地包括通過使用隨機(jī)誘變或合理設(shè)計(jì)的遺傳工程產(chǎn)生的氨基酸序列27被改變的BoNT/A；或者通過體外化學(xué)合成產(chǎn)生的BoNT/A。非天然BoNT/A的非限制性實(shí)例記載于例如Steward,L.Ε.etal.,Post-translationalModificationsandClostridialNeurotoxins,__#^lJ7,223,577；Dolly,J.0.etal.,ActivatableClostridialToxins,美國專禾丨JNo.7,419,676；Steward,L.Ε.etal.,ClostridialNeurotoxincompositionsandModifiedClostridialNeurotoxins,US2004/0220386；Steward,L.E.etal.,ModifiedClostridialToxinsWithEnhancedTargetingCapabilitiesForEndogenousClostridialToxinReceptorSystems,美國專利公開文^No.2008/0096248；Steward,L.Ε.etal.,ModifiedClostridialToxinsWithAlteredTargetingCapabilitiesForClostridialToxinTargetCells，美m(xù)禾公開文*No.2008/0161543；Steward,L.Ε.etal.,ModifiedClostridialToxinsWithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForClostridialToxinTargetCells，美國專利公開文本Να2008/0M1881中，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所要檢測(cè)的BoNT/A活性來自天然BoNT/A。在該實(shí)施方案的一些方面中，所要檢測(cè)的BoNT/A活性來自BoNT/A異型體或BoNT/A亞型。在該實(shí)施方案的一些方面中，所要檢測(cè)的BoNT/A活性來自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO3或SEQIDNO:4的BoNT/A。在該實(shí)施方案的另一些方面中，所要檢測(cè)的BoNT/A活性來自與SEQIDN0:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的BoNT/A。在該實(shí)施方案的另一些方面中，所要檢測(cè)的BoNT/A活性來自BOTOX,DYSPORT/RELOXIN、PURTOX’、XEOMIN、NEURONOX或btxA。在另一實(shí)施方案中，所要檢測(cè)的BoNT/A活性來自非天然BoNT/A。在該實(shí)施方案的另一些方面中，所要檢測(cè)的BoNT/A活性來自與SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然BoNT/A變體。在該實(shí)施方案的另一些方面中，所要檢測(cè)的BoNT/A活性來自相對(duì)于SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO3或SEQIDNO4具有例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)或更多非連續(xù)氨基酸置換、缺失或添加的非天然BoNT/A變體。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，所要檢測(cè)的BoNT/A活性來自相對(duì)于SEQIDN0:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4具有例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)或更多連續(xù)氨基酸置換、缺失或添加的非天然BoNT/A變體。本公開的一些方面部分地包括SNAP-25。本文使用的術(shù)語“SNAP-25”是指優(yōu)先被BoNT/A剪切的天然SNAP-25或非天然SNAP-25。本文使用的術(shù)語“優(yōu)先被......剪切”是指，BoNT/A對(duì)BoNT/A底物的剪切速率比BoNT/A對(duì)任何其他底物的剪切速率高至少1個(gè)數(shù)量級(jí)。在該實(shí)施方案的一些方面中，BoNT/A對(duì)BoNT/A底物的剪切速率比BoNT/A對(duì)任何其他底物的剪切速率高至少2個(gè)數(shù)量級(jí)、高至少3個(gè)數(shù)量級(jí)、高至少4個(gè)數(shù)量級(jí)或者高至少5個(gè)數(shù)量級(jí)。本文使用的術(shù)語“天然SNAP-25”是指通過天然過程產(chǎn)生的任何SNAP-25，非限制地包括從翻譯后修飾、可變剪接轉(zhuǎn)錄或自發(fā)突變產(chǎn)生的SNAP-25異型體，以及SNAP-25亞型。天然SNAP-25非限制地包括SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO8、SEQIDNO9,SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20,SEQIDNO:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDN0:24，或者從SEQIDNO:5、SEQIDNO:6,SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO:10,SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO23或SEQIDNO24置換、缺失或添加例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)或更多氨基酸而得到的序列。本文使用的術(shù)語“非天然SNAP-25”是指其結(jié)構(gòu)借助人的操作被修飾的任何SNAP-25，非限制地包括通過使用隨機(jī)誘變或合理設(shè)計(jì)的遺傳工程產(chǎn)生的SNAP-25；或者通過體外化學(xué)合成產(chǎn)生的SNAP-25。非天然SNAP-25的非限制性實(shí)例記載于例如Meward，L.Ε.etal.,FRETProteaseAssaysforClostridialToxins,美國專利7,332,567；Fernandez-Salasetal.,LipohilicDye-basedFRETAssaysforClostridialToxinActivity，美國專利公開文本2008/0160561，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。非天然SNAP-25可以從SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO9,SEQIDNO10,SEQIDNO:1USEQIDNO12,SEQIDNO13,SEQIDNO14,SEQIDNO15,SEQIDNO16,SEQIDNO17,SEQIDNO18,SEQIDNO19,SEQIDNO20、SEQIDN0:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNOJ4置換、缺失或添加例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)或更多氨基酸。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，SNAP-25是天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的一些方面中，所述SNAP-25是SNAP-25異型體或SNAP-25亞型。在該實(shí)施方案的一些方面中，所述天然SNAP-25是SEQIDNO5,SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO:10,SEQIDN0:11、SEQIDNO:12,SEQIDNO:13,SEQIDNO:14、SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDNO:24的天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的另一些方面中，所述SNAP-25是與SEQIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDNO:9,SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18,SEQIDNO:19,SEQIDNO:20、SEQIDNO:21,SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然SNAP-25。在另一實(shí)施方案中，SNAP-25是非天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的另一些方面中，所述SNAP-25是與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO3或SEQIDNO4具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的另一些方面中，所述SNAP-25是相對(duì)于SEQIDNO:5、SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10,SEQIDNO=IUSEQIDNO:12,SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19,SEQIDNO:20,SEQIDN0:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDNO24具有例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)或更多非連續(xù)氨基酸置換、缺失或添加的非天然SNAP-25。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，所述SNAP-25是相對(duì)于SEQIDNO:5、SEQIDN0:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8,SEQIDN0:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO=IUSEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20,SEQIDNO:21、SEQIDNO:22,SEQIDNO:23或SEQIDNO:24具有例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)或更多連續(xù)氨基酸置換、缺失或添加的非天然SNAP-25。SNAP-25可以是內(nèi)源性SNAP-25或外源性SNAP-25。本文使用的術(shù)語“內(nèi)源性SNAP-25”是指天然存在于細(xì)胞中的SNAP-25，因?yàn)樗烊坏卦谒黾?xì)胞的基因組中被編碼，使得所述細(xì)胞固有地表達(dá)所述SNAP-25，而不需要外源SNAP-25或者編碼SNAP-25的外源遺傳物質(zhì)。內(nèi)源性SNAP-25的表達(dá)可以需要也可以不需要環(huán)境刺激例如細(xì)胞分化。根據(jù)定義，內(nèi)源性SNAP-25只能是天然SNAP-25或其變體。例如，如下已建立細(xì)胞系表達(dá)內(nèi)源性SNAP-25:BE(2)-M17、Kelly、LAl_55n、N1E-115、N4TG3、N18、Neuro_2a、NG108-15、PC12、SH-SY5Y、SiMa和SK-N-BE(2)-C。本文使用的術(shù)語“外源性SNAP-25”是指通過人的操作導(dǎo)入外源性SNAP-25或編碼SNAP-25的外源性遺傳物質(zhì)而在細(xì)胞中表達(dá)的SNAP-25。外源性SNAP-25的表達(dá)可以需要也可以不需要環(huán)境刺激，例如細(xì)胞分化。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞可以通過SNAP-25的瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而表達(dá)外源性SNAP-25。作為另一個(gè)非限制性實(shí)例，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞可以通過SNAP-25的蛋白轉(zhuǎn)染而表達(dá)外源性SNAP-25。外源性SNAP-25可以是天然SNAP-25或其變體，或者非天然SNAP-2或其變體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞可表達(dá)內(nèi)源性SNAP-25。在該實(shí)施方案的一些方面中，由來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性SNAP-25是天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的另一些方面中，由來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性SNAP-25是SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO10,SEQIDNO=IUSEQIDNO12,SEQIDNO13,SEQIDNO14、SEQIDNO15,SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO22,SEQIDNO23或SEQIDNO:24。在該實(shí)施方案的再一些方面中，由來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性SNAP-25是天然SNAP-25，例如SNAP-25異型體或SNAP-25亞型。在該實(shí)施方案的另一些方面中，由來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性SNAP-25是與SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO10、SEQIDNO11,SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO22,SEQIDNO23或SEQIDNO:具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然SNAP-25。在另一實(shí)施方案中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)外源性SNAP-25。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)SEQIDNO5,SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21,SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:24的天然SNAP-25。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)天然SNAP-25，例如SNAP-25異型體或SNAP-25亞型。又在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)與SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO8,SEQIDNO9,SEQIDNO10、SEQIDNO=IUSEQIDNO12,SEQIDNO13、SEQIDN0:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO20,SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO23或SEQIDNO24具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然SNAP-250在該實(shí)施方案的另一方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)非天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)與SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO9,SEQIDNO10、SEQIDN0:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17,SEQIDNO:18,SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:24具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然SNAP-25。在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)相對(duì)于SEQIDNO5,SEQIDN0:6、SEQIDNO7,SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12,SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17,SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:具有例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)或更多非連續(xù)氨基酸置換、缺失或添加的非天然SNAP-25。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)相對(duì)于SEQIDNO5,SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21,SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:24具有例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)或更多連續(xù)氨基酸置換、缺失或添加的非天然SNAP-25。31檢測(cè)BoNT/A底物在暴露于BoNT/A后的剪切的測(cè)定可用于評(píng)估細(xì)胞是否表達(dá)內(nèi)源性或外源性SNAP-25。在這些測(cè)定中，SNAP-25剪切產(chǎn)物的生成會(huì)在BoNT/A處理后的表達(dá)SNAP-25的細(xì)胞中檢測(cè)到。成熟的試劑、條件和方案以及具體蛋白質(zhì)印跡分析的非限制性實(shí)例可容易地獲自商業(yè)的供應(yīng)商，非限制地包括AmershamBiosciences,Piscataway,NJ；Bio-RadLaboratories,Hercules,CA；PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL；PromegaCorporation,Madison,WI,andStratagene,Inc.,LaJolla，GA0/Si角￠1:，胃SNAP-25剪切的這些測(cè)定和類似測(cè)定可用于鑒定表達(dá)內(nèi)源性或外源性SNAP-25的細(xì)胞。作為非限制性實(shí)例，使用可識(shí)別BoNT/ASNAP-25剪切產(chǎn)物或者可識(shí)別剪切和非剪切兩種形式SNAP-25的抗體的蛋白質(zhì)印跡分析可用于測(cè)定BoNT/A的攝取?？捎糜谶@些測(cè)定中的α-SNAP-25抗體實(shí)例非限制地包括α-SNAP-25小鼠單克隆抗體SMI-81(SternbergerMonoclonalsInc.，Lutherville,MD)、小鼠α-SNAP-25單克隆抗體CI71.1(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、α-SNAP-25小鼠單克隆抗體CI71.2(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、α-SNAP-25/Mt(Abeam,Cambridge,MA)、α-SNAP-25^,^^Hiilifiiyf(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、α-SNAP-25兔多克隆抗血清(Abcam，Cambridge,MA)和α-SNAP-25兔多克隆抗血清S9684(Sigma,StLouis,MO)。本公開的一些方面部分地包括一種BoNT/A受體。本文使用的術(shù)語“BoNT/A受體”是指以誘發(fā)BoNT/A中毒反應(yīng)的方式優(yōu)先與BoNT/A相互作用的天然BoNT/A受體或非天然BoNT/A受體。本文使用的術(shù)語“優(yōu)選與......相互作用”是指BoNT/A對(duì)BoNT/A受體的平衡解離常數(shù)(KD)比BoNT/A對(duì)細(xì)胞表面的任何其他受體的平衡解離常數(shù)低至少一個(gè)數(shù)量級(jí)。所述平衡解離常數(shù)是一種測(cè)量BoNT/A-BoNT/A受體復(fù)合體可逆地分離(解離)成其組分分子(即BoNT/A和BoNT/A受體)的具體平衡常數(shù)類型，定義為KD=Ka/Kd(平衡時(shí))。所述締合常數(shù)(Ka)定義為Ka=[C]/[L][R]，所述解離常數(shù)(KD)定義為Kd=[L][R]/[C]，其中[L]等于BoNT/A的摩爾濃度，[R]是BoNT/A受體的摩爾濃度，[C]是BoNT/A-BoNT/A受體復(fù)合體的摩爾濃度，并且所有濃度都是當(dāng)系統(tǒng)平衡時(shí)這些組分的濃度。解離常數(shù)越小，BoNT/A與其受體的結(jié)合越牢固，或者BoNT/A和BoNT/A受體之間的結(jié)合親和性越大。在該實(shí)施方案的一些方面中，BoNT/A對(duì)BoNT/A受體的解離常數(shù)比BoNT/A對(duì)任何其他受體的解離常數(shù)低至少2個(gè)數(shù)量級(jí)、低至少3個(gè)數(shù)量級(jí)、低至少4個(gè)數(shù)量級(jí)或者低至少5個(gè)數(shù)量級(jí)。在該實(shí)施方案的另一些方面中，優(yōu)先與BoNT/A受體相互作用的BoNT/A的結(jié)合親和性可以具有例如500nM或更小、400nM或更小、300nM或更小、200nM或更小或者IOOnM或更小的平衡解離常數(shù)(KD)。在該實(shí)施方案的另一些方面中，優(yōu)先與BoNT/A受體相互作用的BoNT/A的結(jié)合親和性可以具有例如90nM或更小、80nM或更小、70nM或更小、60nM，50nM或更小、40nM或更小、30nM或更小、20nM或更小或者IOnM或更小的平衡解離常數(shù)(KD)。本文使用的術(shù)語“誘發(fā)BoNT/A中毒反應(yīng)”是指BoNT/A受體與BoNT/A相互作用以形成神經(jīng)毒素/受體復(fù)合體并隨后使該復(fù)合體內(nèi)化至細(xì)胞質(zhì)中的能力。本文使用的術(shù)語“天然BoNT/A受體”是指通過天然過程產(chǎn)生的任何BoNT/A受體，非限制地包括通過翻譯后修飾、可變剪接轉(zhuǎn)錄或自發(fā)突變產(chǎn)生的BoNT/A受體異型體，以及BoNT/A受體亞型。天然BoNT/A受體非限制地包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGFR2)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子3(FGFR3)、突觸囊泡糖蛋白(SM)和復(fù)合神經(jīng)節(jié)苷脂如GTlb，例如以下文獻(xiàn)中描述的那些:EsterFernandez-Salas,etal.,BotulinumToxinScreeningAssays,美國專利公開文本2008/0003240；EsterFernandez-Salas,etal.，BotulinumToxinScreeningAssays，美國專利公開文本2008/0182799;MinDongetal.,SV2istheProteinReceptorforBotulinumNeurotoxinA,Science(2006)；S.Mahrholdetal,TheSynapticVesicleProtein2CMediatestheUptakeofBotulinumNeurotoxinAintoPhrenicNerves,580(8)FEBSLett.2011-2014(2006)，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。天然FGFR2非限制地包括SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO67、SEQIDNO:68、SEQIDNO69和SEQIDNO:70，或者從SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO69和SEQIDNO70置換、缺失或添加例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)或更多氨基酸而得到的序列。天然FGFR3非限制地包括SEQIDNO25,SEQIDN0:洸和SEQIDN0:27，或者從SEQIDNO25、SEQIDNOJ6和SEQIDN0:27置換、缺失或添加例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)或更多氨基酸而得到的序列。天然SV2非限制地包括SEQIDNO:28、SEQIDNO29,SEQIDNO30禾口SEQIDNO:31，或者從SEQIDNO28,SEQIDNO29,SEQIDN0:30和SEQIDNO:31置換、缺失或添加例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)或更多氨基酸而得到的序列。本文使用的術(shù)語“非天然BoNT/A受體變體”是指借助人的操作或設(shè)計(jì)產(chǎn)生的任何BoNT/A受體，非限制地包括通過使用隨機(jī)誘變或合理設(shè)計(jì)的遺傳工程產(chǎn)生的BoNT/A受體以及通過化學(xué)合成產(chǎn)生的BoNT/A受體。非天然BoNT/A變體的非限制性實(shí)例包括例如保守BoNT/A受體變體、非保守BoNT/A受體變體、BoNT/A受體嵌合變體和活性BoNT/A受體片段。本文使用的術(shù)語“非天然BoNT/A受體”是指其結(jié)構(gòu)借助人的操作被改變的任何BoNT/A受體，非限制地包括通過使用隨機(jī)誘變或理性設(shè)計(jì)的遺傳工程產(chǎn)生的BoNT/A受體以及通過體外化學(xué)合成產(chǎn)生的BoNT/A受體。非天然BoNT/A變體的非限制性實(shí)例記載于例如EsterFernandez-Salas，etal.,BotulinumToxinScreeningAssays，美國專利公幵文本2008/0003240；EsterFernandez-Salas,etal.，BotulinumToxinScreeningAssays,美國專利公開文本2008/0182799中，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。非天然BoNT/A受體可以從SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO29,SEQIDNO30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62,SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68,SEQIDNO:69或SEQIDNO:70置換、缺失或添加例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)或更多氨基酸。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，BoNT/A受體是天然BoNT/A受體，例如FGFR2、FGFR3或SV2。在該實(shí)施方案的一些方面中，所述BoNT/A受體是BoNT/A受體異型體或BoNT/A受體亞型。在該實(shí)施方案的一些方面中，所述天然BoNT/A受體是SEQIDNO25、SEQIDNO:26、SEQIDNO27,SEQIDNO28、SEQIDNO29、SEQIDNO30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO60,SEQIDN0:61、SEQIDNO62,SEQIDNO63,SEQIDNO64、SEQIDNO:65、SEQIDNO66,SEQIDNO67,SEQIDNO68,SEQIDNO:69或SEQIDNO70的天然BoNT/A受體。在該實(shí)施方案的另一些方面中，所述BoNT/A受體是與SEQIDNO25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO59,SEQIDNO60,SEQIDN0:61、SEQIDN0:62、SEQIDNO63,SEQIDNO64,SEQIDNO:65,SEQIDNO:66,SEQIDNO:67,SEQIDNO:68,SEQIDNO:69或SEQIDNO:70具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然BoNT/A受體。在另一實(shí)施方案中，BoNT/A受體是非天然BoNT/A受體，例如通過遺傳工程產(chǎn)生的FGFR2、通過遺傳工程產(chǎn)生的FGFR3或通過遺傳工程產(chǎn)生的SV2。在該實(shí)施方案的另一些方面中，所述BoNT/A受體是與SEQIDNO25、SEQIDNO26、SEQIDNO27、SEQIDNO:28、SEQIDNO29,SEQIDNO30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO62,SEQIDNO63,SEQIDNO64、SEQIDNO65,SEQIDNO66,SEQIDN0:67、SEQIDNO:68,SEQIDNO:69或SEQIDNO:70具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然BoNT/A受體。在該實(shí)施方案的另一些方面中，所述BoNT/A受體是相對(duì)于SEQIDNO25,SEQIDNO26,SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO69或SEQIDNO70具有例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)或更多非連續(xù)氨基酸置換、缺失或添加的非天然BoNT/A受體。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，所述BoNT/A受體是相對(duì)于SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDN0:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67,SEQIDNO:68、SEQIDNO:69或SEQIDNO:70具有例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)或更多連續(xù)氨基酸置換、缺失或添加的非天然BoNT/A受體。BoNT/A受體可以是內(nèi)源性BoNT/A受體或外源性BoNT/A受體。本文使用的術(shù)語“內(nèi)源性BoNT/A受體”是指在細(xì)胞中天然存在的BoNT/A受體，因?yàn)樗烊坏卦谒黾?xì)胞的基因組中被編碼，使得所述細(xì)胞固有地表達(dá)所述BoNT/A受體，而不需要外源的BoNT/A受體或編碼BoNT/A受體的外源遺傳物質(zhì)。內(nèi)源性BoNT/A受體的表達(dá)可以需要也可以不需要環(huán)境刺激，例如細(xì)胞分化或啟動(dòng)子活化。例如，如下已建立細(xì)胞系可表達(dá)至少一種內(nèi)源性BoNT/A受體BE(》-M17、Kelly、LAl-55n、NlE-115、N4TG3、N18、Neuro-2a、NG108-15、PC12、SH-SY5Y、SiMa和SK-N-BE(2)-C。內(nèi)源性BoNT/A受體只能是天然BoNT/A受體或者其天然34變體。本文使用的術(shù)語“外源性BoNT/A受體”是指通過經(jīng)人的操作導(dǎo)入外源BoNT/A受體或編碼BoNT/A受體的外源遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中表達(dá)的BoNT/A受體。外源性BoNT/A受體的表達(dá)可以需要也可以不需要環(huán)境刺激，例如細(xì)胞分化或啟動(dòng)子活化。作為非限制性實(shí)例，通過編碼BoNT/A受體例如FGFR2、FGFR3或SV2的多核苷酸分子的瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞可以表達(dá)一種或多種外源性BoNT/A受體。作為非限制性實(shí)例，通過所述BoNT/A受體例如FGFR2、FGFR3或SV2的蛋白轉(zhuǎn)染，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞可以表達(dá)一種或多種外源性BoNT/A受體。外源性BoNT/A受體可以是天然BoNT/A受體或其天然變體，或者非天然BoNT/A受體或其非天然變體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞可表達(dá)內(nèi)源性BoNT/A受體。在該實(shí)施方案的一些方面中，由來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性BoNT/A受體是天然BoNT/A受體。在該實(shí)施方案的另一些方面中，由來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性BoNT/A受體是SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO68,SEQIDNO69或SEQIDNO:70。在該實(shí)施方案的再一些方面中，由來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性BoNT/A受體是天然BoNT/A受體，例如BoNT/A受體異型體或BoNT/A受體亞型。在該實(shí)施方案的另一些方面中，由來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性BoNT/A受體是與SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO29,SEQIDNO30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62,SEQIDNO:63、SEQIDN0:64、SEQIDNO:65,SEQIDNO:66,SEQIDNO:67,SEQIDNO:68,SEQIDNO:69或SEQIDNO:70具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然BoNT/A受體。在另一實(shí)施方案中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)外源性BoNT/A受體。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)天然BoNT/A受體。在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)SEQIDNO25,SEQIDNO26、SEQIDNO27、SEQIDNO:28、SEQIDNO29,SEQIDNO30,SEQIDN0:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO60,SEQIDN0:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO69或SEQIDNO70的天然BoNT/A受體。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)天然BoNT/A受體，例如BoNT/A受體異型體或BoNT/A受體亞型。又在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)與SEQIDNO25,SEQIDNO:26、SEQIDNO:27,SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO69或SEQIDNO70具有例如至少70%氨基酸同一性、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的天然BoNT/A受體。在該實(shí)施方案的另一方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)非天然BoNT/A受體。在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)與SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO69或SEQIDNO70具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%氨基酸同一性的非天然BoNT/A受體。在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)相對(duì)于SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO31,SEQIDNO59、SEQIDNO60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO64,SEQIDNO65,SEQIDNO66,SEQIDNO67,SEQIDNO68,SEQIDNO:69或SEQIDNO:70具有例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)或更多非連續(xù)氨基酸置換、缺失或添加的非天然BoNT/A受體。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)相對(duì)于SEQIDNO25,SEQIDNO26,SEQIDNO27,SEQIDNO28,SEQIDNO29、SEQIDNO30,SEQIDN0:31、SEQIDNO:59、SEQIDNO60,SEQIDN0:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68,SEQIDNO:69或SEQIDNO:70具有例如1個(gè)或更多、2個(gè)或更多、3個(gè)或更多、4個(gè)或更多、5個(gè)或更多、6個(gè)或更多、7個(gè)或更多、8個(gè)或更多、9個(gè)或更多、10個(gè)或更多、20個(gè)或更多、30個(gè)或更多、40個(gè)或更多、50個(gè)或更多或者100個(gè)或更多連續(xù)氨基酸置換、缺失或添加的非天然BoNT/A受體。在另一實(shí)施方案中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)外源性FGFR2、外源性FGFR3、外源性SV2或它們的組合。在該實(shí)施方案的一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)天然FGFR2、天然FGFR3、天然SV2或它們的任意組合。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)非天然FGFR2、非天然FGFR3、非天然SV2或它們的任意組合。又在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞被瞬時(shí)或穩(wěn)定地工程化以表達(dá)天然FGFR2或非天然FGFR2、天然FGFR3或非天然FGFR3、天然SV2或非天然SV2或者它們的任意組合。表達(dá)一種或多種內(nèi)源性或外源性BoNT/A受體的細(xì)胞可以通過常規(guī)的方法包括毒素?cái)z取的直接和間接測(cè)定進(jìn)行鑒定。確定BoNT/A結(jié)合或攝取性質(zhì)的測(cè)定可用于評(píng)估細(xì)胞是否表達(dá)BoNT/A受體。這類測(cè)定非限制地包括使用標(biāo)記的BoNT/A例如[125I]BoNT/A、[1251]的交聯(lián)測(cè)定，參見，例如NorikoYokosawaetal.，BindingofClostridiumbotulinumtypeCneurotoxintodifferentneuroblastomacelllines,57(1)Infect.Immun.272-277(1989)；NorikoYokosawaetal.,BindingofbotulinumtypeCl,DandEneurotoxinstoneuronalcelllinesandsynaptosomes,29(2)Toxicon261-264(1991)；andTei-ichiNishikietal.，IdentificationofproteinreceptorforClostridiumbotulinumtypeBneurotoxininratbrainsynaptosomes,269(14)J.Biol.Chem.10498-10503(1994)。其他非限制性測(cè)定包括使用標(biāo)記或非標(biāo)記抗體檢測(cè)BoNT/A結(jié)合的免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定，參見例如AtsushiNishikawaetal.,ThereceptorandtransporterforinternalizationofClostridiumbotulinumtypeCprogenitortoxinintoHT-29cells，319(2)Biochem.Biophys.Res.Commun.327-333O004)；以及使用標(biāo)記或非標(biāo)記抗體檢測(cè)結(jié)合的毒素的免疫沉淀測(cè)定，參見例如YukakoFujinagaetal.，MolecularcharacterizationofbindingsubcomponentsofClostridiumbotulinumtypeCprogenitortoxinforintestinalepithelialcellsanderythrocytes,150(Pt5)Microbiology1529-1538(2004)?？捎糜谶@些測(cè)定的抗體非限制地包括選擇對(duì)抗BoNT/A的抗體；選擇對(duì)抗BoNT/A受體如FGFR2、FGFR3或SV2的抗體；以及/或者選擇對(duì)抗神經(jīng)節(jié)苷脂如⑶la、⑶lb、⑶3、GQlb或GTlb的抗體。如果抗體被標(biāo)記，那么分子的結(jié)合可以通過多種方式檢測(cè)，包括蛋白質(zhì)印跡分析、抗體細(xì)胞位置的直接顯微鏡觀察、在洗滌步驟后對(duì)細(xì)胞或結(jié)合有底物的抗體的測(cè)量、流式細(xì)胞術(shù)、電泳或毛細(xì)管電泳、本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的應(yīng)用技術(shù)。如果抗體是未標(biāo)記的，可應(yīng)用標(biāo)記的二級(jí)抗體來間接地檢測(cè)所述結(jié)合的分子，檢測(cè)可同標(biāo)記的抗體那樣進(jìn)行。應(yīng)理解的是，確定BoNT/A攝取性質(zhì)或特征的這些測(cè)定和類似測(cè)定可用于鑒定表達(dá)內(nèi)源性或外源性BoNT/A受體的細(xì)胞。檢測(cè)暴露于BoNT/A后的分子釋放的測(cè)定還可用于評(píng)估細(xì)胞是否表達(dá)一種或多種內(nèi)源性或外源性BoNT/A受體。在這些測(cè)定中，對(duì)分子釋放的抑制將出現(xiàn)于BoNT/A處理后的表達(dá)BoNT/A受體的細(xì)胞中。公知的測(cè)定包括測(cè)量對(duì)放射標(biāo)記的兒茶酚胺從神經(jīng)元釋放的抑制，例如[3H]去甲腎上腺素或[3H]多巴胺釋放，參見例如AFassioetal.，Evidenceforcalcium—dependentvesiculartransmitterreleaseinsensitivetotetanustoxinandBotulinumToxintypeF，90(3)Neuroscience893-902(1999)；禾口SaraStiglianietal.，ThesensitivityofcatecholaminereleasetoBotulinumToxinClandEsuggestsselectivetargetingofVesiclessetintothereadilyreleasablepool，85(2)J.Neurochem.409-421(2003)；或者使用熒光測(cè)定量方法測(cè)量?jī)狠狈影丰尫?，參見，例如AntondePaivaetal.，ArolefortheinterchaindisulfideoritsparticipatingthiolsintheinternalizationofbotulinumNeurotoxinArevealedbyatoxinderivativethatbindstoecto-acceptorsandinhibitstransmitterreleaseintracellularly，268(28)J.Biol.Chem.20838-20844(1993)；GaryW.Lawrenceetal.，Distinctexocytoticresponsesofintactandpermeabilisedchromaffincellsaftercleavageofthe25—kDasynaptosomal-associatedprotein(SNAP-25)orsynaptobrevinbyBotulinumToxinAorB,236(3)Eur.J.Biochem.877-886(1996)禾口；PatrickForanetal.,BotulinumNeurotoxinClcleavesbothsyntaxinandSNAP—25inintactandpermeabilizedchromaffincells!correlationwithitsblockadeofcatecholaminerelease，35(8)Biochemistry2630-2636(1996)0其他非限制性實(shí)例包括測(cè)量對(duì)激素從內(nèi)分泌細(xì)胞例如垂體前葉細(xì)胞或卵巢細(xì)胞釋放的抑制的測(cè)定。應(yīng)理解的是，對(duì)于分子釋放的這些測(cè)定和類似測(cè)定可用于鑒定表達(dá)內(nèi)源性或外源性BoNT/A受體的細(xì)胞。檢測(cè)暴露于BoNT/A后對(duì)BoNT/A底物的剪切的測(cè)定還可以用于評(píng)估細(xì)胞是否表達(dá)一種或多種內(nèi)源性或外源性BoNT/A受體。在這些測(cè)定中，BoNT/A底物剪切產(chǎn)物的生成或完整BoNT/A底物的消失可在BoNT/A處理后的表達(dá)BoNT/A受體的細(xì)胞中檢測(cè)到。成熟的試劑、條件和方案以及具體蛋白質(zhì)印跡分析的非限制性實(shí)例可容易地獲自商業(yè)的供應(yīng)商，37非限制地包括AmershamBiosciences,Piscataway,NJ；Bio-RadLaboratories,Hercules,CA；PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL；PromegaCorporation,Madison,WI,andStratagene,Inc.，LaJolla，CA。應(yīng)理解的是，用于BoNT/A底物剪切的這些測(cè)定或類似測(cè)定可用于鑒定表達(dá)內(nèi)源性或外源性BoNT/A受體的細(xì)胞。作為非限制性實(shí)例，使用識(shí)別BoNT/ASNAP-25剪切產(chǎn)物或者剪切和非剪切兩種形式的SNAP-25的抗體的蛋白質(zhì)印跡分析可以用于測(cè)定BoNT/A的攝取。用于這些測(cè)定的α-SNAP-25抗體的實(shí)例非限制地包括α-SNAP-25小鼠單克隆抗體SMI-81(SternbergerMonoclonalsInc.，Lutherville,MD)、小鼠α-SNAP-25單克隆抗體CI71.1(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、α-SNAP-25/]、IH克CI71.2(SynapticSystems,Goettingen,Germany)>α-SNAP-25/J^3^δ#SP12(Abeam,Cambridge,ΜΑ)、α-SNAP-25^^3^δ.if(SynapticSystems,Goettingen,Germany)、α-SNAP-25兔多克隆抗血清S9684(Sigma，St.Louis,MO)禾Πα-SNAP-25兔多克隆抗血清(Abcam，Cambridge,ΜΑ)。本公開的方面可提供這樣的細(xì)胞，即這種細(xì)胞通過遺傳操作或重組工程化制備以表達(dá)外源性SNAP-25和/或一種或多種外源性BoNT/A受體。用于通過遺傳操作或重組工程化表達(dá)外源性SNAP-25和/或一種或多種外源性BoNT/A受體的細(xì)胞包括可以表達(dá)或者不表達(dá)內(nèi)源性SNAP-25和/或一種或多種內(nèi)源性BoNT/A受體的神經(jīng)元細(xì)胞和非神經(jīng)元細(xì)胞。還應(yīng)理解的是，這類遺傳操作的或重組工程化的細(xì)胞可在組成型、組織特異性、細(xì)胞特異性或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子元件和/或增強(qiáng)子元件的控制下表達(dá)外源性SNAP-25和一種或多種外源性BoNT/A受體。應(yīng)理解的是，可以使用任何細(xì)胞，條件是所述細(xì)胞可被遺傳操作或者被重組工程化以表達(dá)外源性SNAP-25和/或一種或多種外源性BoNT/A受體，并且能夠發(fā)生BoNT/A中毒。用于向細(xì)胞導(dǎo)入編碼對(duì)細(xì)胞進(jìn)行全部細(xì)胞機(jī)制——藉此機(jī)制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物如SNAP-25、FGFR2、FGFR3或SV2——所必需的組分的外源性多核苷酸分子的方法非限制地包括化學(xué)介導(dǎo)的遞送方法，例如磷酸鈣介導(dǎo)的遞送方法、二乙氨乙基(DEAE)葡聚糖介導(dǎo)的遞送方法、脂質(zhì)介導(dǎo)的遞送方法、聚乙烯亞胺(PEI)介導(dǎo)的遞送方法、聚賴氨酸介導(dǎo)的遞送方法和聚凝胺介導(dǎo)的遞送方法；物理介導(dǎo)的遞送方法，例如基因槍、顯微注射、原生質(zhì)體融合和電穿孔；以及病毒介導(dǎo)的遞送方法，例如反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，參見例如IntroducingClonedGenesintoCulturedMammalianCells,pp.16.1-16.62(Sambrook&Russell,eds.,MolecularCloningALaboratoryManual,Vol.3,3rded.2001)；AlessiaColosimoetal.,TransferandExpressionofForeignGenesinMammalianCells,29(2)Biotechniques314-318，320-322，324(2000)；PhilipWashbourne&A.KimberleyMcAllister,TechniquesforGeneTransfertntoNeurons,12(5)Curr.Opin.Neurobiol.566-573(2002)；禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,pp9.16.4-9.16.11(2000)，它們的每一篇均通過援引的方式全文納入本文中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，對(duì)將多核苷酸分子導(dǎo)入細(xì)胞的具體方法的選擇將部分地依賴于所述細(xì)胞是否會(huì)瞬時(shí)或穩(wěn)定地包含對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行全部細(xì)胞機(jī)制——藉此機(jī)制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的組分。編碼對(duì)細(xì)胞進(jìn)行全部細(xì)胞機(jī)制——藉此機(jī)制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的組分的多核苷酸分子的非限制性實(shí)例如下SEQIDNO:130,SEQIDNO131,SEQIDNO132,SEQIDNO:133,SEQIDNO:134、SEQIDNO:135、SEQIDNO:136、SEQIDNO:137或SEQIDNO:138的FGFR2多核苷酸分子；SEQIDNO139,SEQIDNO:140或SEQIDN0:141&FGFR3多核苷酸分子；SEQIDNO:142,SEQIDNO:143或SEQIDNO:144的SV2多核苷酸分子；以及SEQIDNO145或SEQIDNO:146的SNAP-25多核苷酸分子?；瘜W(xué)介導(dǎo)的遞送方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，并且記載于例如MartinJordan&FlorianWorm,TransfectionofAdherentandSuspendedCellsbyCalciumPhosphate,33(2)Methods136-143(2004)；ChunZhangetal.,PolyethylenimineStrategiesforPlasmidDeliverytoBrain—DerivedCells,33(2)Methods144-15(^2004)中，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。這類化學(xué)介導(dǎo)的遞送方法可以通過標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行并且有市售，參見例如CellPhectTransfectionKit(AmershamBiosciences，Piscataway,NJ)；MammalianTransfectionKit，CalciumphosphateandDEAEDextran,(Stratagene，Inc.，LaJolla，CA)；LipofectamineTransfectionReagent(Invitrogen,Inc.,Carlsbad，CA)；ExGen500Transfectionkit(Fermentas，Inc.，Hanover,MD)，以及SuperFectandEffecteneTransfectionKits(Qiagen,Inc.，Valencia,CA)0物理介導(dǎo)的遞送方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，并且記載于例如JeikeE.Biewengaetal.，Plasmid-MediatedGeneTransferinNeuronsusingtheBiolisticsTechnique,71(1)J.Neurosci.Methods.67-75(1997)；JohnO'Brien&SarahC.R.Lummis,BiolisticandDiolisticTransfection:UsingtheGeneGuntoDeliverDNAandLipophilicDyesintoMammalianCells,33(2)Methods121-125(2004)；Μ.Golzioetal.，InVitroandInVivoElectricField-MediatedPermeabilization,GeneTransfer，andExpression,33(2)Methods126-135(2004)；禾口OliverGreschetal.，NewNon-ViralMethodforGeneTransferintoPrimaryCells，33(2)Methods151-163(2004)中，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。病毒介導(dǎo)的遞送方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，并且記載于例如ChooiM.Laietal.，AdenovirusandAdeno-AssociatedVirusVectors,21(12)DNACellBiol.895-913(2002)；IlyaFrolovetal.，Alphavirus-BasedExpressionVectorsStrategiesandApplications,93(21)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.11371-11377(1996)；RolandWolkowiczetal.，LentiviralVectorsfortheDeliveryofDNAintoMammalianCells,246MethodsMol.Biol.391-411(2004)；A.Huser&C.Hofmann,BaculovirusVectorsNoνe1MammaIianCellGene-DeliveryVehiclesandTheirApplications，3(1)Am.J.Pharmacogenomics53-63(2003)；TizianaToninietal.，TransientProductionofRetroviral-andLentiviral-BasedVectorsfortheTransductionofMammalianCells,285MethodsMol.Biol.141-148(2004)；ManfredGossen&HermannBujard，TightControlofGeneExpressioninEukaryoticCellsbyTetracycline-ResponsivePromoters，美國專利No·5，464，758；HermannBujard&ManfredGossen，MethodsforRegulatingGeneExpression，美國專禾丨JNo.5，814，618;DavidS.Hogness,PolynucleotidesEncodingInsectSteroidHormoneReceptorPolypeptidesandCellsTransformedWithSame，美國專利No.5，514，578；DavidS.Hogness，PolynucleotideEncodingInsectEcdysoneReceptor，美國專利6，245，531;ElisabettaVegetoetal.，ProgesteroneReceptorHavingC.TerminalHormoneBindingDomainTruncations，美國專利No.5，364，791；ElisabettaVegetoetal.，MutatedSteroidHormoneReceptors,MethodsforTheirUseandMolecularSwitchforGeneiTherapy,美國專利No.5，874，534，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。這類病毒介導(dǎo)的遞送方法可以通過標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行并且有市售，參見例如ViraP0WerTMAden0ViralExpressionSystem(Invitrogen,Inc.，Carlsbad，CA)禾口ViraPowerAdenoviralExpressionSystemInstructionManual25_0543versionA，Invitrogen，Inc.，(Jul.15，2002)；以及AdEasyAdenoviralVectorSystem(Stratagene，Inc.,LaJolla，CA)禾口AdEasyAdenoviralVectorSystemInstructionManual064004f，Stratagene，Inc0再者，這類病毒介導(dǎo)的遞送方法可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行并且有市售，參見例如BDTet-0ffandTet-OnGeneExpressionSystems(BDBiosciences-Clonetech,PaloAlto,CA)、BDTet-OffandTet-OnGeneExpressionSystemsUserManual,PT3001-1，BDBiosciencesClonetech,(Mar.14,2003)>GeneSwitchSystem(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)>GeneSwitchSystemAMifepristone-RegulatedExpressionSystemforMammalianCellsversionD,25-0313,Invitrogen,Inc.,(Nov.4,2002)；ViraPowerLentiviralExpressionSystem(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)andViraPowerLentiviralExpressionSystemInstructionManual25_0501versionE,Invitrogen,Inc.,(Dec.8,2003)；以及CompleteControlRetroviralInducibleMammalianExpressionSystem(Stratagene,LaJolla,CA)禾口CompleteControlRetroviralInducibleMammalianExpressionSystemInstructionManual,064005eo因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，來自對(duì)BoNT/A中毒敏感的已建立細(xì)胞系的細(xì)胞瞬時(shí)包含編碼對(duì)細(xì)胞進(jìn)行全部細(xì)胞機(jī)制——藉此機(jī)制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的一種組分的多核苷酸分子。在另一實(shí)施方案中，來自對(duì)BoNT/A中毒敏感的已建立細(xì)胞系的細(xì)胞瞬時(shí)包含編碼對(duì)細(xì)胞進(jìn)行全部細(xì)胞機(jī)制——藉此機(jī)制，BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的多種組分的多核苷酸分子。在該實(shí)施方案的一些方面中，來自對(duì)BoNT/A中毒敏感的已建立細(xì)胞系的細(xì)胞瞬時(shí)包含編碼FGFR2、FGFR3、SV2或SNAP-25的多核苷酸分子。在該實(shí)施方案的一些方面中，來自對(duì)BoNT/A中毒敏感的已建立細(xì)胞系的細(xì)胞瞬時(shí)包含編碼SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:133、SEQIDNO:134,SEQIDNO:135,SEQIDNO:136,SEQIDNO:137或SEQIDNO:138的FGFR2的多核苷酸分子。在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自對(duì)BoNT/A中毒敏感的已建立細(xì)胞系的細(xì)胞瞬時(shí)包含編碼SEQIDNO:139,SEQIDNO:140或SEQIDNO:141的FGFR3的多核苷酸分子。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自對(duì)BoNT/A中毒敏感的已建立細(xì)胞系的細(xì)胞瞬時(shí)包含編碼SEQIDNO:142,SEQIDNO:143或SEQIDNO:144的SV2的多核苷酸分子。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自對(duì)BoNT/A中毒敏感的已建立細(xì)胞系的細(xì)胞瞬時(shí)包含編碼SEQIDNO145或SEQIDNO:146的SNAP-25的多核苷酸分子。在另一實(shí)施方案中，來自對(duì)BoNT/A中毒敏感的已建立細(xì)胞系的細(xì)胞穩(wěn)定地包含編碼對(duì)細(xì)胞進(jìn)行全部細(xì)胞機(jī)制——藉此BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必40需的一種組分的多核苷酸分子。在另一實(shí)施方案中，來自對(duì)BoNT/A中毒敏感的已建立細(xì)胞系的細(xì)胞穩(wěn)定地包含編碼對(duì)細(xì)胞進(jìn)行全部細(xì)胞機(jī)制——藉此BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物——所必需的多種組分的多核苷酸分子。在該實(shí)施方案的一些方面中，來自對(duì)BoNT/A中毒敏感的已建立細(xì)胞系的細(xì)胞穩(wěn)定地包含編碼FGFR2、FGFR3、SV2或SNAP-25的多核苷酸分子。在該實(shí)施方案的一些方面中，來自對(duì)BoNT/A中毒敏感的已建立細(xì)胞系的細(xì)胞穩(wěn)定地包含編碼SEQIDNO:130、SEQIDNO:131、SEQIDNO:132、SEQIDNO:133、SEQIDNO:134、SEQIDNO:135、SEQIDNO:136、SEQIDNO:137或SEQIDNO:138的FGFR2的多核苷酸分子。在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自對(duì)BoNT/A中毒敏感的已建立細(xì)胞系的細(xì)胞穩(wěn)定地包含編碼SEQIDNO:139,SEQIDNO:140或SEQIDNO:141的FGFR3的多核苷酸分子。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自對(duì)BoNT/A中毒敏感的已建立細(xì)胞系的細(xì)胞穩(wěn)定地包含編碼SEQIDNO:142,SEQIDNO:143或SEQIDNO:144的SV2的多核苷酸分子。仍在該實(shí)施方案的另一些方面中，來自對(duì)BoNT/A中毒敏感的已建立細(xì)胞系的細(xì)胞穩(wěn)定地包含編碼SEQIDNO145或SEQIDNO:146的SNAP-25的多核苷酸分子。如上述，可以將對(duì)于細(xì)胞進(jìn)行全部細(xì)胞機(jī)制——藉此BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，例如本說明書中公開的SNAP-25、FGFR2、FGFR3或SV2——所必需的組分導(dǎo)入細(xì)胞?？捎糜谟眠f送試劑將這類外源性組分導(dǎo)入細(xì)胞群的任一和所有方法都可使用，條件是該方法可將本說明書中公開的外源性組分瞬時(shí)導(dǎo)入給定細(xì)胞群的至少50%的細(xì)胞中。因此，該實(shí)施方案的一些方面可包括這樣的細(xì)胞群，即其中該給定細(xì)胞群的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%瞬時(shí)包含對(duì)于細(xì)胞進(jìn)行全部細(xì)胞機(jī)制——藉此BoNT/A可蛋白酶解剪切SNAP-25底物，例如本說明書中公開的SNAP-25、FGFR2、FGFR3或SV2——所必需的外源性組分。本文使用的術(shù)語“遞送試劑”是指能夠?qū)崿F(xiàn)或者增強(qiáng)共價(jià)連接、非共價(jià)連接或者以任意其他方式關(guān)聯(lián)的多肽至細(xì)胞中的內(nèi)化的任何分子。因此，術(shù)語“遞送試劑”非限制地涵蓋非限制地將共價(jià)或非共價(jià)連接的分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或核的蛋白、肽、擬肽、小分子、多核苷酸分子、脂質(zhì)體、脂質(zhì)、病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和細(xì)胞。還應(yīng)理解的是，術(shù)語“遞送試劑”涵蓋通過任何機(jī)制內(nèi)化的分子，包括經(jīng)受體介導(dǎo)的胞吞作用發(fā)揮功能的遞送試劑，以及不依賴于受體介導(dǎo)的胞吞作用的遞送試劑。遞送試劑還可以是例如通過化學(xué)軛合或者借助遺傳產(chǎn)生的融合蛋白實(shí)現(xiàn)或者增強(qiáng)共價(jià)連接的組分如FGFR2、FGFR3、SV2或SNAP-25的細(xì)胞攝取的試劑。共價(jià)連接遞送試劑的方法以及使用這類試劑的方法記載于例如MevenF.Dowdy,ProteinTransductionSystemandMethodsofUseThereof，國際公開文本NoWO00/34308；GerardChassaing&AlainProchiantz,PeptideswhichcanbeUsedasVectorsfortheIntracellularAddressingofActiveMolecules,美國專禾丨JNo.6，080，724；AlanFrankeletal.,FusionProteinComprisingTAT-derivedTransportMoiert,美國專利No.5,674,980；AlanFrankeletal.,TAT-derivedTransportPolypeptideConjugates,美國專利No.5，747，641;AlanFrankeletal.,TAT-derivedTransportPolypeptidesandFusionProteins,^H#^lJNo.5,804,604；PeterF.J.0'Hareetal.,UseofTransportProteins,美國專利No.6，734，167；Yao-ZhongLin&JackJ.Hawiger,MethodforImportingBiologicallyActiveMoleculesintoCells,美國專利No.5，807，746;Yao-ZhongLin&JackJ.Hawiger,MethodforImportingBiologicalIyActiveMoleculesintoCells，美國專利No.6，043，339；Yao-ZhongLinetal.，SequenceandMethodforGeneticEngineeringofProteinswithCellMembraneTranslocatingActivity,美國專利No.6，248，558；Yao-ZhongLinetal.，SequenceandMethodforGeneticEngineeringofProteinswithCellMembraneTranslocatingActivity,美國專利No.6，432，680；JackJ.Hawigeretal.，MethodforImportingBiologicallyActiveMoleculesintoCells，美國專利No.6，495，518;Yao_ZhongLinetal.,SequenceandMethodforGeneticEngineeringofProteinswithCellMembraneTranslocatingActivity,美國專禾IjNo.6，780，843JonathanB.Rothbard&PanlAWender,MethodandcompositionforEnhancingTransportAcrossBiologicalMembranes，美國專利No.6，306，993；JonathanB.Rothbard&PaulAWender,MethodandcompositionforEnhancingTransportAcrossBiologicalMembranes，美國專利No.6，495，663；andPamelaB.Davisetal.,FusionProteinsforProteinDelivery，美國專利No·6，287，817中，它們的每一篇均通過援弓ι的方式全文納入本文。遞送試劑還可以是實(shí)現(xiàn)或者增強(qiáng)非共價(jià)連接的組分如FGFR2、FGFR3、SV2c或SNAP-25的細(xì)胞攝取的試劑。在無共價(jià)連接的情況下發(fā)揮功能的方法以及使用這類試劑的方法記載于例如GillesDivitaetal，Peptide-MediatedTransfectionAgentsandMethodsofUse，美國專利No.6，841，535;PhilipLFeignerandOlivierZelphati，IntracellularProteinDeliverycompositionsandMethodsofUse，美國專利公幵文本iNo.2003/0008813；禾口MichaelKaras,IntracellularDeliveryofSmallMolecules，ProteinsandNucleicAcids，美國專利公幵文本2004/0209797中，它們的每一篇均通過援引的方式全文納入本文。這類肽遞送試劑可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備和使用并且有示售，參見例如CHARIOTReagent(ActiveMotif,Carlsbad,CA)；BIO-PORTERReagent(GeneTherapySystems,Inc.,SanDiego,CA)、BIOTREKProteinDeliveryReagent(Stratagene，LaJolla，CA)禾口PRO-JECTProteinTransfectionReagent(PierceBiotechnologyInc.，Rockford，IL)0本公開的一些方面部分地包括一種包含BoNT/A的樣品。本文使用的術(shù)語“包含BoNT/A的樣品”是指包含或可能包含活性BoNT/A的任何生物物質(zhì)。多種樣品可依照本說明書中公開的方法測(cè)定，所述樣品非限制地包括純化的、部分純化的或未純化的BoNT/A;天然或非天然序列的重組單鏈或雙鏈毒素；具有改良蛋白酶特異性的重組BoNT/A；細(xì)胞特異性改變的重組BoNT/A；大體積BoNT/A；制成制劑的BoNT/A產(chǎn)品，包括例如BOTOX、DYSPORT/RELOXIN>XEOMIN,PURTOX、NEURONOX、BTX-A；以及來自例如細(xì)菌、酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物來源的細(xì)胞或者粗的、分離的或部分純化的細(xì)胞裂解液；血液、血漿或血清；生、半熟、熟或經(jīng)加工的食物；飲料；動(dòng)物飼料；土壤樣品；水樣；池塘底泥；洗劑；化妝品；以及臨床制劑。應(yīng)理解的是，術(shù)語樣品涵蓋組織樣品，非限制地包括哺乳動(dòng)物組織樣品；家畜組織樣品如綿羊、牛和豬組織樣品；靈長(zhǎng)類組織樣品；以及人組織樣品。這類樣品非限制地包括腸樣品如嬰兒腸樣品以及獲自傷口的組織樣品。作為非限制性實(shí)例，檢測(cè)皮摩爾量的BoNT/A活性的方法可用于確定BoNT/A在血液或飲料樣品中的存在情況或活性；可用于測(cè)定來自例如暴露于BoNT/A或者42具有一種或多種肉毒中毒癥狀的人或動(dòng)物的樣品；可用于在大體積BoNT/A的產(chǎn)生和純化中跟蹤活性；可用于測(cè)定在藥物或化妝品應(yīng)用中使用的制成制劑的BoNT/A產(chǎn)品；或者可用于測(cè)定受試者血清中是否存在中和α-BoNT/A抗體。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，包含BoNT/A的樣品是包含任意量BoNT/A的樣品。在該實(shí)施方案的一些方面中，包含BoNT/A的樣品包含約IOOng或更少、約IOng或更少、約Ing或更少、約IOOpg或更少、約IOpg或更少或者約Ipg或更少的BoNT/A。在該實(shí)施方案的另一些方面中，包含BoNT/a的樣品包含約1μM或更少、約IOOnM或更少、約IOnM或更少、約InM或更少、約IOOpM或更少、約IOpM或更少、約IpM或更少、約IOOfM或更少、約IOfM或更少或者約IfM或更少的BoNT/A。本公開的一些方面部分地包括從處理細(xì)胞中分離包含在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的SNAP-25組分。本文使用的術(shù)語“包含在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的SNAP-25組分”是指包含所述SNAP-25剪切產(chǎn)物的細(xì)胞組分?？上胂蟮氖?，可以使用適合用于富集或分離SNAP-25組分的任何方法，非限制地包括細(xì)胞裂解方案、離心柱(spin-column)純化方案、免疫沉淀、親和純化和蛋白質(zhì)色譜。本公開的一些方面部分地包括連接于固相支持物的α-SNAP-25抗體。本文使用的術(shù)語“固相支持物”與“固相”同義，是指可以用于固定化本說明書中公開的α-SNAP-25抗體的任何基質(zhì)。固相支持物的非限制性實(shí)例包括例如管；盤；柱；針或“插棒”；磁性顆粒、小珠或其他球狀或纖維狀色譜介質(zhì)，例如瓊脂糖(agarose)、瓊脂糖凝膠(sepharose)、二氧化硅和塑料；以及片或膜，例如硝酸纖維素和二氟化樹脂聚偏氟乙稀(PVDF)。所述固相支持物可以使用很多材料例如玻璃、炭、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、重氮纖維素或淀粉構(gòu)建。所選的固相支持物可以具有這樣的物理性質(zhì)，即該物理性質(zhì)使得它易于與可溶性或未結(jié)合的物質(zhì)分離，并且通?？墒沟梦唇Y(jié)合的物質(zhì)如過量試劑、反應(yīng)副產(chǎn)物或者溶劑從與固相支持物結(jié)合的測(cè)定組分中分離或者除去(通過例如洗滌、過濾、離心等)。如何制備以及使用固相支持物的非限制性實(shí)例記載于例如MolecularCloning,ALaboratoryManual，見上文，(2001)；禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology,JAL上文，Q004)中，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。本公開的一些方面部分地包括檢測(cè)一種包含α-SNAP-25抗體和SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況，所述α"SNAP-25抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位，所述SNAP-25剪切產(chǎn)物在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端?？上胂蟮氖?，任何檢測(cè)體系均可以用于實(shí)施這種公開的基于免疫的方法的一些方面，條件是信噪比可以以統(tǒng)計(jì)顯著的程度將來自所述抗體-抗原復(fù)合體的信號(hào)與背景信號(hào)區(qū)分開。基于免疫的檢測(cè)體系的非限制性實(shí)例包括免疫印跡分析如蛋白質(zhì)印跡和斑點(diǎn)印跡、免疫沉淀分析、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)和夾心ELISA。所述信號(hào)的檢測(cè)可以借助如下技術(shù)使用放射自顯影實(shí)現(xiàn)成像或磷光成像(AU)、化學(xué)發(fā)光(CL)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)、生物發(fā)光(BL)、熒光、共振能轉(zhuǎn)移、平面極化、比色法或流式細(xì)胞術(shù)(FC)。基于免疫的檢測(cè)系統(tǒng)的描述公開于例如MichaelΜ.Rauhut,Chemiluminescence,InKirk-OthmerConciseEncyclopediaofChemicalTechnology(Ed.Grayson,3rded，JohnWileyandSons，1985)；A.W.Knight，AReviewofRecentTrendsinAnalyticalApplicationsofElectrogeneratedChemiluminescence,TrendsAnal.Chem.18(1):47-62(1999)；K.A.Fahnrich,etal.,RecentApplicationsofElectrogeneratedChemiluminescenceinChemicalAnalysis,Talanta54(4):531-559(2001)；CommonIyUsedTechniquesinMolecularCloning,pp.A8.1-A8-55(Sambrook&Russell,eds.,MolecularCloningALaboratoryManual,Vol.3,3rded.2001)；DetectionSystems,pp.A9.1-A9-49(Sambrook&Russell,eds.,MolecularCloningALaboratoryManual,Vol.3,3rded.2001)；ElectrogeneratedChemiluminescence,(Ed.AllenJ.Bard,MarcelDekker,Inc.,2004)中，以^過援引的方式全文納入本文。夾心ELISA(或夾心免疫測(cè)定)是基于結(jié)合所述抗原上不同表位的兩種抗體的方法。將對(duì)目的抗原具有高度結(jié)合特異性的捕獲抗體結(jié)合于固體表面。然后加入所述抗原，并隨后添加被稱為檢測(cè)抗體的二抗。所述檢測(cè)抗體結(jié)合不同于針對(duì)捕獲抗體的抗原表位。所述抗原因此“被夾在”所述兩種抗體之間。所述抗體對(duì)所述抗原的結(jié)合親和性通常是免疫測(cè)定靈敏度的主要決定因素。隨著所述抗原濃度的增加，檢測(cè)抗體的量也增加，導(dǎo)致測(cè)量到更高的反應(yīng)。為了定量結(jié)合的程度，可以使用不同的報(bào)告體系，例如連接于二抗的酶和報(bào)告底物，這里酶促反應(yīng)可形成作為檢測(cè)信號(hào)的讀數(shù)。所形成的信號(hào)與樣品中存在的靶抗原的量成比例。用于測(cè)量所述結(jié)合事件的報(bào)告底物決定所述檢測(cè)模式。分光光度計(jì)板式酶標(biāo)儀用于比色法檢測(cè)。已經(jīng)開發(fā)出了化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光底物，所述底物可進(jìn)一步放大信號(hào)并且可以在發(fā)光酶標(biāo)儀上讀取。所述報(bào)告值還可以是熒光讀數(shù)，這里以熒光團(tuán)代替所述測(cè)定的酶步驟，然后使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)量所述讀數(shù)。對(duì)進(jìn)行ECL夾心ELISA所必需的試劑和方案有市售，非排他地包括MSD夾心ELISA-ECL檢測(cè)平臺(tái)(MesoScaleDiscovery,Gaithersburg,MD)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用免疫印跡分析、免疫沉淀分析、ELISA或夾心ELISA檢測(cè)包含α-SNAP-25抗體和SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況，所述α-SNAP-25抗體可選擇性地結(jié)合于在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25表位，所述SNAP-25剪切產(chǎn)物在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端。在該實(shí)施方案的一些方面中，使用AU、CL、ECL或BL免疫印跡分析；AU、CL、ECL、BL或FC免疫沉淀分析；AU、CL、ECL、BL或FCELISA；或者AU、CL、ECL、BL或FC夾心ELISA進(jìn)行所述檢測(cè)。本公開的一些方面可以以單路或多路的方式實(shí)施。以單路方式實(shí)施的基于免疫的檢測(cè)BoNT/A活性的方法僅檢測(cè)包含α-SNAP-25抗體和SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況，所述SNAP-25剪切產(chǎn)物在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端。以多路方式實(shí)施的基于免疫的檢測(cè)BoNT/A活性的方法同時(shí)檢測(cè)兩種或多種抗體-抗原復(fù)合體的存在情況；其中一種是包含α-SNAP-25抗體和SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體，所述SNAP-25剪切產(chǎn)物在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端；其他的是針對(duì)第二、第三、第四等不同蛋白的抗體-抗原復(fù)合體。例如可以使用第二蛋白作為內(nèi)部對(duì)照物，以通過將檢出的α-SNAP-25/SNAP-25抗體-抗原復(fù)合體的量相對(duì)于對(duì)所述第二蛋白檢出的抗體-抗原復(fù)合體的量標(biāo)準(zhǔn)化而最小化樣品與樣品之間的變異性。照此，所述第二蛋白通常是由所述細(xì)胞恒定表達(dá)的蛋白，例如管家蛋白。可用的第二蛋白的非限制性實(shí)例包括例如甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、突觸融合蛋白、細(xì)胞因子。以多路方式進(jìn)行基于免疫的測(cè)定的方法記載于例如U.B.NielsenandB.H.Geierstanger,MultiplexedSandwichAssaysinMicroarrayFormat,J.Immunol.Methods.290(1-2)107-1202004)；R.BarryandM,Soloviev,QuantitativeProteinProfilingusingAntibodyArrays,Proteomics,4(12):3717-3726(2004)；Μ.Μ.Lingetal.,MultiplexingMolecularDiagnosticsandImmunoassaysusingEmergingMicroarrayTechnologies,ExpertRevMolDiagn.7(1):87-98(2007)；S.X.Lengetal.,ELISAandMultiplexTechnologiesforCytokineMeasurementinInflammationandAgingResearch,JGerontolABiolSciMedSci.63(8):879-884Q008)中，以上每一篇均通過援引的方式全文納入本文。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，基于免疫的檢測(cè)BoNT/A活性的方法通過以下方式以單路的方式實(shí)施僅檢測(cè)包含a-SNAP-25抗體和SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況，所述SNAP-25剪切產(chǎn)物在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端。在另一實(shí)施方案中，基于免疫的檢測(cè)BoNT/A活性的方法通過以下方式以多路的方式實(shí)施同時(shí)檢測(cè)包含a-SNAP-25抗體和SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體以及針對(duì)SNAP-25之外的其他蛋白例如GAPDH或突觸融合蛋白的至少一種其他抗體-抗原復(fù)合體的存在情況，所述SNAP-25剪切產(chǎn)物在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端。本公開的一些方面部分地提供了一種測(cè)定BoNT/A免疫抗性的方法。本文使用的術(shù)語“BoNT/A免疫抗性”是指哺乳動(dòng)物對(duì)于BoNT/A治療不完全反應(yīng)，或者由于以下原因顯示出降低的BoNT/A治療的有利效應(yīng)所述哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)直接或間接地降低所述治療的有效性。有效性降低的非限制性實(shí)例可以是在哺乳動(dòng)物中存在至少一種中和a"BoNT/A抗體，所述中和a-BoNT/A抗體可以以降低或阻斷所述毒素特異性或活性的方式結(jié)合于BoNT/A毒素。本文使用的術(shù)語“BoNT/A治療”是指使用BoNT/A毒素或者給予哺乳動(dòng)物具有醫(yī)學(xué)、治療、治愈、美容、矯正或任何其他有利效應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)受控劑量的BoNT/A毒素的藥劑、制劑或混合物，抵消需要神經(jīng)調(diào)制的哺乳動(dòng)物中的不利事物的治療、矯正、治愈、愈合、康復(fù)或者任何其他方式。BoNT/A治療非限制地涵蓋與任何載體或活性成分組合并通過任何給藥途徑給藥的任何制劑形式的其任何天然或修飾片段的使用。例如，公知的BoNT/A治療是BOTOX治療。本公開的一些方面部分地提供了一種從被測(cè)試是否存在a-BoNT/A中和抗體的哺乳動(dòng)物中獲得的試驗(yàn)樣品。本文使用的術(shù)語“試驗(yàn)樣品”是指包含或可能包含至少一種a-BoNT/A抗體的任何生物物質(zhì)。a-BoNT/A抗體可以是中和抗BoNT/A抗體或非中和抗BoNT/A抗體。本文使用的術(shù)語“中和BoNT/A抗體”是指任何這樣的a-BoNT/A抗體，即該a-BoNT/A抗體在生理?xiàng)l件下會(huì)以減少或阻止所述毒素在BoNT/A治療中發(fā)揮其效應(yīng)的方式結(jié)合于BoNT/A毒素的一個(gè)區(qū)域。本文使用的術(shù)語“非中和a-BoNT/A抗體”是指任何這樣的a-BoNT/A抗體，即該a-BoNT/A抗體在生理?xiàng)l件下會(huì)結(jié)合于BoNT/A毒素的一個(gè)區(qū)域，但不阻止所述毒素在BoNT/A治療中發(fā)揮其效應(yīng)?？上胂蟮氖?，可包含a-BoNT/A抗體的任一和所有樣品均可用于該方法中，所述樣品非限制地包括血液、血漿、血清和淋巴液。另外，能夠產(chǎn)生抗BoNT/A毒素的a-BoNT/A抗體的任一和所有生物均可用作樣品來源，所述生物非限制地包括鳥和哺乳動(dòng)物，所述哺乳動(dòng)物包括小鼠、大鼠、山羊、綿羊、馬、驢、牛、靈長(zhǎng)類和人。用于血液采集和血清制備的具體方案的非限制性實(shí)例記載于例如MarjorieSchaubDiLorenzo&SusanKingStrasinger,BloodCollectioninHealthcaee(F.A.DavisCompany,2001)；禾口DianaGarza&KathleenBecan-McBride,PhlebotomyHandbookBloodCollectionEssentials(PrenticeHall,6thed.,2002)中。這些方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知并且在本文中有教導(dǎo)的常規(guī)方法。試驗(yàn)樣品可在如下時(shí)間從生物體獲得暴露于BoNT/A毒素之前、單次BoNT/A處理后、多次BoNT/A毒素處理后、對(duì)BoNT/A治療的抗性發(fā)生之前或?qū)oNT/A治療的抗性發(fā)生之后。本公開的一些方面部分地提供了一種對(duì)照樣品。本文使用的術(shù)語“對(duì)照樣品”是指已知其中是否存在試驗(yàn)樣品的任何樣品，包括陰性和陽性對(duì)照樣品。對(duì)于中和α-BoNT/A抗體，陰性對(duì)照樣品可以獲自未曾暴露于BoNT/A的個(gè)體，并且可非限制地包括來自提供所述試驗(yàn)樣品的相同個(gè)體、但在進(jìn)行BoNT/A治療前采集的樣品；從未曾暴露于BoNT/A的不同個(gè)體中采集的樣品；從多個(gè)未曾暴露于BoNT/A的不同個(gè)體中采集的混合樣品。對(duì)于中和α-BoNT/A抗體，陽性對(duì)照樣品可以獲自表現(xiàn)出BoNT/A免疫抗性的個(gè)體，所述個(gè)體非限制地包括在基于患者的測(cè)試中測(cè)試為陽性的個(gè)體；在體內(nèi)生物測(cè)定中測(cè)試為陽性的個(gè)體；以及顯示高免疫性的抗體，例如已接種BoNT/A的個(gè)體。還可預(yù)知的是，α-ΒοΝΤ/Α抗體可以從樣品中純化。BoNT/A抗體可以通過多種方法從樣品中純化，所述方法非限制地包括蛋白A/G色譜法和親和色譜法。從樣品中純化抗體的具體方案的非限制性實(shí)例記載于例如Antitodies:ALaboeatoeyManual(EdwardHarlow&DavidLane,eds.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2nded.1998)；UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PoetablePkotocolNO.I(EdwardHarlow&DavidLane,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1998)；禾口MolecularCloning，ALaboeatoeyManual,見上文，O001)中，它們通過援引的方式納入本文。另外，成熟的試劑、條件和方案以及抗體純化方法的非限制性實(shí)例可容易地獲自商業(yè)的供應(yīng)商，非限制地包括PierceBiotechnology,Inc.,Rockford，IL；和ZymedLaboratories,Inc.，SouthSanFrancisco,CA。這些方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品包括血液。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述樣品包括小鼠血、大鼠血、山羊血、綿羊血、馬血、驢血、牛血、靈長(zhǎng)類血或人血。在另一實(shí)施方案中，樣品包括血漿。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，試驗(yàn)樣品包括小鼠血漿、大鼠血漿、山羊血漿、綿羊血漿、馬血漿、驢血漿、牛血漿、靈長(zhǎng)類血漿或人血漿。在另一實(shí)施方案中，樣品包括血清。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述樣品包括小鼠血清、大鼠血清、山羊血清、綿羊血清、馬血清、驢血清、牛血清、靈長(zhǎng)類血清和人血清。在另一實(shí)施方案中，樣品包括淋巴液。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，樣品包括小鼠淋巴液、大鼠淋巴液、山羊淋巴液、綿羊淋巴液、馬淋巴液、驢淋巴液、牛淋巴液、靈長(zhǎng)類淋巴液或人淋巴液。仍在另一實(shí)施方案中，樣品是試驗(yàn)樣品。仍在另一實(shí)施方案中，樣品是對(duì)照樣品。在該實(shí)施方案的一些方面中，對(duì)照樣品是陰性對(duì)照樣品或陽性對(duì)照樣品。本公開的一些方面部分地提供了，對(duì)在步驟(d)中檢出的在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的量與在步驟(e)中檢出的在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25的量進(jìn)行比較。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)樣品中SNAP-25剪切產(chǎn)物的量高于所述對(duì)照樣品中SNAP-25剪切產(chǎn)物的量。在46該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述試驗(yàn)樣品中SNAP-25剪切產(chǎn)物的量比陽性對(duì)照樣品中的高指示所述哺乳動(dòng)物中BoNT/A免疫抗性降低或者無BoNT/A免疫抗性。在該實(shí)施方案的另一方面中，所述試驗(yàn)樣品中SNAP-25剪切產(chǎn)物的量與陰性對(duì)照樣品中的相當(dāng)指示所述哺乳動(dòng)物中BoNT/A免疫抗性降低或者無BoNT/A免疫抗性。在另一實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)樣品中SNAP-25剪切產(chǎn)物的量比對(duì)照樣品中的低。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，所述試驗(yàn)樣品中SNAP-25剪切產(chǎn)物的量比陽性對(duì)照樣品中的低或與之相當(dāng)指示所述哺乳動(dòng)物中BoNT/A免疫抗性增大或者存在BoNT/A免疫抗性。在該實(shí)施方案的另一方面中，所述試驗(yàn)樣品中SNAP-25剪切產(chǎn)物的量比陰性對(duì)照樣品中的低指示所述哺乳動(dòng)物中BoNT/A免疫抗性增大或者存在BoNT/A免疫抗性?？上胂蟮氖?，適合用于檢測(cè)樣品中的中和α-BoNT/A抗體存在情況的任一和所有測(cè)定條件均可用于本說明書中公開的方法中，例如線性測(cè)定條件或非線性測(cè)定條件。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)定條件是線性的。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，BoNT/A的測(cè)定量是過量的。在該實(shí)施方案的另一方面中，BoNT/A的測(cè)定量是限速的。在該實(shí)施方案的另一方面中，試驗(yàn)樣品的測(cè)定量是限速的。本公開的一些方面還可以描述如下1.一種組合物，包含與連接于SNAP-25抗原的柔性連接體連接的載體，所述SNAP-25抗原在BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端。2.1的組合物，其中所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基是谷氨酰胺或賴氨酸。3.1的組合物，其中所述SNAP-25抗原包括SEQIDNO:147。4.1的組合物，其中所述柔性連接體和所述SNAP-25抗原的氨基酸序列是SEQIDNO38或SEQIDNO:46。5.一種分離的α-SNAP-25抗體，其中所述分離的α-SNAP-25抗體結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位。6.5的分離的α-SNAP-25抗體，其中所述α-SNAP-25抗體對(duì)不包含SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的表位具小于1XIO1M-1S-1的締合速率常數(shù)；其中所述α-SNAP-25抗體對(duì)于所述表位具有小于0.450nM的平衡解離常數(shù)。7.5的分離的α-SNAP-25抗體，其中所述分離的α-SNAP-25抗體具有包含選自如下序列的氨基酸序列的重鏈可變區(qū):SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:80和SEQIDNO82；并具有包含選自如下序列的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)SEQIDNO:84,SEQIDNO86,SEQIDNO88,SEQIDNO90禾口SEQIDNO:92。8.5的分離的α_SNAP_25抗體，其中所述分離的α-SNAP-25抗體至少包含SEQIDNO93的VhCDRl、SEQIDNO94的VhCDRl、SEQIDNO95的VhCDRl、SEQIDNO:118的VhCDRl、SEQIDNO:119的VhCDRl或SEQIDNO:120的VhCDRl。9.5的分離的α_SNAP_25抗體，其中所述分離的α-SNAP-25抗體至少包含SEQIDNO96的VhCDR2、SEQIDNO:97的VhCDR2、SEQIDNO98的VhCDR2、SEQIDNO:99的VhCDR2、SEQIDNO:121的VhCDR2、SEQIDNO:122的VhCDR2或SEQIDNO:123的VHCDR2。10.5的分離的α-SNAP-25抗體，其中所述分離的α-SNAP-25抗體至少包含SEQIDNO100的VhCDR3、SEQIDNO:101的VhCDR3、SEQIDNO:102的VhCDR3或SEQIDNO124的VhCDR3。11.5的分離的α-SNAP-25抗體，其中所述分離的α-SNAP-25抗體至少包含SEQIDNO103的VlCDRl、SEQIDNO:104的\CDRl、SEQIDNO:105的\CDRl、SEQIDNO106的\CDRl、SEQIDNO:107的\CDRl、SEQIDNO:125的\CDRl、SEQIDNO126的VlCDRI、SEQIDNO:127的\CDRl、SEQIDNO128的\CDRl或SEQIDNO129的\CDRl。12.5的分離的α-SNAP-25抗體，其中所述分離的α-SNAP-25抗體至少包含SEQIDNO108的VlCDR2、SEQIDNO:109的\CDR2、SEQIDNO:110的\CDR2、SEQIDNO111的VlCDR2或SEQIDNO:112的\CDR2。13.5的分離的α-SNAP-25抗體，其中所述分離的α-SNAP-25抗體至少包含SEQIDNO113的VlCDR3、SEQIDNO:114的VlCDR3、SEQIDNO:115的VlCDR3、SEQIDNO116的\CDR3或SEQIDNO:117的\CDR3。14.5的分離的α-SNAP-25抗體，其中所述分離的α-SNAP-25抗體包含包括SEQIDNO93,SEQIDN0:121禾口SEQIDNO100的重鏈可變區(qū)；以及包括SEQIDNO:105、SEQIDNO110和SEQIDNO:115的輕鏈可變區(qū)。15.5的分離的α-SNAP-25抗體，其中所述分離的α-SNAP-25抗體可選擇性地結(jié)合于SEQIDNO32,SEQIDNO33,SEQIDNO34,SEQIDNO35,SEQIDNO36,SEQIDNO37,SEQIDNO:147或SEQIDNO:148的SNAP-25表位。16.5的分離的α-SNAP-25抗體，其中所述分離的α-SNAP-25抗體可選擇性地結(jié)合SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO43或SEQIDNO44的SNAP-25表位。17.一種檢測(cè)BoNT/A活性的方法，所述方法包括步驟a)用包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的；b)從所處理的細(xì)胞中分離這樣的SNAP-25組分，即該SNAP-25組分包含在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產(chǎn)物；c)將所述SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體相接觸，其中所述α-SNAP-25抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；以及d)檢測(cè)包含所述α-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況；其中所述抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)結(jié)果指示BoNT/A的活性。18.一種檢測(cè)BoNT/A活性的方法，所述方法包括步驟a)用包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的；b)從所處理的細(xì)胞中分離這樣的SNAP-25組分，即該SNAP-25組分包含在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產(chǎn)物；c)將所述SNAP-25組分與連接于固相支持物的α-SNAP-25抗體相接觸，其中所述α-SNAP-25抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；以及d)檢測(cè)包含所述α-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況；其中所述抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)結(jié)果指示BoNT/A的活性。19.一種檢測(cè)BoNT/A活性方法，所述方法包括步驟a)用包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的；b)從所處理的細(xì)胞中分離這樣的SNAP-25組分，即該SNAP-25組分包含在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產(chǎn)物；c)將所述SNAP-25組分固定于固相支持物；d)將所述SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體相接觸，其中所述α-SNAP-25抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；以及e)檢測(cè)包含所述α-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況；其中所述抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)結(jié)果指示BoNT/A的活性。20.一種檢測(cè)BoNT/A活性方法，所述方法包括步驟a)用包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞可以攝取BoNT/A；b)從所處理的細(xì)胞中分離這樣的SNAP-25組分，即該SNAP-25組分包含在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產(chǎn)物；c)將所述SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體相接觸，其中所述α-SNAP-25抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；以及d)檢測(cè)包含所述α-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況；其中所述抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)結(jié)果指示BoNT/A的活性。21.一種檢測(cè)BoNT/A活性方法，所述方法包括步驟a)用包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞可以攝取BoNT/A；b)從所處理的細(xì)胞中分離這樣的SNAP-25組分，即該SNAP-25組分包含在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產(chǎn)物；c)將所述SNAP-25組分與連接于固相支持物的α-SNAP-25抗體相接觸，其中所述α-SNAP-25抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；以及d)檢測(cè)包含所述α-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況；其中所述抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)結(jié)果指示BoNT/A的活性。22.一種檢測(cè)BoNT/A活性方法，所述方法包括步驟a)用包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞可以攝取BoNT/A；b)從所處理的細(xì)胞中分離這樣的SNAP-25組分，即該SNAP-25組分包含在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產(chǎn)物；c)將所述SNAP-25組分固定于固相支持物；d)將所述SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體相接觸，其中所述α-SNAP-25抗體可結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；以及e)檢測(cè)包含所述α-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況；其中所述抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)結(jié)果指示BoNT/A的活性。23.一種測(cè)定哺乳動(dòng)物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步驟a)將BoNT/A添加至從被測(cè)試α-BoNT/A中和抗體是否存在的哺乳動(dòng)物中獲得的試驗(yàn)樣品中；b)用所述試驗(yàn)樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)BoNT/A中毒是敏感的；c)從所述處理的細(xì)胞中分離包含在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產(chǎn)物的SNAP-25組分；d)將所述SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體相接觸，其中所述α-SNAP-25抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；e)檢測(cè)包含所述α-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況；f)以陰性對(duì)照樣品代替試驗(yàn)樣品重復(fù)步驟b-e，所述陰性對(duì)照樣品包含BoNT/A和已知不含α-BoNT/A中和抗體的血清；以及g)將步驟e中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量與步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量對(duì)比，其中與步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量相比，步驟e中檢測(cè)到較低量的抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)結(jié)果指示α-ΒοΝΤ/Α中和抗體的存在。24.一種測(cè)定哺乳動(dòng)物中的ΒοΝΤ/Α免疫抗性的方法，包括步驟a)將ΒοΝΤ/Α添加至從被測(cè)試α-ΒοΝΤ/Α中和抗體是否存在的哺乳動(dòng)物中獲得的試驗(yàn)樣品中；b)用所述試驗(yàn)樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)ΒοΝΤ/Α中毒是敏感的；c)從所述處理的細(xì)胞中分離包含在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產(chǎn)物的SNAP-25組分；d)將所述SNAP-25組分與連接于固相支持物的α-SNAP-25抗體相接觸，其中所述α-SNAP-25抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；e)檢測(cè)包含所述α-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況；f)以陰性對(duì)照樣品代替試驗(yàn)樣品重復(fù)步驟b-e，所述陰性樣品對(duì)照包含ΒοΝΤ/Α和已知不含α-ΒοΝΤ/Α中和抗體的血清；以及g)將步驟e中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量與步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量對(duì)比，其中與步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量相比，步驟e中檢測(cè)到較低量的抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)結(jié)果指示α"ΒοΝΤ/Α中和抗體的存在。25.一種檢測(cè)哺乳動(dòng)物中的ΒοΝΤ/Α免疫抗性的方法，包括步驟a)將ΒοΝΤ/Α添加至從被測(cè)試α-ΒοΝΤ/Α中和抗體是否存在的哺乳動(dòng)物中獲得的試驗(yàn)樣品中；b)用所述試驗(yàn)樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)ΒοΝΤ/Α中毒是敏感的；c)從所述處理的細(xì)胞中分離包含在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產(chǎn)物的SNAP-25組分；d)將所述SNAP-25組分固定于固相支持物；e)將所述SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體相接觸，其中所述α-SNAP-25抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；f)檢測(cè)包含所述α-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況；g)以陰性對(duì)照樣品代替試驗(yàn)樣品重復(fù)步驟b-f，所述陰性對(duì)照樣品包含ΒοΝΤ/Α和已知不含α-BoNT/A中和抗體的血清；以及h)將步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量與步驟g中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量對(duì)比，其中與步驟g中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量相比，步驟f中檢測(cè)到較低量的抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)結(jié)果指示α"ΒοΝΤ/Α中和抗體的存在。26.一種測(cè)定哺乳動(dòng)物中的ΒοΝΤ/Α免疫抗性的方法，包括步驟a)將ΒοΝΤ/Α添加至從被測(cè)試α-ΒοΝΤ/Α中和抗體是否存在的哺乳動(dòng)物中獲得的試驗(yàn)樣品中；b)用所述試驗(yàn)樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞可以攝取ΒοΝΤ/??；c)從所述處理的細(xì)胞中分離包含在所述ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產(chǎn)物的SNAP-25組分；d)將所述SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體相接觸，其中所述α-SNAP-25抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的ΒοΝΤ/Α剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；e)檢測(cè)包含所述α-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況；f)以陰性對(duì)照樣品代替試驗(yàn)樣品重復(fù)步驟b-e，所述陰性對(duì)照樣品包含ΒοΝΤ/Α和已知不含α-ΒοΝΤ/Α中和抗體的血清；以及g)將步驟e中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量與步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量對(duì)比，其中與步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量相比，步驟e中檢測(cè)到較低量的抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)結(jié)果指示α"ΒοΝΤ/Α中和抗體的存在。5027.一種檢測(cè)哺乳動(dòng)物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步驟a)將BoNT/A添加至從被測(cè)試α-BoNT/A中和抗體是否存在的哺乳動(dòng)物中獲得的試驗(yàn)樣品中；b)用所述試驗(yàn)樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞可以攝取BoNT/A；c)從所述處理的細(xì)胞中分離包含在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產(chǎn)物的SNAP-25組分；d)將所述SNAP-25組分與連接于固相支持物的α-SNAP-25抗體相接觸，其中所述α-SNAP-25抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；e)檢測(cè)包含所述α-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況；f)以陰性對(duì)照樣品代替試驗(yàn)樣品重復(fù)步驟b-e，所述陰性對(duì)照樣品包含BoNT/A和已知不含α-BoNT/A中和抗體的血清；以及g)將步驟e中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量與步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量對(duì)比，其中與步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量相比，步驟e中檢測(cè)到較低量的抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)結(jié)果指示α"BoNT/A中和抗體的存在。28.一種檢測(cè)哺乳動(dòng)物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步驟a)將BoNT/A添加至從被測(cè)試α-BoNT/A中和抗體是否存在的哺乳動(dòng)物中獲得的試驗(yàn)樣品中；b)用所述試驗(yàn)樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞可以攝取BoNT/A；c)從所述處理的細(xì)胞中分離包含在所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的SNAP-25剪切產(chǎn)物的SNAP-25組分；d)將所述SNAP-25組分固定于固相支持物；e)將所述SNAP-25組分與α-SNAP-25抗體相接觸，其中所述α-SNAP-25抗體可以結(jié)合在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處含有羧基端的表位；f)檢測(cè)包含所述α-SNAP-25抗體和所述SNAP-25剪切產(chǎn)物的抗體-抗原復(fù)合體的存在情況；g)以陰性對(duì)照樣品代替試驗(yàn)樣品重復(fù)步驟b-f，所述陰性對(duì)照樣品包含BoNT/A和已知不含α-BoNT/A中和抗體的血清；以及h)將步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量與步驟g中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量對(duì)比，其中與步驟g中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量相比，步驟f中檢測(cè)到較低量的抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)結(jié)果指示α"BoNT/A中和抗體的存在。29.17-22和23_25的方法，其中所述細(xì)胞對(duì)于由約500ρΜ或更少、約400ρΜ或更少、約300ρΜ或更少、約200ρΜ或更少、約IOOpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。30.20-22和沈_觀的方法，其中所述細(xì)胞可以攝取約500ρΜ或更少、約400ρΜ或更少、約300ρΜ或更少、約200ρΜ或更少、約IOOpM或更少的BoNT/A。31.17-22的方法，其中所述樣品包含約IOOng或更少、約IOng或更少、約Ing或更少、IOOfg或更少、IOfg或更少或者Ifg或更少的BoNT/A。32.17-22的方法，其中所述樣品包含約IOOnM或更少、約IOnM或更少、約InM或更少、約IOOpM或更少、約IOpM或更少、約IpM或更少、約IOOfM或更少、約IOfM或更少或者約IfM或更少的BoNT/A。33.17-28的方法，其中所述α-SNAP-25抗體是5_16的分離的α-SNAP-25抗體。34.17-28的方法，其中抗體-抗原復(fù)合體的存在情況通過免疫印跡分析、免疫沉淀分析、ELISA或夾心ELISA檢測(cè)。35.17-的方法，其中所述基于免疫的方法具有至少31、至少51、至少101、至少201、至少501或至少1001的信噪比下限。5136.17-的方法，其中所述基于免疫的方法具有至少101、至少201、至少501、至少1001、至少2001、至少3001、至少4001、至少5001或至少6001的信噪比上限。37.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法可以檢測(cè)例如至少lOOng、至少50ng、至少10ng、至少5ng、至少lOOpg、至少50pg、至少10pg、至少5pg、至少100fg、至少50fg、至少IOfg或至少5fg的EC50活性。38.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法可以檢測(cè)例如至少ΙΟηΜ、至少5nM、至少100pM、至少50pM、至少10pM、至少5pM、至少100fM、至少50fM、至少10fM、至少5fM或至少IfM的EC50活性。39.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有例如IOpg或更少、9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、Ipg或更少的BoNT/A的LOD。40.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有例如IOOfM或更少、90fM或更少、80fM或更少、70fM或更少、60fM或更少、50fM或更少、40fM或更少、30fM或更少、20fM或更少或者IOfM或更少的BoNT/A的LOD。41.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有例如IOpg或更少、9pg或更少、8pg或更少、7pg或更少、6pg或更少、5pg或更少、4pg或更少、3pg或更少、2pg或更少、Ipg或更少的BoNT/A的LOQ。42.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法具有例如IOOfM或更少、90fM或更少、80fM或更少、70fM或更少、60fM或更少、50fM或更少、40fM或更少、30fM或更少、20fM或更少或者IOfM或更少的BoNT/A的L0Q。43.17-28的方法，其中所述基于免疫的方法可以將完全活性BoNT/A與具有部分活性BoNT/A區(qū)分開所述部分活性為完全活性BoNT/A的活性的70%或更少、60%或更少、50%或更少、40%或更少、30%或更少、20%或更少或者10%或更少。實(shí)施例實(shí)施例I候選細(xì)胞系的篩查下述實(shí)施例描述了如何鑒定對(duì)本說明書中公開的檢測(cè)BoNT/A活性的方法所必需的對(duì)BoNT/A中毒敏感的或者具有BoNT/A攝取能力的已建立細(xì)胞系。1.候選細(xì)胞系的原種培養(yǎng)物的生長(zhǎng)為了培養(yǎng)所述細(xì)胞系，將合適密度的來自要測(cè)試細(xì)胞系的細(xì)胞鋪板于含有30mL合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(見表1)的162cm2組織培養(yǎng)瓶中，并且在37°C的培養(yǎng)箱中于5%或10%二氧化碳下孵育，直至細(xì)胞達(dá)到所需的密度。權(quán)利要求1.一種組合物，包含載體、柔性連接體和SNAP-25抗原，其中所述柔性連接體包含至少3個(gè)氨基酸，并且所述SNAP-25抗原包括SEQIDNO:148。2.權(quán)利要求2的組合物，其中所述柔性連接體和所述SNAP-25抗原氨基酸序列是SEQIDNO:38。3.一種分離的α-SNAP-25抗體，其中所述分離的α-SNAP-25抗體結(jié)合含有SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的表位；其中所述α-SNAP-25抗體對(duì)不含SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的表位具有小于IXlO1M4iT1的締合速率常數(shù)；并且，其中所述α-SNAP-25抗體對(duì)所述表位具有小于0.450nM的平衡解離常數(shù)。4.權(quán)利要求3的分離的α-SNAP-25抗體，其中所述表位是SEQIDNO32。5.一種分離的α-SNAP-25抗體，包含a.包括SEQIDNO72,SEQIDNO74、SEQIDNO76,SEQIDNO80或SEQIDNO82的重鏈可變區(qū)；以及b.包括SEQIDNO84,SEQIDNO86,SEQIDNO88,SEQIDNO90或SEQIDNO92的輕鏈可變區(qū)。6.一種分離的α-SNAP-25抗體，包含a.包括SEQIDNO:93、SEQIDNO:121或SEQIDNO:100的重鏈可變區(qū)；以及b.包括SEQIDNO:105、SEQIDNO:110或SEQIDNO:115的輕鏈可變區(qū)。7.一種分離的α-SNAP-25抗體，包含至少SEQIDNO100的VHCDR3、SEQIDNO:101的VhCDR3或SEQIDNO:102的VhCDR3。8.一種檢測(cè)BoNT/A活性的方法，所述方法包括步驟a.以包含BoNT/A的樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)由約500pM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的；b.從所處理的細(xì)胞分離包含SNAP-25剪切產(chǎn)物的SNAP-25組分，所述SNAP-25剪切產(chǎn)物具有所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺；c.將所述SNAP-25組分與連接于固相支持物的α-SNAP-25抗體相接觸，其中所述α-SNAP-25抗體結(jié)合含有SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的表位，所述α-SNAP-25抗體對(duì)不含SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25的表位具有小于1XIO1M-1S-1的締合速率常數(shù)，并且所述α-SNAP-25抗體對(duì)所述表位具有小于0.450nM的平衡解離常數(shù)；d.檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合體的存在情況，所述抗體-抗原復(fù)合體包含所述α-SNAP-25抗體和具有所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25剪切產(chǎn)物，其中通過所述抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)結(jié)果指示BoNT/A活性。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述SNAP-25剪切產(chǎn)物是SNAP_25197。10.權(quán)利要求8的方法，使用夾心ELISA檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合體的存在情況。11.權(quán)利要求8的方法，其中所述方法具有至少31的信噪比下限，和至少101的信噪比上限。12.權(quán)利要求8的方法，其中所述樣品包含至多IOOpM的BoNT/A。13.權(quán)利要求8的方法，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)由約IOOpM或更少的BoNT/A引起的BoNT/A中毒是敏感的。14.權(quán)利要求8的方法，其中所述方法以單路方式或多路方式進(jìn)行。15.一種測(cè)定哺乳動(dòng)物中的BoNT/A免疫抗性的方法，包括步驟a.將BoNT/A添加至從被測(cè)試α-BoNT/A中和抗體是否存在的哺乳動(dòng)物獲得的試驗(yàn)樣品中；b.以所述試驗(yàn)樣品處理來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞，其中所述來自已建立細(xì)胞系的細(xì)胞對(duì)BoNT/A中毒是敏感的；c.從所述處理的細(xì)胞分離包含具有BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25剪切產(chǎn)物的SNAP-25組分；d.將所述SNAP-25組分與連接于固相支持物的α-SNAP-25抗體相接觸，其中所述α-SNAP-25抗體；其中所述α-SNAP-25抗體結(jié)合包含SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的表位，所述α-SNAP-25抗體對(duì)不含SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25的表位具有小于1XIO1M-1S-1的締合速率常數(shù)，并且所述α-SNAP-25抗體對(duì)所述表位具有小于0.450nM的平衡解離常數(shù)；e.檢測(cè)抗體-抗原復(fù)合體的存在情況，所述抗體-抗原復(fù)合體包含所述α-SNAP-25抗體和具有所述BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的羧基端谷氨酰胺的SNAP-25剪切產(chǎn)物；f.以陰性對(duì)照樣品代替試驗(yàn)樣品重復(fù)步驟b-e，所述陰性對(duì)照樣品包含BoNT/A和已知不含α-BoNT/A中和抗體的血清；并且g.將步驟e中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量與步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量對(duì)比，其中與步驟f中檢測(cè)到的抗體-抗原復(fù)合體的量相比，步驟e中檢測(cè)到較低量的抗體-抗原復(fù)合體的檢測(cè)結(jié)果指示α"BoNT/A中和抗體的存在。全文摘要本說明書公開了SNAP-25組合物；制備α-SNAP-25抗體的方法，該抗體結(jié)合含有在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處的羧基端的表位；α-SNAP-25抗體——該抗體結(jié)合含有在SNAP-25剪切產(chǎn)物的BoNT/A剪切位點(diǎn)易切斷鍵的P1殘基處的羧基端的表位；檢測(cè)BoNT/A活性的方法；以及檢測(cè)中和α-BoNT/A抗體的方法。文檔編號(hào)G01N33/569GK102356091SQ200980117157公開日2012年2月15日申請(qǐng)日期2009年3月13日優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日發(fā)明者D·D·霍奇斯,E·費(fèi)爾南德斯-薩拉斯,J·王,K·R·奧基,L·S·黃,P·E·加里申請(qǐng)人:阿勒根公司